局晚期直肠癌术后复发风险相关标记物、评价装置以及计算机可读介质

摘要

本发明涉及用于局晚期直肠癌术后复发风险监测相关的标志物，属于医学分子生物学技术领域。通过对于局晚期直肠癌患者确诊活检组织，手术组织和切缘组织样本进行NGS测序，并在术后定期随访，分析发现了可以预测患者术后复发风险的标志物：KRAS基因，FBXW7基因，切缘组织突变状态以及新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式。其中切缘组织突变状态和新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式是本专利新发现的标志物，两者均能够有效地区分出高复发风险患者，提示临床及时调整治疗方案，从而使得患者能够得到更长期的生存获益。

说明书

技术领域

本发明涉及用于局晚期直肠癌复发风险预测的基因标志物，属于医学分子生物学技术领域。

背景技术

根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据，结直肠癌位居全球癌症发病率的第三位，而在全球常见癌症死亡率排名中居于第二位，占所有肿瘤新发病例的10％左右。其中直肠癌约占新诊断病例的1/3，部分患者在就诊时已处于局部晚期，失去根治性手术的机会。目前局部晚期直肠癌(LARC，T3-4NX&TXN1-2，M0)患者的标准治疗模式为新辅助放化疗±直肠癌全系膜切除术±辅助化疗。一项针对599例中国LARC患者的多中心随机对照试验中显示，无论采取短程放疗+新辅助化疗或是长程放化疗(CRT)的治疗方案，患者的3年DFS率分别为62.3％和64.5％，仍有一部分患者面临这局部复发或远处转移的风险，严重危害患者的生存。目前临床上主要基于TNM分期将患者患者进行风险分层，但随着二代测序技术的应用，越来越多的相关研究发现根据TNM划分为高低危组中的患者，可以进一步的根据患者术后ctDNA的状态进一步风险分层，提示仅依赖TNM分期的不足，需要更多的风险分层标志物。

此前已有报道在直肠癌患者的新辅助治疗中，部分患者治疗中检出新发突变，且检出新发突变的患者在未获得pCR组占比更高，暗示新辅助前后突变的变化特征可以提示患者新辅助放化疗疗效，而这种突变图谱的改变对于患者术后复发风险的影响既往未曾有过报道。此外在头颈癌和胰腺癌患者中发现手术切缘组织中检出突变的患者复发风险更高。而目前已有报道FBXW7基因突变以及KRAS基因突变等与LARC患者复发风险相关，但是关于LARC患者基因变异与术后复发风险的报道仍然较少，有待进一步发现。

发明内容

本发明通过基因数据的筛选，找到了可以用于评估局晚期直肠癌术后复发风险预测的分子标志物，利用标志物对患者的DFS进行评估时，能够较好地区分术后复发风险的高低。

用于检测手术切缘组织的基因突变或者新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变的试剂在用于制备直肠癌患者复发风险评估试剂中的应用。

所述的直肠癌的分型是局晚期。

所述的基因突变选自单核苷酸变异、插入缺失突变、错义突变、无义突变、剪切突变、移码突变、非移码突变或者启动子突变中的一种。

所述的基因突变需要满足以下条件：突变丰度≥0.5％或测序深度≥30X，测序得到的reads读数≥2。

当基因突变是非热点突变时，测序得到的reads读数≥4。

所述的热点突变是指Cosmic数据库中出现次数≥20次。

所述的应用中还包括对新辅助治疗前后肿瘤组织中的基因突变是否存在分支进化的判定的步骤。

复发风险评估是通过无病生存期(DFS)进行评价。

一种直肠癌患者复发风险评估装置，包括：

测序模块，用于对样本切缘组织或者肿瘤组织样本进行测序，并获得测序信息；

判定模块，包括第一判定模块和/或第二判定模块；

所述的第一判定模块用于手术切缘组织的基因突变情况进行判定，若存在基因突变，则判定样本存在复发风险；

所述的第二判定模块用于对新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变情况进行判定，若前后存在分支进化，则判定样本存在复发风险。

一种计算机可读介质，其记载有可运行以下步骤的计算机程序：

步骤1，获得手术切缘组织的基因突变或者新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变的信息；

步骤2，对手术切缘组织的基因突变情况进行判定，若存在基因突变，则判定样本存在复发风险；或者，对对新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变情况进行判定，若前后存在分支进化，则判定样本存在复发风险。

用于检测KRAS或FBXW7基因突变的试剂在用于制备直肠癌患者复发风险评估试剂中的应用。

附图说明

图1.病理分期对术后复发风险影响。

图2.淋巴血管侵犯对术后复发风险影响。

图3.KRAS基因对术后复发风险影响。

图4.FBXW7基因对术后复发风险影响。

图5.切缘组织突变状态对术后复发风险影响。

图6.新辅助治疗前后肿瘤组织进化模式示意图；G1：线性进化；G2：平行进化；G3：分支进化。Trunk：共有突变；Private：各自特有突变。

图7.新辅助治疗前后肿瘤组织进化模式对术后复发风险影响。

具体实施方式

本研究中共对55例接受了新辅助放化疗及直肠癌全系膜切除术(TME)的局晚期直肠癌进行了分析，收集患者的活检确诊组织，手术组织以及切缘组织。患者组织DNA样本的提取使用现有商用化试剂盒，提取后的DNA样本采用Qubit 3.0进行纯度评估，而后采用KAPA Hyper Prep Kit进行文库构建，检测覆盖474个关键癌症相关基因的癌症相关panel，具体覆盖基因如下表1所示，测序仪选择Illumina HiSeq 4000。测序完成后通过南京世和基因生物技术股份有限公司生物信息分析流程进行测序数据分析。

表1 474个关键癌症相关基因

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将临床特征，手术组织中基因突变频率≥10％的基因，切缘组织突变状态及新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式结合随访得到的患者无病生存期(DFS)进行分析，通过Log-rank进行统计检验，筛选P值<0.05的特征，并进一步通过False Discovery Rate方法进行多重校正，发现KRAS或FBXW7基因为突变型，切缘组织突变阳性或者分支进化(G3)的患者术后复发风险显著更高(校正P值<0.05)，其中切缘组织突变状态和新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式是新发现的局晚期直肠癌患者术后复发风险预测潜在的分子标志物。

本发明中所述的“基因突变”包含以下几种情况：

单核苷酸变异(SNV)：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化

插入缺失突变(Indel)：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加或减少，这些类型的突变可能是“蛋白编码框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少；或导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。

错义突变(Missense variants)：DNA碱基置换而引起mRNA上特定的遗传密码的改变，并导致新合成的肽链中氨基酸变化。

无义突变(Nonsense variants)：DNA碱基置换出现终止密码子，引起肽链合成终止，并可能产生功能异常的蛋白质。

剪切突变(Splice site variants)：突变可能影响RNA剪接，并可能导致产生的功能异常的蛋白质。

移码突变(Frameshift variants)：DNA链上插入或缺失非3的整倍数的碱基，引起阅读框变化，导致插入或缺失位点后的肽链合成错误。

非移码突变(Inframeshift variants)：DNA链上插入或缺失3的整倍数的碱基，造成插入或缺失数个氨基酸。

启动子突变(Promoter variants)：突变发生于启动子区域或其他调控基因转录的DNA区域，可能影响基因启动子转录功能。

本发明中所述的“切缘组织突变阳性”的定义为：若切缘组织检测出确诊活检组织或手术肿瘤组织中的突变，并且对于热点突变满足，突变丰度≥0.5％或测序深度≥30X，支持的reads读数≥2；非热点突变满足，突变丰度≥0.5％或测序深度≥30X，支持的reads读数≥4，则被认为是切缘突变阳性。其中热点突变定义为Cosmic数据库(v92)中出现次数≥20次。

本发明中所述的“辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式”的定义为：若新辅助治疗后肿瘤组织中的基因变异均来源于新辅助治疗前活检组织，则定义为线性进化(G1)；若新辅助治疗后肿瘤组织中的基因变异与新辅前活检组织完全不一致，则定义为平行进化(G2)；若新辅助治疗后肿瘤组织中的基因变异与新辅前活检组织存在部分交集基因，则定义为分支进化(G3)。

临床特征与患者复发风险相关性

将收集到的患者年龄，性别，病理分期，肿瘤消退分级(TRG)，新辅助放化疗方案，放疗剂量，淋巴血管侵犯，神经侵犯，检出淋巴结数，阳性淋巴结数以及转移淋巴结比例与患者的DFS进行分析。结果如表2所示，病理分期为II或III期，发生淋巴血管侵犯的患者复发风险更高(p<0.005)，生存曲线如图1和2所示。

表2临床特征对于患者复发风险的影响

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分子特征与患者复发风险相关性

纳入手术组织中突变频率>10％的基因进行Log-rank分析，发现手术组织样本中检测到FBXW7或KRAS基因突变的患者术后复发风险更高，具体生存曲线如图3和4所示。同时根据切缘样本的突变检出情况，将其划分为切缘组织突变阳性和阴性，结果表明切缘组织突变阳性的患者复发风险更高，生存曲线如图5所示。此外，通过对比新辅助治疗前后组织样本突变状态，划分患者不同进化模式，各个模式定义如图6所示。进化模式结果表明，分支进化(G3)模式的患者复发风险显著增加，生存曲线如图7所示。

表3分子特征对于患者复发风险的影响

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为了进一步验证，本专利将临床以及分子显著的特征，进一步进行多重校正，采用False Discovery Rate(FDR)方法。各特征因素P值经过FDR校正过后，仍然具有显著性，具体结果见表4所示。

表4临床及分子特征P值校正结果

通过上述方法我们发现了病理分期以及淋巴血管侵犯两个临床特征与患者术后复发风险相关。同时分子特征方面FBXW7基因，KRAS基因，切缘组织突变状态以及新辅助治疗前后肿瘤组织进化模式可以用于预测局晚期直肠癌患者的术后复发风险，其中切缘组织突变状态以及新辅助治疗前后肿瘤组织进化模式均为本专利新发现的分子特征。