预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记及其应用

摘要

本发明属于生物医药领域，公开了预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记及其应用。包括：1.用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记组合，包括BST2rs9576，以及至少一种其他分子标记。2.检测上述分子标记组合的试剂和/或试剂盒，包括检测分子标记BST2rs9576的试剂。3.试剂盒，包括用于检测分子标记BST2rs9576的引物。4.用于检测分子标记的试剂在制备用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的产品中的应用，分子标记为BST2rs9576，试剂为检测BST2rs9576的引物。本发明提供的引物及产品可特异且高效地检出分子标记的多态性位点，以实现治疗前预测。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记及其应用。

背景技术

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)作为一种全球性公共卫生威胁，预计世界范围内感染人数高达2.92亿，其中约30％在中国。目前，乙肝病毒(hepatitis Bvirus，HBV)感染被认为是慢性乙型肝炎和肝癌发生的主要危险因素。

目前抗HBV的临床一线用药包括聚乙二醇干扰素α(pegylated interferonalpha，PegIFNα)及核苷(酸)类似物(nucleoside analogues，NUCs)，PegIFNα具有广泛的抗菌活性，同时也是抗病毒感染最重要的一种细胞因子。尽管PegIFNα存在明显的不良反应，但其诸多优点也让它始终活跃在临床一线治疗方案中：每周一次的给药方案提高了患者的依从性及耐受性，调节免疫及抗病毒的双重功效，使患者在治疗中获得长久应答；可作为一些新联合用药方案的重要组成部分；且在预防CHB患者进展为肝癌方面发挥比NUCs更为重要的作用。然而，目前PegIFNα治疗只在一小部分患者(约30％)中产生应答，且治疗价格相对昂贵，如果能筛选出这部分对PegIFNα治疗产生应答的患者，对他们采用相同方式继续进行治疗；而对未产生应答或应答低的患者，将调整治疗方案，进行精准治疗，以减少花费高额的治疗费，但治疗效果不佳的情况发生。因此在治疗前筛查患者对PegIFNα治疗疗效的应答，显得尤为重要。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出用于预测干扰素(IFN)α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记组合，能够对乙型肝炎患者采用干扰素α进行抗病毒治疗后的疗效进行评估，以利于治疗方法的选择及精准治疗。

本发明还提出了检测所述分子标记组合的试剂和/或试剂盒。

本发明还提出用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的试剂盒。

本发明还提出用于检测分子标记的试剂在制备用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的产品中的应用。

根据本发明的一个方面，提出了用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记组合物，所述分子标记组合包括BST2 rs9576，以及至少一种其他用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明可根据检测BST2 rs9576和至少一种其他用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记的基因分型结果，来对采用干扰素α抗病毒治疗乙型肝炎患者的疗效进行评估，从而有利于对乙型肝炎患者的抗病毒治疗方案的选择及精准治疗。

在感染或未感染病毒的肝细胞中，干扰素可诱导被称为干扰素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)的抗病毒基因表达。骨髓基质细胞抗原2(bonemarrow stromal cell antigen 2，BST2)，也被称为CD317或tetherin，是抑制包膜病毒释放的ISGs之一。发明人在前期研究发现，细胞实验中，BST2表达越高，对干扰素α治疗的反应越好，提示BST2基因中与BST2表达相关的单核苷酸多态性(SNP，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是人类可遗传的基因组变异中常见的一种)位点可能与评估干扰素α治疗对乙型肝炎患者的疗效有关。据此，发明人从BST2基因中筛选出了潜在功能性SNP位点：rs9576。

在本发明的一些实施方式中，所述至少一种其他用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记包括ALPK1 rs35389530；和/或所述至少一种其他用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记包括HLA-DPA1 rs3077、PAK4 rs9676717、CYP27B1rs4646536、IFNAR1 rs2850015中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述乙型肝炎患者为慢性乙型肝炎患者。

在本发明的一些实施方式中，所述乙型肝炎患者包括轻度慢性乙型肝炎患者、中度慢性乙型肝炎患者或重度慢性乙型肝炎患者。

在本发明的一些实施方式中，所述干扰素α包括聚乙二醇干扰素α或其衍生物。

在本发明的一些实施方式中，所述聚乙二醇干扰素α包括聚乙二醇干扰素α-2a、聚乙二醇干扰素α-2b中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，聚乙二醇干扰素α衍生物包括葡聚糖聚乙二醇干扰素α、转铁蛋白聚乙二醇干扰素α、羧基聚乙二醇干扰素α、甘氨酸-聚乙二醇干扰素α中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述疗效的评价指标至少包括所述乙型肝炎患者体内的乙型肝炎抗原(HBsAg)水平。

在本发明的一些实施方式中，所述疗效的评价指标还包括所述乙型肝炎患者体内的乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙肝病毒(HBV)DNA、丙氨酸转氨酶(ALT)水平。

在本发明的一些实施方式中，使用干扰素α治疗后，乙型肝炎患者的HBsAg清除或转化(伴有抗HBsAg的抗体产生)，且HBeAg发生血清转化(伴有抗HBeAg的抗体产生)，HBVDNA水平＜2000IU/mL，ALT＜正常值下限，即判断干扰素α对乙型肝炎患者的治疗是有效的。

根据本发明的第二个方面，提出了检测所述分子标记组合的试剂和/或试剂盒，包括检测分子标记BST2 rs9576的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括检测分子标记ALPK1 rs35389530、HLA-DPA1 rs3077、PAK4 rs9676717、CYP27B1 rs4646536、IFNAR1 rs2850015中至少一种的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂为检测所述分子标记BST2 rs9576的引物。

在本发明的一些实施方式中，所述引物包括(a)或(b)中的任一种：

(a)由SEQ ID NO:1所示的单链DNA和SEQ ID NO:2所示的单链DNA组成的引物；

(b)由将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的引物，且与(a)中的所述引物功能相同，其中所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加不影响对所述分子标记的检测。

在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO:1为5’-CCCATAACAACAGGCAGCAC-3’，SEQID NO:2为5’-TCATGGGGCAACACGGTTAG-3’。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括测序试剂、检测限制性片段长度多态性试剂、飞行质谱检测试剂、荧光探针检测试剂、基因芯片检测试剂中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包括检测分子标记ALPK1 rs35389530的引物。

在本发明的一些实施方式中，所述引物包括(c)或(d)中的任一种：

(c)由SEQ ID NO:3所示的单链DNA和SEQ ID NO:4所示的单链DNA组成的引物；

(d)由将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的引物，且与(c)中的所述引物功能相同，其中所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加不影响对所述分子标记的检测。

在本发明的一些实施方式中，SEQ ID NO:3为5’-ACGTTGACGACAGGTCAGC-3’，SEQID NO:4为5’-CCTGGGGTATTATGAGGCGAG-3’。

在本发明的一些实施方式中，所述引物用于检测所述分子标记的突变。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述引物用于检测所述分子标记的点突变。

根据本发明的第三个方面，提出了用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的试剂盒，包括用于检测分子标记BST2 rs9576的引物；所述引物包括(a)或(b)中的任一种：

(a)由SEQ ID NO:1所示的单链DNA和SEQ ID NO:2所示的单链DNA组成的引物；

(b)由将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的引物，且与(a)中的所述引物功能相同，其中所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加不影响对所述分子标记的检测。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于测序、检测限制性片段多态性、飞行质谱检测、荧光探针检测、基因芯片检测的试剂盒中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于检测分子标记ALPK1rs35389530的引物。

在本发明的一些实施方式中，所述引物包括(c)或(d)中的任一种：

(c)由SEQ ID NO:3所示的单链DNA和SEQ ID NO:4所示的单链DNA组成的引物；

(d)由将SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的引物，且与(c)中的所述引物功能相同，其中所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加不影响对所述分子标记的检测。

在本发明的一些实施方式中，采用所述试剂盒对干扰素α治疗乙型肝炎患者疗效的预测方法，包括以下步骤：

提取所述乙型肝炎患者的待测样品中的DNA；以所述DNA为模板，采用所述试剂盒进行PCR扩增，得扩增产物；对所述扩增产物进行检测，以确定所述乙型肝炎患者的基因分型。

在本发明的一些实施方式中，所述待测样品包括选自细胞、组织、尿液、血液、血清或血浆中的样品。

在本发明的一些实施方式中，所述检测包括电泳检测和测序检测。

所述电泳检测用于确定所述扩增产物是否为目的片段，并确认其纯度。

所述测序检测用于通过所述扩增产物的测序峰图来确定所述扩增产物的基因分型，进而确定所述乙型肝炎患者携带的基因分型。

通过基因分型，即可判断干扰素α对乙型肝炎患者的治疗疗效。若BST2 rs9576的基因型为GG，则用干扰素α治疗疗效好；若BST2 rs9576的基因型为GT/TT，则用干扰素α治疗的疗效较差。

根据本发明的第四个方面，提出了用于检测分子标记的试剂在制备用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的产品中的应用，所述分子标记为BST2 rs9576。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂为检测分子标记BST2 rs9576的引物。

在本发明的一些实施方式中，所述引物包括(a)或(b)中的任一种：

(a)由SEQ ID NO:1所示的单链DNA和SEQ ID NO:2所示的单链DNA组成的引物；

(b)由将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的引物，且与(a)中的所述引物功能相同，其中所述一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加不影响对所述分子标记的检测。

在本发明的一些实施方式中，所述分子标记还包括ALPK1 rs35389530、HLA-DPA1rs3077、PAK4 rs9676717、CYP27B1 rs4646536、IFNAR1 rs2850015中的至少一种。

本发明提供的引物及相应的产品可以特异且高效地检测出分子标记的多态性位点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1筛选BST2基因的SNP位点的流程图；

图2为本发明实施例2中PCR扩增产物的凝胶电泳结果图；其中，泳道1：DNA markerⅢ；P1、P2、P3分别代表3个患者的编号；左侧一列数字代表条带的分子量；

图3为本发明实施例2中PCR扩增产物的测序峰图；其中，(a)：P1患者扩增产物，(b)：P2患者扩增产物，(c)：P3患者扩增产物；加阴影的碱基即为待检位点(SNP位点)；

图4为本发明实施例3中对CHB患者的聚乙二醇干扰素α治疗应答的表型和基因型关联分析结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的描述中，除非另有明确的限定，检测、预测等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。

本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。

实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本实施例对用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记BST2基因的SNP位点进行了筛选，具体过程为：

(1)在BST2基因中筛选与BST2表达相关的潜在功能性SNP位点：筛选流程见图1，具体包括：1)在千人基因组计划东亚受试者的BST2基因中发现471个SNP位点，根据筛选标准(次等位基因频率MAF＞0.05，缺失率＜0.05，Hardy-Weinberg平衡P值＜0.001)，筛选出满足该标准的82个SNP位点；2)通过GTEx数据库肝组织中表达数量性状位点(eQTL)的表达分析，保留了59个P＜0.01的SNP位点；3)从2)中的SNP位点中筛选位于功能性区域(错义突变或UTR区域)的SNP位点，筛选出2个SNP位点，rs9576和rs13485；4)通过LD分析，利用RegulomeDB数据库发现rs9576作为功能性位点的可能更大，因此选择rs9576进行下一步研究。

(2)BST2 rs9576与治疗反应之间相关性的评估：在两组接受聚乙二醇干扰素α治疗至少48周并随访24周的HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者中(队列1，238人，即n＝238；队列2，707人，即n＝707)，进行BST2 rs9576与治疗反应之间相关性的评估。两组患者的纳入和排除标准相似，包括年龄18～65岁，HBsAg阳性至少6个月，HBeAg阳性，HBV DNA＞10

表1

注：

**

在第72周时，通过多因素logistic回归分析BST2 rs9576基因型(包括GG、GT、TT基因型)与两个队列治疗组的联合反应的关联性，结果如表2所示，

表2

注：

**

表2的结果反映，BST2 rs9576与两个聚乙二醇干扰素α治疗队列的联合应答率显著相关(队列1：P＝0.005，OR＝2.49；队列2：P＝0.001，OR＝1.99)。即，携带等位基因G患者的CR率要高于携带等位基因T的患者。因此，可以确定用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的分子标记为BST2 rs9576，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示：5’-CCCATAACAACAGGCAGCACATGCCCCCCACACCGCACCCCATGCCCAATCTCAGGGTGGGAGACAAGAGGGGGGACTCATTGTCCGGAGGGAGGCTCTGGAGGGAGACAGCCCTGGGTCAACCCGACTGTGTCCCCACACCCAGGACTTCCCCATGGCCCCTCCAGACCTGCTCCAGAGGCCCTTCTCCGGCTACCCCGTGCTCTCCCCGCTAACCGTGTTGCCCCATGA-3’，SNP位点位于第150位，多态性为G/T。

实施例2

本实施使用用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的试剂盒，对聚乙二醇干扰素α治疗慢性乙型肝炎受试者的疗效进行了预测，具体过程为：

本实施例提出了一种试剂盒，包括用于检测分子标记BST2 rs9576的引物：上游引物的核酸序列如SEQ ID NO:1所示：CCCATAACAACAGGCAGCAC，下游引物的核酸序列如SEQ IDNO:2所示：TCATGGGGCAACACGGTTAG；上述引物组由华大基因公司合成；试剂盒还包括PCR反应试剂：DNA聚合酶(LA-Taq，购自TAKARA公司)、缓冲液(10×LA Buffer，购自TAKARA公司)、底物(dNTPs，购自TAKARA公司)。

预测方法：

(1)提取经聚乙二醇干扰素α治疗的慢性乙型肝炎受试者的全血中的DNA(使用QIAamp Blood MiniKit250试剂盒进行提取)，于-20℃保存备用；

(2)以(1)中的DNA为模板，采用上述提到的用于预测干扰素α对乙型肝炎患者治疗疗效的试剂盒进行PCR扩增，PCR反应体系如表3所示；

表3

按照表3中试剂的顺序依次加入PCR管中，混匀，将PCR管放入PCR仪中，设置反应程序，如表4所示；

表4

启动PCR仪，进行PCR反应；

(3)扩增产物检测：配制浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，将扩增产物加入琼脂糖凝胶中进行电泳，以检测是否为目的片段(即BST2)，并确认其纯度。PCR扩增产物的电泳图如图2所示，泳道1：DNA markerⅢ(天根生化科技有限公司)，泳道2、3、4分别为编号P1、P2和P3患者的全血DNA经引物特异性扩增后获得的扩增产物的条带，结果显示3份DNA样本的扩增产物的条带位置大约在200～500bp之间，符合目的片段为231bp的预判。扩增产物的条带清晰单一，未见非特异性条带，且通过该方法扩增效率高，结果可靠。

(4)PCR产物的纯化及测序：将PCR扩增产物回收、纯化后，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序，公司返回的测序结果为扩增产物的碱基序列图，如图3所示；并利用MEGA-11软件对得到的序列与BST2正常基因组的标准序列(NCBI Accession number)进行对比，以确定BST2是否含有rs9576杂合或纯合突变。图3中的(a)、(b)、(c)分别对应图2中的患者P1、P2、P3的全血DNA的扩增产物的测序峰图，可以看出P1患者的扩增产物为T纯合子，P2患者的扩增产物发生了T→G的杂合突变，P3患者的扩增产物为G纯合子。

因此，使用本发明的试剂盒可以特异且高效地检测出BST2 rs9576的多态性位点。

实施例3

本实施例对CHB患者的聚乙二醇干扰素α治疗应答的表型与rs9576基因型进行了分析，具体过程为：

通过在945名CHB患者的聚乙二醇干扰素α治疗应答的表型和基因型进行关联分析，其中携带GG基因型的有368人，携带GT/TT基因型的有513人；分析结果如图4所示，在两个独立的队列中，rs9576 GG基因型患者的联合应答率(CR)显著高于rs9576GT/TT基因型患者的(队列1：35.6％vs.17.9％，P＝2.526×10

因此，在患者使用聚乙二醇干扰素α治疗之前进行rs9576的基因分型，可以用来预测聚乙二醇干扰素α对CHB患者的治疗效果，以实现个人化的精准治疗。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。