一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法及其应用，属于医学检测技术领域，主要包括以下步骤：S1、提取外周血单个核细胞；S2、对外周血单个核细胞进行分选，分别得到不同亚群分型的淋巴细胞；S3、将得到的不同亚群分型的淋巴细胞分别用培养基重悬后，均匀铺布于细胞培养孔板中，采用IL‑2分别进行刺激，收集增殖后的不同亚群分型的淋巴细胞；S4、分别提取不同亚群分型的淋巴细胞的DNA，并测定EB病毒DNA的含量，确定EB病毒感染的淋巴细胞亚群。本发明提供的方法能够提高不同亚群分型的淋巴细胞中EB病毒DNA的含量的检测灵敏度，从而提高了鉴别EB病毒感染的淋巴细胞亚群的灵敏度。

说明书

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法及其应用。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)属人类疱疹病毒科，属于疱疹病毒家族的成员，是一种线状DNA病毒，是第一个被证明与人类肿瘤发生相关的病毒，在人类中特别普遍，是引起呼吸道感染的一种常见病毒，全世界95％以上的成年人都能检测到它的特异性血清抗体，并且EB病毒感染终生持续存在，大多数人的慢性感染无症状。

检测EBV活动性感染淋巴细胞对于EB病毒的诊断、治疗以及细胞治疗靶点筛选具有十分重要的意义。然而，现有技术对淋巴细胞中EBV的DNA进行检测虽然能够区分EBV感染的细胞亚群，但是如果患者淋巴细胞数量较少，则提取出的核酸的量不能满足对EBV的DNA进行检测的标准，即检测灵敏度受限于患者淋巴细胞数量。

发明内容

为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法，能够使得检测不受限于患者淋巴细胞数量，从而提高鉴别EB病毒感染的淋巴细胞亚群的灵敏度。

本发明的目的之二在于提供一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法在确定EBV感染性疾病的治疗靶点中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法在指导制备治疗EBV感染的药物中的应用。

为了实现上述目的之一，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法，包括以下步骤：

S1、提取外周血单个核细胞；

S2、对所述外周血单个核细胞进行分选，分别得到不同亚群分型的淋巴细胞；

S3、将S2得到的不同亚群分型的淋巴细胞分别用培养基重悬后，均匀铺布于细胞培养孔板中，采用IL-2分别对铺布于细胞培养孔板的不同亚群分型的淋巴细胞进行刺激，使所述淋巴细胞进行增殖，所述IL-2的终浓度为2.9×10

S4、分别提取S3中增殖后的不同亚群分型的淋巴细胞的DNA，并应用实时荧光定量PCR技术测定所述增殖后的不同亚群分型的淋巴细胞中EB病毒DNA的含量。

进一步地，所述S2中，所述基于流式细胞仪的分选的过程中，在所述外周血单个核细胞中加入荧光标记的anti-CD3抗体、荧光标记的anti-CD19抗体和荧光标记的anti-CD56抗体，然后进行避光孵育。

进一步地，所述荧光标记的anti-CD3抗体为anti-CD3-FITC，所述荧光标记的anti-CD19抗体为anti-CD19-PE，所述荧光标记的anti-CD56抗体为anti-CD56-ECD。

进一步地，所述S2中，所述基于流式细胞仪的分选的过程中，在所述外周血单个核细胞中加入荧光标记的anti-CD3抗体、荧光标记的anti-CD19抗体、荧光标记的anti-CD56抗体和荧光标记的anti-CD45抗体，然后进行避光孵育。

进一步地，所述荧光标记的anti-CD45抗体为anti-CD45-PC7。

进一步地，所述S2中，所述不同亚群分型的淋巴细胞包括CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞和CD56+NK淋巴细胞。

进一步地，所述S2中，对所述外周血单个核细胞进行分选包括基于磁珠的分选和/或基于流式细胞仪的分选。

进一步地，所述S2中，避光孵育的时间为5～15h。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

(1)现有技术通过EBV-DNA的检测并不能区分EBV感染的细胞亚群，本发明提供的一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法，利用流式细胞仪即能够快速便捷地分选出不同亚群分型的淋巴细胞，并用IL-2体外刺激分选出的不同亚群分型的淋巴细胞4～6h，刺激淋巴细胞扩增，提高应用实时荧光定量PCR技术测定所述刺激后的不同亚群分型的淋巴细胞中EB病毒DNA的含量的灵敏度，从而提高鉴别EB病毒感染的淋巴细胞亚群的灵敏度。

(2)本发明提供的一种提高鉴别EBV感染的淋巴细胞亚群的灵敏度的方法能够帮助确定EBV感染性疾病的治疗靶点，及进一步指导制备治疗EBV感染的药物的开发。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1提供的通过前向角和侧向角参数圈选样本中全部有核细胞的示意图。

图2是实施例1提供的圈选出淋巴细胞常见表型CD45+SSC细胞的示意图。

图3是实施例1提供的圈选T细胞常见表型为CD3+CD56-的细胞群的示意图。

图4是实施例1提供的圈选B细胞常见表型为CD3-CD19+的细胞群的示意图。

图5是实施例1提供的圈选NK淋巴细胞常见表型为CD3-CD56+的细胞群的示意图。

图6是实施例1提供的利用流式分选仪对CD3+T淋巴细胞进行纯度检测的示意图。

图7是实施例1提供的利用流式分选仪对CD19+B淋巴细胞进行纯度检测的示意图。

图8是实施例1提供的利用流式分选仪对CD56+NK淋巴细胞分别进行纯度检测的示意图。

图9是EB病毒定量标准品的扩增曲线和标准曲线的示意图。

图10是实施例1使用IL-2刺激一例患者激分选后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞，然后分别进行EBV的DNA检测，得到的扩增曲线以及根据标准曲线计算的EBV DNA拷贝数的示意图。

图11是实施例1未使用IL-2刺激一例患者激分选后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞，然后分别进行EBV的DNA检测，得到的扩增曲线以及根据标准曲线计算的EBV DNA拷贝数的示意图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

实施例1

(1)采集临床病人外周血

招募临床上外周血中EBV DNA拷贝数≥10

(2)流式细胞术分选淋巴细胞

S1、裂解红细胞：取外周血1mL转移至15mL离心管中，并加入14mL质量百分数为8.3％氯化铵溶液，充分混匀，静置15min以上使红细胞充分裂解，待样本呈透明澄澈状，然后将样本在离心机转速为1000rpm，4℃下离心10min，使样本中的白细胞沉淀至离心管底部，离心后，将离心后样本的上层液体弃置，留存样本底部的白细胞沉淀，约100uL；

S2、淋巴细胞用荧光标记的抗体标记：往白细胞沉淀中分别加入10uL的anti-CD3-FITC抗体、10uL的anti-CD19-PE抗体、10uL的anti-CD56-ECD抗体以及5uL的anti-CD45-PC7抗体，避光孵育5～15min；

S3、利用流式细胞仪分选出不同亚群分型的淋巴细胞：使用Beckman CoulterMoFlo流式分选仪(Beckman，USA)对荧光标记的抗体标记的淋巴细胞样本进行检测和分选，具体步骤如下：

1、通过前向角和侧向角参数，将待测样本中全部有核细胞圈选，设置为有核细胞门，并去除样本中的细胞碎片，如附图1所示；

2、通过anti-CD45-PC7抗体标记和侧向角参数，从有核细胞门中圈选出淋巴细胞常见表型CD45+SSC细胞群，设置为淋巴细胞门以选定淋巴细胞，如附图2所示；

3、通过anti-CD3-FITC抗体标记与anti-CD56-ECD抗体标记从淋巴细胞门中圈选T细胞常见表型为CD3+CD56-的细胞群，设置为T细胞门以进行分选，如附图3所示；

4、通过anti-CD3-FITC抗体标记与anti-CD19-PE抗体标记从淋巴细胞门中圈选B细胞常见表型为CD3-CD19+的细胞群，设置为B细胞门以进行分选，如附图4所示；

5、通过anti-CD3-FITC抗体标记与anti-CD56-ECD抗体标记从淋巴细胞门中圈选NK淋巴细胞常见表型为CD3-CD56+的细胞群，设置为NK淋巴细胞门以进行分选，如附图5所示；

6、圈选T、B、NK淋巴细胞群并设置门后，于流式分选仪中设定分选逻辑，逻辑为单细胞-纯净模式(Purify)，即当液滴中包含着一个且仅有一个完全符合预设荧光标记的细胞时，该液滴将会被分选至收集容器中；

7、准备相应流式管并标记，在各流式管中加入100uL质量百分数为0.9％的生理盐水，随后调试流式分选仪分选液流，准备完成后按预设逻辑分选；

8、分选开始后，通过流式分选仪记录T、B、NK各细胞门的所获细胞数，当T、B、NK各细胞门的细胞数达到2×10

S4、利用流式细胞仪对分选得到的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞分别进行纯度检测：分选完成后，分别将分选得到的有CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞的液体在离心机转速为1000rpm，4℃下离心10min进行离心，细胞沉淀至底部后弃置上层液体；并吸取适量样本，通过Beckman Navios流式仪对分选得到的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞的纯度进行检测，当检测其纯度在85％以上时，则本次分选结果较为理想，将所获细胞用于进行后续实验，从附图6～8可以看出，分选得到的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞的纯度在95％以上，合格；

需要说明的是以上淋巴细胞分选方式还能够基于磁珠进行分选，由于技术比较成熟，在此不作阐述。

S5、分选完成后，使用IL-2刺激淋巴细胞细胞增殖：

1、将分选后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞使用1mL培养基分别进行重悬，将重悬后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞均匀铺布于24孔板中；

2、分别往24孔板中的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞的培养孔中加入IL-2，使细胞继续增殖，IL-2的终浓度为2.9×106～3.1×106U，刺激4～6h后，收集增殖后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞；

S6、实时荧光定量PCR检测CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞中EBV的DNA：

1、将增殖后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞的细胞悬液分别转移至1.5mL离心管中，离心机转速12000rpm室温下离心1min，离心后小心吸弃上清保留沉淀；

2、涡旋振荡混匀核酸提取液，吸取50uL核酸提取液分别加入含有细胞沉淀的1.5mL离心管中，涡旋振荡混匀打散沉淀，100℃保温10min；

3、将1.5mL离心管分别置于离心机上，在离心机转速12000rpm室温下离心2min；

4、离心后离心管上清分别为CD3+T淋巴细胞的DNA、CD19+B淋巴细胞的DNA、CD56+NK淋巴细胞的DNA，吸取上清分别进行PCR检测或于-20℃保存；

5、按以下体系配制PCR反应液：PCR缓冲液×9uL，Taq酶×3uL，EB病毒引物探针×8uL，每管20uL分装到PCR反应管中；

6、按照EB病毒定量标准品S1-S4(EB病毒质粒大肠杆菌，S1：5×10

7、PCR扩增程序：50℃反应2min，94℃保温5min，循环1次；94℃，10s，60℃，45s，循环5次；94℃，10s，60℃，45s，循环40次，于60℃采集FAM、ROX通道信号。

8、根据EB病毒定量标准品构建标准曲线，之后根据标准曲线分别计算待测样本中增殖后的CD3+T淋巴细胞中EBV DNA的检测灵敏度、CD19+B淋巴细胞中EBV DNA的检测灵敏度、CD56+NK淋巴细胞中EBV DNA的检测灵敏度，EB病毒定量标准品的扩增曲线和标准曲线如附图9所示；对一例EBV阳性患者的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞进行分选后用IL-2刺激后，分别进行EBV的DNA检测的扩增曲线以及根据标准曲线计算的EBV DNA拷贝数如附图10所示；对一例EBV阳性患者的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞后进行分选后未用IL-2刺激，分别进行EBV的DNA检测的扩增曲线以及根据标准曲线计算的EBV DNA拷贝数如附图11所示。

从图11可以看出，未使用IL-2刺激分选后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞，然后进行EBV的DNA检测，结果表明该例EBV阳性患者检测到了CD19+B淋巴细胞、CD3+T淋巴细胞中有EBV的DNA，而CD56+NK淋巴细胞未检测到EBV的DNA，CD19+B淋巴细胞中EBV DNA的Cp值为30.63，待测样本中，实时荧光定量PCR检测CD19+B淋巴细胞中EBVDNA的灵敏度为1.36×10

从图10可以看出，使用IL-2刺激分选后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞，能够使分选后的CD3+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、CD56+NK淋巴细胞继续增殖，然后分别进行EBV的DNA检测，结果表明该例EBV阳性患者只检测到CD19+B淋巴细胞、CD3+T淋巴细胞中有EBV的DNA，而CD56+NK淋巴细胞未检测到EBV的DNA，CD19+B淋巴细胞中EBVDNA的Cp值为29.51，使用IL-2刺激的待测样本中，实时荧光定量PCR检测CD19+B淋巴细胞中EBV DNA的灵敏度为1.32×10