用于检测肥厚型心肌病致病基因突变的基因标志物及其应用

摘要

本发明公开了用于检测肥厚型心肌病致病基因突变的基因标志物及其应用，该基因标志物选自以下基因形成的组：MYBPC3、MYH7、TNNI3、TNNT2、ALPK3、TPM1、OBSCN和TTN，特别是该基因标志物为MYBPC3和/或MYH7，其作为生物标志物用于制备早期诊断肥厚型心肌病的药物以及检测该基因标志物的试剂用于制备检测肥厚型心肌病致病基因突变的药物。本发明通过对所有已知的肥厚型心肌病致病基因进行全外显子组测序，对肥厚型心肌病表型和基因型之间的关系进行精确评估确定敏感的预测参数，提高临床基因测试的效率，增加基因检测的阳性率，具有较高的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于检测肥厚型心肌病致病基因突变的基因标志物及其应用。

背景技术

肥厚型心肌病(HCM)的特点是左心室肥大，不能用异常压力或全身性疾病来解释，临床症状从无症状到心脏猝死不等，即使没有明显症状的人也可能会增加心血管并发症的风险。早期识别和干预至关重要，因为肥厚型心肌病影响0.2％至0.5％的普通人群，其中30％至60％的患者有致病或可能致病的基因变体。目前有相当一部分肥厚型心肌病患者缺乏证据证明其疾病的遗传病因，这主要是由于基因型和表型之间的关系不确定，因此很难准确定义新的变体或意义不确定的变体的致病性。

众多研究人员致力于通过建立基因型和表型之间的相关性来提高肥厚型心肌病遗传诊断的准确性和有效性。然而，这些研究的结果并不一致，部分原因是基因筛查主要针对数量有限的基因，不包括最近与肥厚型心肌病相关的几个基因。此外，肥厚型心肌病的表型异质性使其在影像学上准确量化相关的表型成为挑战。以往的研究主要集中在描述疾病的形态，而这是一个非常主观和复杂的测量特征。研究者之间的差异，加上年龄和高血压的影响，导致表型定义的显著变化，使得基因型和表型之间难以建立一种强有力的关系。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的主要目的在于提供一种用于检测肥厚型心肌病致病基因突变的基因标志物，通过对家族性肥厚型心肌病患者的致病基因进行全外显子组测序，涵盖所有已知的肥厚型心肌病致病基因，对肥厚型心肌病表型和基因型之间的关系进行精确评估得到。

本发明的另一目的在于提供前述用于检测肥厚型心肌病致病基因突变的基因标志物的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供一种用于检测肥厚型心肌病致病基因突变的基因标志物，其选自以下基因形成的组：MYBPC3、MYH7、TNNI3、TNNT2、ALPK3、TPM1、OBSCN和TTN。

本发明的第二方面提供检测所述基因标志物的试剂在制备检测肥厚型心肌病致病基因突变的药物中的应用。

作为优选，所述基因标志物为MYBPC3和/或MYH7。

作为优选，所述药物包含检测所述基因标志物表达量的试剂，且以其作为唯一活性成分。

本发明的第三方面提供一种检测肥厚型心肌病致病基因突变的试剂盒，其包括检测所述基因标志物表达量的试剂，且以所述试剂作为唯一活性成分。

本发明的第四方面提供所述基因标志物作为生物标志物在制备早期诊断肥厚型心肌病的药物中的应用。

作为优选，所述生物标志物为MYBPC3和/或MYH7。

作为优选，所述药物包含检测所述生物标志物表达量的试剂。

本发明的第五方面提供一种用于早期诊断肥厚型心肌病的试剂盒，其包括检测所述生物标志物表达量的试剂，且以所述试剂作为唯一活性成分。

作为优选，检测样本为外周血。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

①本发明提出一种检测肥厚型心肌病致病基因突变的基因标志物，通过对家族性肥厚型心肌病患者的致病基因进行全外显子组测序，涵盖所有已知的肥厚型心肌病致病基因，结合超声心动图对左心室肥大的程度进行分段量化，使心肌肥大的特征更加精确，对肥厚型心肌病心超表型和基因型之间的关系进行精确评估得到，确定敏感的预测参数，提高临床基因测试的效率。此外，这种方法改善对新的突变或意义不确定的变体的解释。

②本发明通过检测基因标志物的表达水平用于早期诊断肥厚型心肌病，在诊断过程中基因结合超声心动图可以为临床医生和家属提供更多的信息，有助于基因测试和咨询，基因测试阳性的概率更高。

③本发明结合基因型及心超表型之间的关系，充分发挥超声心动图无创价廉的优点，增加基因检测的阳性率。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

图1是实施例中肥厚型心肌病致病基因筛查结果；其中，a1、a2：阳性；b1、b2：阴性。

图2是实施例中肥厚型心肌病患者的室壁厚度积分及最大室壁厚度(MLVWT)的分布情况；其中，浅灰色：基因阴性；深灰色：基因阳性。

图3是实施例中不同基因的16节段肥厚热图，代表基因型与肥厚型心肌病肥厚节段表型之间的关系；其中，a：突变；b：复合突变；c：截短突变。

图4是实施例中不同类型的基因突变对患者左室射血分数(LVEF)的测试结果。

图5是实施例中两种基因突变MYH7、MYBPC3对患者是否梗阻及心室收缩功能测试结果。

图6是实施例中基因型与心超表型预测肥厚型心肌病致病基因突变的受试者工作特征曲线(ROC)；其中：

Model 1：年龄，主动脉根部内径，室间隔与后壁的比率，中间隔前壁；

Model 2：年龄，室间隔与后壁的比率，S8，S1，S7，S9，MLVWT；

Model 3：年龄，主动脉根部内径，室间隔与后壁的比率，S8，S1，S7，S9，MLVWT。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

以下临床研究纳入400名在复旦大学附属中山医院就医的确诊为HCM的汉族患者，有经验的心脏病专家根据临床检查、心电图和超声心动图发现的左心室肥大≥15毫米以及没有其他导致肥大的因素来确定诊断。在HCM的家族性病例中，或结合基因检测结果呈阳性的情况下，较少程度的肥厚也可满足诊断标准。研究方案需要收集家庭成员的大量临床数据，包括发病年龄、初始症状、心电图和超声心动图，并经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(编号：B2016-016(2)R)，所有参与者都提供书面知情同意书，并捐献5毫升外周血用于DNA提取和基因测序。

超声心动图研究使用Vivid E9(GE医疗)或iE33飞利浦医疗系统)超声系统进行。所有研究都是在左侧卧位下进行的，通过二维、M型、频谱多普勒和组织多普勒图像，进行标准化的临床功能评估。二维动态图像从左心室心尖四腔视图、两腔视图、三腔视图、左心室短轴瓣环、乳头肌以及心尖区的水平切面获得。在二维短轴图像中，左心室壁被分为16段，二尖瓣水平又被分为6段：基底前部(1段，S1)，基底前隔(2段，S2)，基底后隔(3段，S3)，基底下部(4段，S4)，基底内侧(5段，S5)，基底前外侧(6段，S6)。乳头肌水平分为6段：前中段(第7段，S7)，前中段(第8段，S8)，前中段(第9段，S9)，中下段(第10段，S10)，中内侧(第11段，S11)，中前侧(第12段，S12)。心尖分为4段：心尖前部(13段，S13)，心尖间隔(14段，S14)，心尖下部(15段，S15)，心尖外侧(16段，S16)，这个过程的目的是获得关于心脏解剖和功能的准确和详细的信息，每个节段的厚度被分别评估，如果超过12毫米，则被认为是肥大，得到1分；如果不是，则0分。

采用全外显子组测序法对HCM家族的探查者的致病基因进行筛选，使用样品核酸提取、超声波破坏和TruSeq DNA样品制备试剂盒对每个读数的两端进行测序，使用BGISEQ-500或Illumina HiSeq 2000平台对捕获的文库进行独立测序，每个样本都被设计为获得高质量的碱基，平均覆盖率>100倍，外显子丢失率<0.2％。基因组测序原始数据与加州大学圣克鲁兹分校(UCSC)的hg19参考基因组(bwamem/discovardenovo/freebayes)进行比较；内部队列、dbSNP138和1000G_OMNI2。5注释携带率，使用snpEff和内部深度神经网络分析过程注释功能；剪切位点预测，使用内部C

所有的统计分析都是用SPSS 24.0版软件(SPSS，Chicago，IL)进行。分类变量以数字(百分比)表示，连续变量以平均值±SD表示。Pearsonχ2检验或Fisher精确检验用于比较分类变量；独立样本t检验用于连续变量的比较；皮尔逊相关分析用于相关性分析；生成ROC曲线，并计算曲线下面积(AUC)和95％置信区间；用Firth惩罚最大似然模型进行Cox回归，计算危险比(HR)和95％CI，估计候选变体对终点的影响；P值为2侧，当<0.05时被认为是显著的。

通过研究发现在HCM基因检测呈阳性的子集中，大多数变异是在MYBPC3(n＝85；32.2％)和MYH7(n＝52；19.7％)，另外在TNNI3(n＝16)、TNNT2(n＝12)、ALPK3(n＝10)、TPM1(n＝10)、OBSCN(n＝9)和TTN(n＝9)发现变异。然而，MYBPC3的基因改变类型显示出最大的差异性，MYPBC3中只有30.59％的变体是错义变体。其余的MYBPC3变异类型是框架移位突变或导致过早停止密码子和框内插入或删除的突变，或影响剪接的突变(n＝59；69.41％)。

肥厚型心肌病致病基因筛查结果如图1所示，表明阳性的患者发病年龄(age)更小，同时其MLVWT更大；所有肥厚型心肌病患者的室壁厚度积分及MLVWT的分布情况如图2所示，其中浅灰色代表基因阴性，深灰色代表基因阳性。当比较基因型阳性与基因型阴性患者的临床表型时，基因型阳性患者表现出的表型比仍然是基因模糊的患者更严重。基因型阳性患者表现出更严重的表型，而那些在基因上难以捉摸的患者，总的来说，基因型阳性患者在诊断时更年轻(44.27±15.58岁vs.50.8±14.01岁)，有更多的左心室肥大(20.34±5.64vs.19.17±4.88)，更可能有右心室肥大(这些节段(基底前部、基底前外侧、中部前部、中部前外侧、中部内侧和中部前外侧)肥大的患者更可能出现基因型阳性，出现影响左心室前壁、前间隔和前侧壁的心肌肥厚的个体更容易出现检测阳性。

对所有被诊断为HCM患者的节段性肥厚进行详细的分析量化，随后生成一个如图3所示的热图，直观地显示关键基因在各节段肥大的发生率。

如图4所示，通过对比不同类型的基因突变发现只有截短突变的患者LVEF较阴性患者降低，其余两组没有差异，那些携带MYH7和MYBPC3基因突变的患者更容易出现前壁、室间隔和左心室侧壁心肌厚度增加的情况。相反，ALPK3倾向于主要表现在心尖区。与以前的观察相似，与单一突变的患者相比，>1个突变和截断突变的患者在诊断时明显年轻，而且更容易出现心肌肥厚，影响左室前壁、前室间隔和前侧壁。与非截断突变患者相比，截断突变患者的LVEF较低，肥厚程度较高。

如图5所示，通过对最常见的两种基因突变MYH7、MYBPC3进行比较之后发现，是否梗阻及心室收缩功能在两组之间有明显的差异，可以作为两者的鉴别点。在这个队列中，两个最常见的HCM相关基因——MYBPC3(n＝85)和MYH7(n＝52)中携带变异的患者之间没有发现明显的结构表型差异，使得他们在表型上无法区分。然而，与那些携带MYH7突变的人相比，MYBPC3突变的人的LVEF较低(60.71±10.19vs.63.94±6.47)。此外，MYH7突变者的左心室流出道梗阻发生率更高(23.53％vs.48.08％)。

通过多变量回归分析确定基因检测阳性的积极和消极预测因素，如图6所示，其中Model1：年龄，主动脉根部内径，室间隔与后壁的比率，中间隔前壁；Model 2：年龄，室间隔与后壁的比率，S8，S1，S7，S9，MLVWT；Model 3：年龄，主动脉根部内径，室间隔与后壁的比率，S8，S1，S7，S9，MLVWT。结果表明，与单变量分析的结果相同，多变量模型显示有4个参数是基因检测阳性的独立预测因素：诊断时的年龄、主动脉窦的尺寸、室间隔与后壁的比率和中间隔前壁；中部前壁被证明是基因测试阳性的最强预测因素(OR 2.182，95％ CI 1.216-3.916)。此外，通过进行多变量回归分析确定MYBPC3和MYH7基因检测阳性的预测因素，显示有2个阳性参数是MYBPC3突变的独立预测因素：鼻中隔与后壁的比例和鼻中隔。中部前壁被证明是最强的预测因素(OR 4.105，95％ CI 1.421-11.862)，多变量模型显示有3个阳性参数是MYH7突变的独立预测因素，TAPSE(三尖瓣环面收缩期偏移)、室间隔与后壁的比率和左室流出道梗阻，左室流出道梗阻被证明是最强的预测因素(OR2.47，95％ CI 1.339-4.559)。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。