一种基于吲哚酮衍生物的细胞脂滴荧光成像探针及其在可视化细胞铁死亡过程中脂滴的应用

摘要

一种基于吲哚酮衍生物的细胞脂滴荧光成像探针及其应用，属于生物成像技术领域，该荧光探针的结构式如下所示。本发明还公开了该荧光探针在特异性标记HeLa细胞中脂滴和可视化HeLa细胞铁死亡过程中脂滴形态、空间和数量变化方面的应用。实验证实本发明的荧光探针Lipi‑EP是一种具有超高光稳定性和染色选择性的脂滴荧光探针，具有巨大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种基于吲哚酮衍生物的细胞脂滴荧光成像探针及其在特异性标记细胞中脂滴，可视化细胞铁死亡过程中脂滴形态、空间和数量变化方面的应用。

背景技术

铁死亡是近年来发现的一种依赖于铁的，区别于传统的细胞凋亡、坏死和自噬的一种新的细胞死亡调节形式。最近的研究表明，细胞铁死亡与各种生理和病理过程有密切关系，如癌症和神经退行性疾病、缺血性器官损伤、T细胞免疫等。细胞铁死亡是通过芬顿反应催化产生活性氧，进一步促进脂质过氧化，引起脂质过氧化物集聚，抑制脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)从而诱发铁死亡。脂滴(LDs)是储存中性脂质的主要细胞器，因此必然与铁死亡的调节相关。因此，关于铁死亡过程中脂滴的研究，特别是原位揭示脂滴在此过程中的变化，能够提供有关脂滴丰富和实时的信息，对于研究细胞铁死亡形成的机制非常重要。

众所周知，荧光成像是一种强大的监测亚细胞器行为的方法，具有原位和实时检测的能力。到目前为止，已经开发了许多用于脂滴成像和动态跟踪的脂滴荧光探针。特别是，其中一些探针已被用于研究铁死亡形成过程中脂滴的变化，极大地促进了铁死亡的研究。然而，由于受光稳定性不足和/或脂滴染色特异性相对较低的限制，这些脂滴荧光探针通常不能用于长时间的荧光成像。因此，以长期、原位和实时的方式监测铁死亡脂滴的变化是一项非常重要但又极具挑战性的任务。

发明内容

针对现有细胞脂滴成像荧光探针技术方面的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于吲哚酮衍生物的细胞脂滴荧光成像探针及其在特异性标记细胞中脂滴，可视化细胞铁死亡过程中脂滴形态、空间和数量变化方面的应用。

本发明所述的一种基于吲哚酮衍生物的细胞脂滴荧光成像探针(Lipi-EP)，其结构式如下所示：

其制备反应式如下：

针对现有细胞脂滴荧光成像探针光稳定性不足和脂滴染色选择性的不足，本发明在开发新型脂滴成像荧光探针方面选择了基于吲哚酮衍生物的荧光分子。该荧光分子展现较高光稳定性的同时，具有优异的脂滴染色选择性。本发明利用该探针成功地进行了延时多色成像和延时三维成像，实时监测了铁死亡过程中脂滴形态、空间和数量变化方面的应用。

本发明所述细胞为HeLa细胞。

实验结果证实，本发明所述的荧光探针Lipi-EP具有优异的光稳定性和染色选择性，在相同的染色和成像条件下，Lipi-EP表现出了比商用脂滴荧光探针BODIPY和Nile Red更优异的光稳定性和染色选择性。因此，荧光探针Lipi-EP可作为特异性标记脂滴、长时间、原位、实时地显示细胞铁死亡过程中脂滴形态、空间和数量变化方面的应用。这些荧光成像结果从多个角度(形态学、空间和数量)提供了关于脂滴的丰富信息，帮助我们深入了解脂滴在铁死亡过程中的变化。

附图说明

图1：本发明实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP在甲苯(toluene)中的吸收-发射光谱(左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱)；Lipi-EP在甲苯溶液中的吸收峰位于470nm处，发射峰位于490nm处。

图2：用不同浓度的荧光探针Lipi-EP染色HeLa细胞24小时后细胞的存活率柱形图；细胞存活率均在90％以上，证明了荧光探针良好的生物相容性。

图3：荧光探针Lipi-EP与脂滴荧光探针LDs-Red在HeLa细胞中共染色的共定位照片；

其中，细胞核使用Hoechst 33342染色。

图4：荧光探针Lipi-EP和脂滴荧光探针BODIPY、Nile Red在HeLa细胞中信噪比的量化图；

其中，图a、b部分分别是荧光探针Lipi-EP和BODIPY、Nile Red染色HeLa细胞的成像图片及局部放大图；图c部分是圆圈脂滴区域与圆圈细胞质区域的荧光强度比值。

图5：荧光探针Lipi-EP和脂滴荧光探针Bodipy、Nile Red在HeLa细胞中光稳定性的量化图；

其中，图a部分分别是荧光探针Lipi-EP和BODIPY、Nile Red染色HeLa细胞后在同一区域连续成像50张照片中的第1、10和50张照片；图b部分分别是这50张照片的相对荧光强度随成像张数的变化趋势曲线。该图说明探针Lipi-EP具有良好的光稳定性。

图6：荧光探针Lipi-EP在360分钟延时多色成像中实时监测铁死亡过程中脂滴尺寸的变化照片和曲线，说明铁死亡过程中脂滴尺寸基本保持不变。

其中，横坐标为时间，纵坐标为脂滴直径；脂滴的尺寸信息通过统计每个时间点的图像获得。

图7：荧光探针Lipi-EP在360分钟延时三维成像中实时监测铁死亡过程脂滴个数及分布的变化照片和曲线，说明铁死亡过程中脂滴个数的减少

其中，横坐标为时间，纵坐标为脂滴个数；脂滴颜色的变化意味着脂滴位置深度的不同。脂滴的数量信息通过最大投影每个时间点的三维图像获得。

具体实施方式

实施例1：

1、化合物2的合成

根据文献合成二甲基二羟基富马酸二甲酯(

1

2、化合物3的合成

在一个1L的圆底烧瓶中，将道氏热载体A(260mL)和化合物2(10.9g，24.7mmol)的混合物用力搅拌30分钟内加热到260摄氏度至回流，再继续反应30分钟，然后在18小时内慢慢冷却到室温，观察到棕黄色固体产物的沉淀。固体收集在烧结玻璃过滤器(G4)上，用石油醚洗涤(100mL)三次。最后，固体在真空下干燥，得到6.68g(66％)黄色粉末为化合物3。

1

3、化合物4的合成

将10g聚磷酸和化合物3(1.00g，2.46mmol)的混合物在氮气下120℃加热2.5h。将混合物冷却到50℃，然后慢慢加入水(100毫升)，保持温度恒定，直到放热过程停止。冷却至室温后，将沉淀收集在烧结玻璃过滤器(G4)上，用水冲洗。所得粗产物在真空下干燥后得到化合物4，不需进一步的提纯，进入应用于下一步。

4、Lipi-EP的合成

在化合物4(0.745g)和四丁基溴化铵(120mg，0.372mmol)的甲苯(20mL)和乙醇(2mL)混合液中加入氢氧化钠溶液(25.0mM，20mL)和1-溴丙烷(3.7mL，50mmol)，在氮气下回流48小时。冷却至室温后，将混合物过滤以去除无机盐。滤液倒入水中，用CH

1

实施例2：实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP吸收-发射光谱的测定

用10mL甲苯(toluene)溶剂将实施例1中合成的荧光探针Lipi-EP配成10μM浓度的溶液。在300～700nm波长范围内用紫外可见分光光度计扫描得到吸收光谱，用光纤式荧光光谱仪在470nm激发下收集得到荧光发射光谱，用Origin软件处理数据得到如图1所示的荧光探针Lipi-EP在甲苯溶液中的吸收-发射光谱(左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱)，说明了荧光探针Lipi-EP的吸收-发射峰位和它大的斯托克斯位移。

实施例3：HeLa细胞的培养

本实施例中所有百分数均为体积分数。

HeLa细胞株是在37℃、CO

待细胞生长到对数期，我们对细胞进行传代处理：将细胞培养瓶中原有的5mL培养液吸走后用2mL不含胎牛血清的DMEM培养液清洗细胞表面，将该培养液吸走后再用0.5mL胰酶消化处理细胞2分钟，待大部分细胞脱壁后，加入2mL含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养液吹打均匀，取适量该细胞分散液分别转移至新的细胞培养瓶和培养皿中，放入CO

实施例4：实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP细胞毒性的测试

我们使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)对荧光探针Lipi-EP进行细胞毒性测试。在96孔板上接种HeLa细胞(每个孔1*10

实施例5：实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP与脂滴荧光探针LDs-Red在HeLa细胞中共染色实验

我们将HeLa细胞培养于20mm直径玻璃底的培养皿中，在CO

实施例6：实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP的光稳定性测试

我们将实施例5中铺满HeLa细胞的2个培养皿从细胞培养箱中取出后，移除原有DMEM培养液，分别加入含有2μM Lipi-DSB，2μM BODIPY和2μMNile Red的DMEM培养液(含1％DMSO)，放回培养箱中继续培养2小时后，取出3个培养皿，分别用HBSS溶液洗3遍，之后进行荧光成像。我们在3个培养皿中分别选定3个区域，之后分别连续成像50张，发现BODIPY和Nile Red会很快被光漂而实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP在成像50张后相对荧光强度仍能保持在95％，说明了其优异的光稳定性，如图5所示。

实施例7：实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP在细胞铁死亡过程中通过多色延时成像观察脂滴

我们将实施例5中铺满HeLa细胞的培养皿从培养箱取出后，移除原有DMEM培养液，加入含有2μM Lipi-EP和1％ DMSO的DMEM培养液，放回培养箱培养2小时后取出。然后加入含有50nM MitoTracker Deep Red、20μMHoechst 33342和1％ DMSO的DMEM培养液，放回培养箱培养20分钟后取出。用新鲜培养基溶液冲洗3遍，然后加入含有10μM erastin的DMEM培养液，进行原位连续共聚焦成像，如图6所示。

实施例8：实施例1中制备的荧光探针Lipi-EP在细胞铁死亡过程中通过三维延时成像观察脂滴

我们将实施例5中铺满HeLa细胞的培养皿从培养箱取出后，移除原有DMEM培养液，加入含有2μM Lipi-EP和1％ DMSO的DMEM培养液，放回培养箱培养2小时后取出。用新鲜培养基溶液冲洗3遍，然后加入含有10μM erastin的DMEM培养液，进行原位连续共聚焦三维成像。利用徕卡LAS X软件对三维共焦图像进行重构，如图7所示。