用于检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因引物组合物及应用

摘要

本发明公开了一种同时检测反刍动物痘病毒的LAMP引物组合、试剂盒和检测方法。该发明属于生物技术领域。包括以下引物：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF和LB。该引物组合物可用于检测反刍动物痘病毒属病毒，能够一次且高效地检测待检样本中是否携带牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒。并且该引物组合具有特异性好、灵敏度高、用时短、稳定等特点。

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因的引物组合物及应用。

背景技术

山羊痘病毒(Goatpox Virus，GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox Virus，SPPV)、牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease Virus，LSDV)和鹿痘病毒(Deerpox virus)属于羊痘病毒属病毒(Capripoxvirus，CPV)，能分别引起山羊、绵羊、牛和鹿的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极大下降，造成巨大经济损失。

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)，又称牛结节疹、牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病。病原是痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科山羊痘病毒属的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)，该病的临床特征包括发热，皮肤、粘膜和内脏器官出现结节，机体消瘦，淋巴结肿大，皮肤水肿，部分病例会死亡。该病起产奶量下降，公牛暂时或永久性不育，损坏皮张，甚至因为继发感染而死亡，造成严重经济损失。

绵羊痘病毒引起绵羊痘，具有高度接触传染性，是家畜中最严重的一种痘病。其特征是在全身皮肤，特别是身体无毛部分出现典型的痘疮，有时也发生于粘膜。病羊发热，并有较高死亡率，经常引起严重的经济损失。绵羊痘发生于全世界许多地区，有些国家，例如英国、荷兰等消灭了羊痘。山羊痘病毒引起山羊痘，鹿痘病毒引起有时也使绵羊和鹿发病，症状与绵羊痘相似。

传统的上述病毒属检测方法主要是血清学检测、间接免疫荧光和蛋白印迹试验等)和病原学检测(PCR、实时荧光定量PCR和高分辨率熔曲线分析法等)。我国目前最常用检测方法为荧光定量PCR，该检测方法灵敏度和特异性较好，但操作复杂，仪器昂贵，难以在基层实际生产中普及应用。我们发明高通量检测上述四个病毒检测方法，检测效率更高，更便捷。

发明内容

本发明提供一种用于检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因的引物组合物及应用病原的引物组和物及其应用。具体通过以下技术方案实现：

所述用于检测检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因的引物组合物及应用的引物组合物，其特征在于，包括以下引物：

第一组

第二组

优选地，所述的组合物包括将F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的DNA分子。

本发明得目的之二在于，提供上述用以检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因的引物组合物得应用，用环介导等温扩增方法中用以扩增牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒。

优选地，所述的引物组合物在环介导等温扩增(LAMP)方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8：2-8。

优选地，所述的环介导等温扩增反应条件为60-65恒温60min。

优选地，在制备检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒试剂盒合基因芯片中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种用于牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒检测的试剂盒，包含上述的引物组合物。

优选地，所述的试剂盒和芯片的检测步骤包括：

1)提取待测病毒或其他类型待检样品中基因组DNA

2)以步骤1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物进行对检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因的环介导等温扩增。

本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因。

应用上述引物组合物可以对样品中基因DNA模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因的引物组合物及应用基因；如果不可以对样品中基因DNA模版特异性扩增，则待测样品中不含有检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因。

本发明提供的用于检测检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒和鹿痘病毒基因的引物组合物及应用基因的引物组合物，可便捷、快速、准确的检测出结果。对于实际应用而言，能够在1小时内获得检测结果。

附图说明

图1是第一组引物扩增检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒、鸡痘病毒、猴痘病毒、猪痘病毒、牛、山羊、绵羊和鹿基因组和空白对照典型荧光曲线；

图2是第二组引物检测扩增牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒、鸡痘病毒、猴痘病毒、猪痘病毒、牛、山羊、绵羊和鹿基因组和空白对照荧光曲线；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法；

下列实施中所用的试验材料，如无特殊说明，均为本领域常用的实验材料；

实施例1

利用牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒、鸡痘、猴痘、猪痘、牛、山羊、绵羊和鹿基因组，用以检测第一组引物的特异性和灵敏性。

将以上病毒基因组用作模板，反应体系如表1；

结果如图1所示，图1牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒荧光曲线为特异S型曲线；鸡痘、猴痘、猪痘、牛、山羊、绵羊、鹿基因组和空白对照荧光曲线为基线。引物组合可以特异检测是否含有牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒中任何一种病毒。

表1第一组引物荧光定量PCR反应管25ul反应体系：

第一组引物的核苷酸序列如下：

实施例2

利用牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒、鸡痘、猴痘、猪痘、牛、山羊、绵羊和鹿基因组，用以检测第二组引物的特异性和灵敏性。

反应体系如下表；

结果如图2所示，图2牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒荧光曲线为特异S型曲线；鸡痘、猴痘、猪痘、牛、山羊、绵羊、鹿基因组和空白对照荧光曲线为基线。引物组合可以特异检测牛结节皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、鹿痘病毒。猪流行性腹泻病毒各引物的核苷酸序列如下：

表2第二组引物荧光定量PCR反应管25ul反应体系：

第二组引物序列如下：

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