油菜绿色革命基因bgr及其应用

摘要

本发明公开了油菜绿色革命基因bgr及其应用。基因bgr能够显著降低油菜植株高度，茎杆粗壮，抗倒伏，使分枝角度变小，株型紧凑，有效地提高收获指数。该基因具有显著的杂种优势，杂合的bgr能够使四倍体油菜(甘蓝型油菜和芥菜型油菜)更具理想株型特征，植株高度120‑160cm，株型紧凑，分枝角度小(30°)，第一分枝位置降低，收获指数提高约27％，适宜于密植，产量大幅提高11‑27％。具有bgr的杂种甘蓝型油菜含油量大幅提高，可达51.7‑54.86％，比普通高含油量油菜品种提高9.14‑19.26％。本发明为油菜育种贡献了宝贵的基因资源，为油菜新种质的创制提供有效手段。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及油菜绿色革命基因bgr及其应用。

背景技术

油菜是重要的油料作物。油菜隶属于十字花科(Brassicaceae)，芸薹属(Brassica)。上世纪30年代，日本学者盛永和、禹长春等人将芸薹属植物划分为3个基本种和3个复合种，3个基本种为白菜(Brassica.rapa，AA，2n＝20)、黑芥(Brassica nigra，BB，2n＝16)和甘蓝(Brassica oleracea，CC，2n＝18)；3个复合种为甘蓝型油菜(Brassicanapus，AACC，2n＝38)、芥菜型油菜(Brassica juncea，AABB，2n＝36)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata，BBCC，2n＝34)，认为复合种是由基本种经过天然杂交后染色体加倍后形成的。目前中国油菜主栽品种以甘蓝型油菜为主，芥菜型油菜和白菜型油菜也有小面积种植。中国油菜种植面积约1亿亩。欧洲、加拿大、印度也是油菜籽的重要生产区域。

纵观国内外油菜的育种现状，油菜育种虽然实现了“低芥酸低硫苷”品质的提升和含油量的提高，但整体油菜单位面积平均产量低。

上世纪，“绿色革命”基因在小麦、水稻等作物中的成功应用，使其株型得到改良，如植株半矮化，进而使得抗倒伏能力增强且产量和收获指数都得到大幅提高。鉴于现行油菜品种普遍存在植株高、冠层宽、易倒伏等问题，因此株型育种是油菜育种中的焦点问题。油菜的理想株型是指株型半矮化，株高120-140厘米，株型紧凑且分枝角度<30°，角果立生，密集，长度中等。“绿色革命”基因在油菜育种中尚未得到应用，因此寻找油菜的“绿色革命”基因，获得具有理想株型特征的油菜新种质，是全球油菜突破其株型育种瓶颈的关键所在。

发明内容

本发明的目的是提供油菜绿色革命基因bgr及其应用。

本发明的另一目的是提供甘蓝型油菜新种质的创制方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种油菜绿色革命基因bgr，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a1)由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b1)SEQ ID NO:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a1)衍生的蛋白质。

基因bgr的基因组DNA序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

基因bgr的CDS序列为：

i)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述油菜绿色革命基因bgr来自白菜型油菜突变体bgr-JT。bgr-JT是利用甲基磺酸乙酯(EMS)对白菜型油菜Jietou2号(Brassica rapa，二倍体，2n＝20，染色体组为AA)进行化学诱变，获得的植株矮化、分枝紧凑的白菜型油菜突变体，具有理想株型的特点。

第二方面，本发明提供所述油菜绿色革命基因bgr的同源基因，共7个同源基因，分别为mBnaA01T000997、mBnaA03T004751、mBnaA08T002216、mBnaC03T001151、mBnaC04T001741、mBnaC04T005325和mBnaC07T004394；

其中，mBnaA01T000997为编码如下蛋白质(a2)或(b2)的基因：

(a2)由SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b2)SEQ ID NO:23所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a2)衍生的蛋白质；

mBnaA03T004751为编码如下蛋白质(a3)或(b3)的基因：

(a3)由SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b3)SEQ ID NO:25所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a3)衍生的蛋白质；

mBnaA08T002216为编码如下蛋白质(a4)或(b4)的基因：

(a4)由SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b4)SEQ ID NO:27所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a4)衍生的蛋白质；

mBnaC03T001151为编码如下蛋白质(a5)或(b5)的基因：

(a5)由SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b5)SEQ ID NO:29所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a5)衍生的蛋白质；

mBnaC04T001741为编码如下蛋白质(a6)或(b6)的基因：

(a6)由SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b6)SEQ ID NO:31所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a6)衍生的蛋白质；

mBnaC04T005325为编码如下蛋白质(a7)或(b7)的基因：

(a7)由SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b7)SEQ ID NO:33所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a7)衍生的蛋白质；

mBnaC07T004394为编码如下蛋白质(a8)或(b8)的基因：

(a8)由SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b8)SEQ ID NO:35所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a8)衍生的蛋白质。

第三方面，本发明提供含有所述油菜绿色革命基因bgr或所述同源基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

第四方面，本发明提供所述油菜绿色革命基因bgr或所述同源基因或所述生物材料的以下任一应用：

(1)用于调控植物株高、株型、叶型、含油量及产量；

(2)用于植物品种改良；

(3)用于制备转基因植物。

所述株型包括但不限于分枝角度、分枝数。

本发明中，所述植物为芸薹属植物，优选油菜，更优选四倍体油菜，最优选甘蓝型油菜(Brassica napus)、芥菜型油菜(Brassica juncea)。

第五方面，本发明提供一种使油菜株高降低、分枝角度变小、株型紧凑、叶片皱缩、含油量提高、产量提高的方法，所述方法包括：利用基因工程手段、基因编辑手段、化学和/或物理诱变手段、植物杂交手段，在油菜基因组中引入突变，使其编码的糖原合酶激酶3β(GSK3β)及其同源蛋白中保守基序LGTPTRE中的E突变为K；或者，

将所述油菜绿色革命基因bgr或所述同源基因通过质粒导入油菜中或通过基因工程手段整合到油菜染色体上。

所述油菜优选为四倍体油菜，更优选甘蓝型油菜、芥菜型油菜。

进一步地，所述方法包括：在植物中过表达所述油菜绿色革命基因bgr或所述同源基因；

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子或弱启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子。

优选地，所述启动子为白菜型油菜(Brassica.rapa)GSK3β蛋白bgr或BGR基因启动子，其核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同启动子功能的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:7所示序列杂交且具有相同启动子功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同启动子功能的核苷酸序列。

第六方面，本发明提供按照所述方法获得的转基因油菜在植物育种中的应用。

育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

优选地，将获得的转基因油菜作为保持系，用于创制油菜不育系或恢复系。

第七方面，本发明提供甘蓝型油菜新种质的创制方法，利用基因工程技术(如基因编辑或转基因)或诱变技术在二倍体油菜基因组中引入突变，使其编码的糖原合酶激酶3β中保守基序LGTPTRE中的E突变为K(如SEQ ID NO:4所示)，获得具有理想株型特征的油菜突变体；然后将所述油菜突变体与甘蓝型油菜杂交并结合小孢子培养技术，获得甘蓝型油菜育种材料。

在本发明的一个具体实施方式中，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在二倍体油菜基因组中引入突变，引导编辑序列优选如SEQ ID NO:36所示。

第八方面，本发明提供甘蓝型油菜新种质的创制方法，利用基因工程技术(如基因编辑或转基因)或诱变技术在四倍体油菜基因组中引入突变，使其编码的糖原合酶激酶3β中保守基序LGTPTRE中的E突变为K(如SEQ ID NO:4所示)，获得具有理想株型特征的油菜突变体。

第九方面，本发明提供糖原合酶激酶3β突变体，所述突变体包含糖原合酶激酶3β中保守基序LGTPTRE中的E由E到除了E之外的其他氨基酸的突变(优选由E到K的突变)。所述糖原合酶激酶3β来自于油菜。

第十方面，本发明提供了培育甘蓝型油菜新品种的方法，利用上述基因程技术(如基因编辑或转基因)或诱变技术获得具有理想株型特征的油菜突变体基础上，创制矮化油菜不育系或恢复系，并通过三系配套生产杂交种。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次发现了油菜绿色革命基因bgr(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)，该基因能够显著降低油菜植株高度，茎杆粗壮，抗倒伏，使分枝角度变小，株型紧凑，有效地提高收获指数。该基因具有显著的杂种优势，杂合的bgr能够使四倍体油菜(甘蓝型油菜和芥菜型油菜)更具理想株型特征，植株高度120-160cm，株型紧凑，分枝角度小(<30°，目前油菜分枝角度大于30°)，第一分枝位置降低，收获指数提高27％左右，适宜于密植(30000-40000株/亩，目前甘蓝型油菜种植密度为15000-20000株/亩)，产量大幅提高11-27％。具有bgr的杂种甘蓝型油菜含油量大幅提高，含油量可达51.7-54.86％，比普通高含油量油菜品种(46.00-47.37％)提高9.14-19.26％。本发明为油菜育种贡献了宝贵的基因资源，为油菜新种质的创制提供有效手段。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中pHZM137-BrBGRpro载体图。

图2为本发明较佳实施例中BrBGR及Brbgr在甘蓝型油菜中的功能分析。其中，WT，野生型westar；BGR，在自身启动子驱动下转BrBGR基因株系的表型；bgr，在自身启动子驱动下转Brbgr基因株系的表型。

图3为本发明较佳实施例中bgr对不同芸薹属植物的株型影响。其中，A，芥头2号突变体bgr-JT与白菜型油菜黄籽沙逊的杂交表型，左边为F1，右边为黄籽沙逊；B，芥头2号突变体bgr-JT与甘蓝型油菜Westar的杂交表型，左边为Westar，右边为F1；C，芥头2号突变体bgr-JT与芥菜型油菜FY02的杂交表型，右边为芥菜型油菜FY02，左边F1。

图4为本发明较佳实施例中部分甘蓝型油菜DH株系。其中，DH56，DHD1分别是小孢子培养分离出来的甘蓝型油菜高杆和矮杆株系。

图5为本发明较佳实施例中甘蓝型油菜突变体bgr。其中，C76甘蓝型油菜；甘蓝型油菜bgr株系DHD1。

图6为本发明较佳实施例中甘蓝型油菜Bnbgr株系DHD1油菜素内酯合成途径中代谢物的测定。其中，D1，矮杆Bnbgr株系DHD1；DH56，高杆甘蓝型油菜DH56。BL(油菜素内酯)、CS(油菜素甾酮)、TE(茶甾酮)、TY(香蒲甾醇)、和6-deoCS(6-脱氧油菜素甾酮)。FW，组织鲜重。其中，*表示P<0.05。

图7为本发明较佳实施例中不同激素的测定。其中，D1，矮杆Bnbgr株系DHD1；DH56，高杆甘蓝型油菜DH56。Salicylic acid，水杨酸；Gibberellin A3，赤霉素A3；GibberellinA1，赤霉素A1；Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸；Abscisic acid，脱落酸；Jasmonic acid，茉莉酸；Gibberellin A7，赤霉素A7；Gibberellin A4，赤霉素A4；Jasmonoyl-isoleucine，茉莉酸-异亮氨酸。FW，组织鲜重。其中，*表示P<0.05，***表示P<0.001，****P<0.0001。

图8为本发明较佳实施例中基因编辑载体示意图。其中，pHZM184B，本实验室构建的编辑载体；gK1，编辑K1位点的载体；gK2，编辑K2位点的载体。

图9为本发明较佳实施例中部分bgr敲除的表型。其中，g2-1/Bnbgr，在bgr背景下编辑K2位点的表型；g1-1/Bnbgr，在bgr背景下编辑K1位点的表型；Bnbgr，矮化甘蓝型油菜bgr；A、B和C，分别为g2-1/Bnbgr、g1-1/Bnbgr和Bnbgr莲座叶片放大图。

图10为本发明较佳实施例中蛋白序列比对结果。其中，BnaA01T000997、BnaA03T004751、BnaA08T002216、BnaC03T001151、BnaC04T001741、BnaC04T005325和BnaC07T004394来源于甘蓝型突变体DHD1。BIN2，AT4G18710；BIL1，AT2G30980；BIL2，AT1G06390。箭头所指的氨基酸残基为BGR突变(E293K)所在的位置，*为保守基序。HsGSK3β，P49841；Hs，Homo sapiens；RnGSK3β，P18266；Rn,Rattus norvegicu；箭头所指的氨基酸残疾为BGR突变(E293K)所在的位置。阴影表示该位置的氨基酸残基完全相同。Cre12.g511850_4532.3，来源于Chlamydomonas reinhardtii的基因组。GhBIN2，AJP75152，棉花的BIN2。Glyma.13G289800、Glyma.12G212000、Glyma.12G129600、Glyma.10G144600、Glyma.06G275800、Glyma.15G084400、Glyma.13G228100、Glyma.06G064800和Glyma.04G063600来源于大豆基因组。Zm00001eb338190、Zm00001eb277790、Zm00001eb238820、Zm00001eb204920和Zm00001eb120370来源玉米基因组。VIT_12s0028g01810和VIT_10s0003g01480，来源于葡萄基因组。Os06t0547900、Os05t0207500和Os02t0236200来源于水稻基因组。

图11为本发明较佳实施例中bgr同源基因突变体转基因植株表型。其中，A-G，分别为转mBnaA01T000997、mBnaA03T004751、mBnaA08T002216、mBnaC03T001151、mBnaC04T001741、mBnaC04T005325和mBnaC07T004394突变体的表型。

图12为本发明较佳实施例中BGR引导序列编辑载体图。其中，M_MLV_RT,MoloneyMurine Leukemia Virus Reverse Transcriptase。Cas9,SpCas9的840H突变为A。

具体实施方式

本发明建立了一套高效的甘蓝型油菜新种质的创制体系。该体系通过二倍体油菜的EMS诱变，获得具有理想株型特征的育种潜力的突变体，通过突变体与四倍体油菜杂交并结合小孢子培养技术，实现性状的快速固定及材料的纯合，最终获得具有育种潜力的甘蓝型育种材料。

本发明首次发现并利用油菜理想株型基因bgr，该理想株型基因是一个由于点突变造成的功能获得型基因，其编码的蛋白BGR保守序列LGTPTRE中的E突变为K。

进一步地，将bgr基因用于四倍体油菜改良。

进一步地，将纯合的bgr与常规四倍体油菜杂交获得具有杂种优势的F1。

进一步地，将纯合的bgr甘蓝型油菜可作为细胞质不育系的保持系，可以将植株矮化和株型紧凑的性状通过杂交和连续回交转育成具有植株矮化、株型紧凑的不育系。

进一步地，将上述获得的植株矮化、株型进程的不育系与恢复系杂交获得F1种子，该F1种子可用于油菜生产，可用于密植，获得高产和高油含量的油菜籽。

通过育种分析发现，bgr基因在二倍体油菜背景下，无杂交育种潜力，而在四倍体背景下存在巨大的育种潜力。

进一步通过图位克隆获得了控制油菜理想株型的bgr基因。通过序列分析发现，该表型是由于BGR基因第9外显子中的第2191位碱基由G突变成A而成，致使其编码的氨基酸序列中第293位的氨基酸由E(谷氨酸)转变成K(赖氨酸)引起的。该基因编码一个糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β，GSK3β)。bgr基因是一个功能获得型基因，其编码的蛋白突变位点位于动植物GSK3β保守的LGTPTRE基序内，该蛋白中的E突变为K。

进一步通过同源基因分析，发现油菜基因组中共有8个拷贝(8个同源基因)。通过定点突变，发现其他7个拷贝发生与bgr相同的突变(图11)，都可以引起与bgr相似的表型。且其他物种的同源基因编码的蛋白，其保守的GTPTRE基序内的E突变为K，都具有调控油菜株型的功能。由此可知，该类蛋白的LGTPTRE基序中E突变为K，都可以使油菜植株矮化，分枝角度变小。

进一步地，通过基因编辑将BGR蛋白中LGTPTRE的E转变为K，可以获得植株矮化、株型紧凑的甘蓝型油菜植株。

进一步地，将BGR基因(基因组DNA及其cDNA)体外定点突变为bgr(基因组DNA及其cDNA)，并将突变的基因bgr转入四倍体油菜，可获得植株矮化、株型紧凑的油菜育种材料。

进一步地，利用BGR/bgr自身启动子驱动bgr基因，用于四倍体油菜改良。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1白菜型油菜bgr基因的图位克隆

1、Brbgr的定位

利用0.5％EMS处理白菜型油菜芥头2号种子。通过EMS诱变，获得了植株矮化、分枝紧凑的白菜型油菜突变体bgr-JT，具有理想株型的特点。利用该突变体与北京快菜杂交，构建F2群体，以白菜基因组B.rapa Chiifu_V3.0(http://brassicadb.cn)为参照基因组，利用Mutmap技术，初步将bgr基因定位于A4:14035360bp-20192770bp。又通过SSR标记进行了精细定位，将区间定位于A4:16312022-16495148。在该区间内只有BraA04g022200的编码区有SNP变异，即高杆植株BraA04g022200的编码区没有SNP变异，矮杆植株都具有SNP变异。根据功能注释，BraA04g022200编码一个糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)，与AT2G30980(BIL1)具有96.79％的序列相似性，该基因是油菜素内酯(Brassinolides，BRs)信号传导通路的核心负调控元件，也参与生长素(Auxin)信号调控途径。我们将BraA04g022200命名为BGR，其具有SNP变异的基因命名为bgr。

2、白菜型油菜BrBGR和Brbgr的克隆

为了获得基因组的全长转录本，我们利用Trizol法提取了突变体根、茎、叶、花、角果等5个组织的总RNA，等量混合后，利用PacBio测序技术，获得了全长转录本。根据全长转录本，设计引物BrBGR-F和BrBGR-R，利用基因组DNA和cDNA分别获得了BrBGR的DNA全长及CDS全长。

引物BrBGR-F序列：agcaggctttgactttATGACCTCACTATCATTGGGGC(小写字母为载体上的接头)

引物BrBGR-R序列：tgggtctagagactttccATGACCAGGCTGTGATGGGAA(小写字母为载体上的接头)

DNA的提取：利用CTAB法提取基因组DNA。取100mg的新鲜组织，利用液氮研磨后，加入1mL CTAB提取缓冲液(4.1g NaCl溶解于80mL H

总RNA的提取：将样品于液氮中研磨，将粉末分装于1.5mL离心管中(每管约0.1g样品)；向离心管中加入1mL Trizol，涡旋混匀，室温放置10min；加入200μL氯仿，涡旋混匀，室温放置5min；于4℃下，13,000rpm离心15min，取上清于新离心管中；加入500μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10～15min；于4℃下，13,000rpm离心15min；弃上清，加入1mL70％乙醇(RNA专用)洗涤沉淀，13,000rpm离心5min；沉淀于超净台吹5-10min，加入一定量的无RNAase的水溶解，备用。

cDNA的合成：取适量无DNA的总RNA，利用反转录试剂盒，将RNA转录为cDNA，备用。

PCR程序：98℃3min；98℃10s，60℃0.5-2min，72℃2min，循环28-35次，72℃3min。

PCR体系：1μL模板，10μL

利用DNA或cDNA作为模版，通过PCR扩增，获得预期大小片段，通过in-fusion克隆将其连接到入门载体pGWC(由中国农业大学陈启军教授惠赠)上。并进行测序分析。

载体的酶切：42μL pGWC(200ng/μL)，3μL AhdI，5μL 10×CutSmart buffer。37℃2hr，65℃10min。备用。

无缝克隆：4μL 2×in-fusion mix，2μL酶切的质粒，2μL PCR产物。

大肠的转化：将连接产物通过热激法转化DH5α，挑取克隆，PCR检测后，测序分析。

基因的序列分析：Brbgr和BrBGR的全长DNA序列，分别命名为gBrbgr(SEQ ID NO:1)和gBrBGR(SEQ ID NO:2)，其编码区的DNA序列长度均为2873bp；CDS序列分别命名为Brbgr(SEQ ID NO:3)和BrBGR(SEQ ID NO:5)和，其长度均为1233bp，编码410个氨基酸组成的肽链，Brbgr和BrBGR编码的氨基酸序列分别见SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。

BrBGR的DNA序列由12个外显子和11个内含子组成：1-105bp为第一个外显子，106-680bp为第一个内含子，681-773bp为第二个外显子，774-962bp为第二个内含子，963-1022bp为第三个外显子，1023-1112bp为第三个内含子，1113-1385bp为第四个外显子，1386-1473bp为第四个内含子，1474-1548bp为第五个外显子，1549-1625bp为第五个内含子，1626-1683bp为第六个外显子，1684-1781bp为第六个内含子，1782-1920bp为第七个外显子，1921-2009bp为第七个内含子，2010-2060bp为第八个外显子，2061-2169bp为第八个内含子，2170-2265bp为第九个外显子，2266-2354bp为第九个内含子，2355-2438bp为第十个外显子，2439-2555bp为第十个内含子，2556-2657bp为第十一个外显子，2658-2777bp为第十一个内含子，2778-2873bp为第十二个外显子。gBrbgr与gBrBGR相比，在第九个外显子上，gBrbgr有一个SNP突变G2191A，造成其编码的蛋白氨基酸的改变，即此位置氨基酸由谷氨酸(E)变成赖氨酸(K)，标记为E293K。

实施例2白菜型油菜bgr基因启动子的克隆

以含有bgr基因的白菜型油菜芥头2号突变体的DNA为模版，利用引物对(BrBGR_P-F1和R1)，将其在bgr/BGR起始密码子上游-1234bp的启动子区域克隆到pHZM137双元载体上，替换其中的CaMV35S启动子，获得载体pHZM137-BrBGRpro(图1)。

BrBGR_P-F1：cacacttattacaggcctATGTTCGAAATCTACAAATAAGGAGCC(小写字母为载体上的接头)

BrBGR_P-R1：aacttgtgatctcgagGTGCTATTCTTCTCTCTCTCTCTCTAACTT(小写字母为载体上的接头)

白菜型油菜bgr基因启动子序列如SEQ ID NO:7所示。

pHZM137双元载体的构建方法如下：将绝缘子gypsy(由浙江大学王君晖教授惠赠，参见She W,Lin W,Zhu Y,Chen Y,Jin W,Yang Y,Han N,Bian H,Zhu M,Wang J.The gypsyinsulator of Drosophila melanogaster,together with its binding proteinsuppressor of Hairy-wing,facilitate high and precise expression of transgenesin Arabidopsis thaliana.Genetics.2010Aug；185(4):1141-50.doi:10.1534/genetics.110.117960.Epub 2010Jun 1.PMID:20516496；PMCID:PMC2922898.)插入载体pEarleyGate 100的2位点(PmeI和AhdI间及StuI位点)；之后在PmeI位点插入来源于载体pH7GWIWG2(II)的潮霉素表达框，最终在AvrII和SpeI之间，插入合成的3×flag(5′-GACTACAAGGATGACGATGACAAGGGCGCCGATTATAAAGATGACGATGACAAGCAATTGGACTATAAGGACGATGACGATAAATCTAGA-3′)。

实施例3 Brbgr和BrBGR对油菜株型的影响

将BrBGR和Brbgr通过LR重组反应构建到pHZM137-BrBGRpro上。将载体利用热激法转化农杆菌(GV3101)，通过下胚轴侵染法转化甘蓝型油菜(Westar)，转化方法参照Block等人的方法，观察BrBGR和Brbgr表达对甘蓝型油菜株型的影响。

转基因甘蓝型油菜的表型观察：利用BrBGR的自身启动子驱动Brbgr会使甘蓝型油菜植株显著变矮、叶片皱缩、分枝角度变小；而转BrBGR的株系与野生型在外观性状没有显著差异(图2)。

可见，Brbgr在株高及分枝角度的改良中有着重要的功能。

实施例4白菜型油菜bgr基因对芸薹属植物的株型调控

在甘蓝型油菜(Brassica napus，AACC，2n＝38)和芥菜型油菜(Brassica juncea，AABB，2n＝36)中，都含有AA亚基因组。以白菜型油菜芥头2号矮化突变体bgr为父本，甘蓝型油菜浙油50、芥菜型油菜FY02(中国科学院遗传发育生物学研究所植物细胞与染色体国家重点实验室保存材料)为母本，分别进行属内种间杂交，均可获得株型矮化、分枝紧凑的F1代株系(图3)。表明来源于AA基因组的bgr具有功能保守性。

实施例5具有理想株型特征的甘蓝型油菜新种质的获得

以甘蓝型油菜C76为母本，以芥头2号矮化突变体bgr-JT为父本，进行属内种间杂交，获得F1代种子；在F1后中选择株型紧凑、株高变矮的后代与甘蓝型油菜C76进行回交，在F1BC1的后代中选取株型紧凑、株高变矮的后代再与甘蓝型油菜C76进行回交。选取F1BC2的后代中株型紧凑、株高变矮的株系所产生的花蕾，进行小孢子培养，通过单倍体技术，获得了矮化、株型紧凑的甘蓝型油菜DH系材料—Bnbgr，如DHD1(图4)，同时也获得了高杆甘蓝型油菜DH株系，如DH56(图4)。

小孢子培养的流程如下：取大小为3mm的花蕾，75％乙醇浸泡30-60sec，8％次氯酸钠浸泡15min，灭菌纯水洗涤3-5遍；在研钵中，将花蕾研磨后，过滤；用NLN液体培养基(0.025mg/L六水氯化钴，0.025mg/L无水硫酸铜，36.7mg/L乙二胺四乙酸铁钠，10mg/L硼酸，18.95mg/L硫酸锰，0.25mg/L钼酸钠，10mg/L硫酸锌，500mg/L硝酸钙，125mg/L硝酸钾，125mg/L磷酸氢二钾，61mg/L硫酸镁，0.05mg/L生物素，0.5mg/L叶酸，800mg/L谷氨酰胺，30mg/L还原型L-谷胱甘肽，2mg/L甘氨酸，100mg/L肌醇，5mg/L尼克酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，100mg/L L-丝氨酸，0.5mg/L盐酸硫胺素)洗涤，4℃2000rpm离心，重复3次；最终用NLN液体培养基悬浮，至小孢子浓度控制在10

实施例6甘蓝型油菜bgr的农艺性状

经过我们多年在北京昌平农场种植观察，Bnbgr株型稳定，叶片皱缩，株高在50cm左右，主分枝为5-6枝，分枝角度在15°左右(图5)，角果短，每角果粒数5-25粒。

与对照相比C76，甘蓝型油菜突变体bgr在株高、分枝角度、分枝数、单株生物产量、单株产量，分别降低63.57％-64.15％、46.66％-63.98％、11.36％-53.64％、51.22％-56.17％和39.89％-62.08％。但收获指数、角果密度、主花序角果数和总角果数分别提高23.22％-33.22％、251.04％-395.46％、90.07％-100.94％和37.25％-74.13％。

实施例7甘蓝型油菜Bnbgr的遗传特性

将矮杆甘蓝型油菜Bnbgr株系DHD1与高杆材料DH56(株高170cm左右)进行正反交，发现其后代株型紧凑、株高矮化，表现一致。由此可以判断该性状为非母性遗传。F2代群体的性状分离统计结果表明：矮化型:中间型:高秆型的分离比为98:238:86，卡方检验表明符合孟德尔单基因遗传规律1:2:1，确定该表型是由单基因控制。由此可证明bgr为单基因控制的不完全显性(半显性)遗传。

实施例8甘蓝型油菜Bnbgr株系体内激素的变化

为分析突变体体内激素的变化，对矮杆Bnbgr株系DHD1和高杆DH56株系苗期及顶端分生组织的油菜素内酯(Brassinolide,BL)、油菜甾酮(Castasterone,CS)、6-deoxoCT(6-deoxocathasterone)、香蒲甾醇(typhasterol,TY)、茶甾酮(Teasterone,TE)的含量变化进行了检测。首先，取萌发3-5天的幼苗或顶端分生组，在液氮中速冻，并将其磨碎，分装后放置于-80℃备用。测定方法参照方法Xin。

结果表明，无论在苗期还是在顶端分生组织，除TE未检出外，BL、CS、TY及6-deoxoCT的含量与甘蓝型油菜DH56相比，都大幅度提高(图6)。

同时，我们对矮杆Bnbgr株系DHD1和高杆DH56株系顶端分生组织中的水杨酸(Salicylic acid,SA)、赤霉素A1(Gibberellin A1,GA1)、赤霉素A3(Gibberellic A3,GA3)、赤霉素A4(Gibberellin A4,GA4)、赤霉素A7(Gibberellin A7,GA7)、吲哚乙酸(3-Indoleacetic Acid,IAA)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)、茉莉酸-异亮氨酸(Jasmonic Acid-Isoleucine，JA-Ile)、氨基环丙烷羧酸(aminocyclopropane-l-carboxylic acid，ACC)、反玉米素(Trans-Zeatin,tZ)和反玉米素核苷(Trans-Zeatin-riboside,tZR)进行了测定。

结果表明，与DH56相比，DHD1中ACC、ABA和GA7的含量显著升高；而IAA、GA4、SA、JA和JA-Ile的含量显著降低；而tZ、tZR及GA3的含量没有显著变化(图7)。

实施例9甘蓝型油菜新种质Bnbgr基因组的从头组装

矮化、分枝紧凑甘蓝型油菜Bnbgr株系DHD1是通过远缘杂交结合小孢子培养获得的育种材料，其基因的排列及染色体结构与现有的甘蓝型油菜的可能存在较大的差异。利用PacBio公司提供的CCS(Circular Consensus Sequencing)测序模式和HiC技术，对其基因组进行了从头组装。共计获得组装的基因组大小为1063158305bp，Contig N50为10122184bp，总共的contig为2006个，且contig占基因组的比例为99.99％。利用BUSCO(Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs：http://busco.ezlab.org/)，通过真双子叶植物的2121个单拷贝基因评估，得到甘蓝型油菜基因组的完整比例为99.9％，完整度比较高。这为候选基因的定位提供了高质量的参照基因组。

实施例10甘蓝型油菜中BGR基因的克隆

为进一步确定矮杆、分枝紧凑甘蓝型突变体是否来源于白菜型的Brbgr，我们利用F2遗传分离群体(DHD1为父本，DH56为母本)，通过BSA的方法将进行了初步定位，并通过SSR方法进行了精细定位。最终将位于染色体A04的BnaA04T002134确定为候选基因Bnbgr。我们利用Bnbgr株系DHD1的基因组信息，利用1对引物(BnBGR.F和BnBGR.R)克隆了Bnbgr和BnBGR的基因组DNA序列和cDNA序列。方法参照实施例1。

引物BnBGR.F:agcaggctttgactttATGACCTCACTATCATTGGGGC(小写字母为载体上的接头)

引物BnBGR.R:tgggtctagagactttccATGACCAGGCTGTGATGG(小写字母为载体上的接头)

序列分析表明，矮杆分枝紧凑的甘蓝型油菜Bnbgr全长DNA序列与矮杆、分枝紧凑的白菜型油菜芥头2号Brbgr完全一致(SEQ ID NO:1)；高杆甘蓝型油菜BnBGR的基因组序列(gBnBGR)与高杆白菜型油菜芥头2号BrBGR全长DNA序列完全一致(SEQ ID NO:2)，高杆甘蓝型油菜BnBGR的基因组序列与矮杆分枝紧凑的甘蓝型油菜Bnbgr全长DNA序列在2191位置发生了一个单碱基变化，即由G转换为A。

矮杆分枝紧凑的甘蓝型油菜DHD1的Bnbgr的CDS序列与高杆甘蓝型油菜DH56的BnBGR的CDS序列与只有一个位点差异，即877位置由G转换为A。

矮杆分枝紧凑的甘蓝型油菜DHD1的Bnbgr的cDNA序列与矮杆、分枝紧凑的白菜型油菜芥头2号Brbgr完全一致(SEQ ID NO:3)；高杆甘蓝型油菜DH56的BnBGR的cDNA序列与高杆白菜型油菜芥头2号BrBGR的cDNA序列完全一致(序列BrBGR，SEQ ID NO:5)。

实施例11bgr的功能分析

以甘蓝型油菜Bnbgr株系DHD1为受体材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，评价bgr基因对油菜株型的影响。具体步骤如下：

一、bgr基因编辑载体的构建

1、以bgr及BGR的DNA序列为模版，利用CRISPOR v4.99(http://crispor.tefor.net)分别在第3外显子(965-984bp)和第4个外显子(1133-1152bp)上设计2个特异性的sgRNA：

K1：ATTAGTTACATGGCGGAAC

K2：GAATCTGTAGCCATTAAGA

2、sgRNA K1和K2的引物如下：

K1.F：attgATTAGTTACATGGCGGAAC

K1.R：aaacGTTCCGCCATGTAACTAAT

K2.F：attgGAATCTGTAGCCATTAAGA

K2.R：aaacTCTTAATGGCTACAGATTC

其中，小写字母为载体上的序列。

3、载体组装

将合成的K1或K2，分别稀释到10μM；将K1.F和K1.R或K2.F和K2.R分别等量混合，98℃，5min，然后每分钟降低2℃，至37℃。将载体pHZM184B(图8)用BsaI酶切：pHZM184B 8μL(共计1.6μg)，BsaI 1μL，CutSmart buffer 1μL，37℃酶切1hr，65℃灭活10min。之后用T4ligase连接：4μL酶切的pHZM184B，4μL K1或K2的退火产物，1μL 10×NEB T4 Buffer，1μLT4 ligase，16℃反应2hr。然后转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定，测序后正确的保存，分别命名为gK1和gK2(图8)。

pHZM184B载体的构建方法如下：Cas9(由中国科学院遗传与发育生物学所谢旗研究员惠赠)序列插入载体pHZM137的XhoI和PacI；再将来源于载体pHSE401(由中国农业大学生物学院陈其军教授惠赠)的sgRNA表达插入到EcoR1和StuI之间。

pHES401的文献(Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.BMCPlant Biol.2014Nov 29；14:327.doi:10.1186/s12870-014-0327-y.PMID:25432517；PMCID:PMC4262988.)

二、油菜的遗传转化

1、利用热激法转化农杆菌GV3101，通过PCR鉴定，获得含有靶标质粒的单克隆。

2、油菜的遗传转化。利用下胚轴侵染法转化矮化分枝紧凑甘蓝型油菜Bnbgr株系DHD1及野生型甘蓝型油菜Westar。在Bnbgr背景下，K1和K2编辑位点分别得到14株和15株转基因株系；在Westar背景下，分别得到2株和5株转基因株系。

三、基因敲除突变类型及表型的分析

以编辑位点K1或K2为中心，以基因组DNA为模版，设计引物扩增250-300bp DNA片段。引物如下(5′-3′)：

K1-F:GAACCTAAACAGGTTTGAGTTCC

K1-R:GATAACAGCGAGTGAAAAGCAC

K2-F:CACTCGCTGTTATCATTTGTAG

K2-R:GAGCTCATCTCTACTCGTAGTAG

提取转基因材料的DNA，通过PCR扩增，获得目标片段，经过PCR回收，并建库，通过2代测序双端测序，确定编辑靶点的编辑类型。

检测结果表明，在DHD1中，K1和K2位点，我们获得了bgr的敲除突变体。从表型来看，所有bgr缺失突变体的株高都有恢复，分枝角度变大，叶片不再皱缩(图9)。

在Westar背景下，K1和K2位点，都获得了敲除突变体，但所有BGR缺失编辑突变体都没有可见表型。

上述结果进一步证实了bgr能够使植株矮化、分枝紧凑、叶子皱缩等功能。

实施例12甘蓝型油菜中Bnbgr的同源基因都具有调控油菜株型的功能

从Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)中下载油菜、拟南芥、水稻、玉米、大豆、葡萄及莱茵衣藻的基因组序列，再结合组装的甘蓝型油菜突变体DHD1株系的基因组，通过Orthofinder分析，我们获得了甘蓝型油菜DHD1位于染色体A04染色体上Bnbgr(BnaA04T002134)的同源基因，共有7个，它们在染色体A01(BnaA01T000997)、A03(BnaA03T004751)、A08(BnaA08T002216)、C03(BnaC03T001151)和C07(BnaC07T004394)染色体上各有一个拷贝，而在C04染色体上有2个拷贝(BnaC04T001741和BnaC04T005325)。为了分析不同拷贝在bgr特定位点的突变在调控油菜株型的功能是否具有保守性，比较分析了上述剩余7个拷贝特定位点突变体的功能。

1、矮化甘蓝型油菜DHD1中不同BGR/bgr拷贝CDS的克隆

以全基因组序列中不同拷贝的序列为模板，设计引物如下所示，以cDNA为PCR的模板，将其克隆到入门载体pGWC上。实验方法参照实施例1。

BnaA01T000997.F:agcaggctttgactttATGGCTGACGATAGGGAGATGCCG(小写字母为载体上的接头)

BnaA01T000997.R:tgggtctagagactttccAGTTCCAGACTGATTCAAGAAGCT(小写字母为载体上的接头)

BnaA03T004751.F:agcaggctttgactttATGGCTGACGATAAGGAGATGCCG(小写字母为载体上的接头)

BnaA03T004751.R:tgggtctagagactttccAGTTCCAGACTGATTCAAGAAACT(小写字母为载体上的接头)

BnaA08T002216.F:agcaggctttgactttATGGCTGACGATAAGGAGGTGCCG(小写字母为载体上的接头)

BnaA08T002216.R:tgggtctagagactttccAGTTCCAGACTGATTCAAGAAACT(小写字母为载体上的接头)

BnaC03T001151.F:agcaggctttgactttATGGCTGACGATAAGGAGGTGCCT(小写字母为载体上的接头)

BnaC03T001151.R:tgggtctagagactttccAGTTCCAGACTGATTCAAGAAACT(小写字母为载体上的接头)

BnaC07T004394.F:agcaggctttgactttATGGCTGCCGATAAGGAGATGCCA(小写字母为载体上的接头)

BnaC07T004394.R:tgggtctagagactttccAGTTCCAGACTGATTCAAGAAACT(小写字母为载体上的接头)

BnaC04T001741.F:agcaggctttgactttATGACATCCTCCATACCATTGGGT(小写字母为载体上的接头)

BnaC04T001741.R:tgggtctagagactttccATGACCAGCTTGTAATGGAAAGCC(小写字母为载体上的接头)

BnaC04T005325.F:agcaggctttgactttATGACATCACTATCATTGGGCCCT(小写字母为载体上的接头)

BnaC04T005325.R:tgggtctagagactttccATGACCAGGCTGTGATGGGAAGCC(小写字母为载体上的接头)

BnaA01T000997的CDS序列如SEQ ID NO:8所示，BnaA01T00099编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。BnaA03T004751的CDS序列如SEQ ID NO:10所示，BnaA03T004751编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。BnaA08T002216的CDS序列如SEQ ID NO:12所示，BnaA08T002216编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。BnaC03T001151的CDS序列如SEQID NO:14所示，BnaC03T001151编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。BnaC07T004394的CDS序列如SEQ ID NO:16所示，BnaC07T004394编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。BnaC04T001741的CDS序列如SEQ ID NO:18所示，BnaC04T001741编码的氨基酸序列如SEQID NO:19所示。BnaC044T005325的CDS序列如SEQ ID NO:20所示，BnaC044T005325编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

2、定点突变

根据不同物种来源的蛋白序列比对分析(图10)，我们发现BGR突变位点位于保守基序LGTPTRE中，该基序在动物和植物中都是保守的。

我们利用定点突变技术，分别将BnaA01T000997、BnaA03T004751、BnaA08T002216、BnaC03T001151、BnaC04T001741、BnaC04T005325和BnaC07T004394的CDS序列中的787、787、787、787、880、877和787的核苷酸G突变为核苷酸A。编码的对应氨基酸由E突变为K，进而获得不同的拷贝CDS突变体，分别命名为mBnaA01T000997、mBnaA03T004751、mBnaA08T002216、mBnaC03T001151、mBnaC04T001741、mBnaC04T005325和mBnaC07T004394。

甘蓝型油菜不同拷贝CDS的定点突变的引物如下：

BnaA01T000997、BnaA03T004751、BnaA08T002216、BnaC03T001151和BnaC07T004394定点突变的引物同为(5′-3′)：

m01.F:ACCAACTCGAaAAGAGATCCG

m01.R:CGGATCTCTTtTCGAGTTGGT

BnaC04T001741和BnaC04T005325的定点突变引物分别为(5′-3′)：

mBnaC04T001741.F:TCCAACTCGAaAAGAGATCAG

mBnaC04T001741.R:CTGATCTCTTtTCGAGTTGGA

mBnaC04T005325.F:TCCAACTCGAaAAGAAATCCG

mBnaC04T005325.R:CGGATTTCTTtTCGAGTTGGA

其中，小写字母为突变碱基。

定点突变PCR体系：含有目标基因的1μL质粒(100ng/μL)，10μL

PCR程序：98℃3min；98℃10sec,60℃10sec,72℃2min,25个循环；72℃5min。

PCR产物酶切处理：1μL DpnI，1μL CutSmart，8μL PCR产物，37℃孵育2hr。

基因突变的检测：将酶切后的PCR产物转化大肠杆菌DH5α，随机挑取克隆，测序鉴定，选出定点突变的克隆。

mBnaA01T000997，突变的BnaA01T000997的CDS序列如SEQ ID NO:22所示，mBnaA01T000997编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。mBnaA03T004751，突变的BnaA03T004751的CDS序列如SEQ ID NO:24所示，mBnaA03T004751编码的氨基酸序列如SEQID NO:25所示。mBnaA08T002216，突变的BnaA08T002216的CDS序列如SEQ ID NO:26所示，mBnaA08T002216编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。mBnaC03T001151，突变的BnaC03T001151的CDS序列如SEQ ID NO:28所示，mBnaC03T001151编码的氨基酸序列如SEQID NO:29所示。mBnaC04T001741，突变的BnaC04T001741的CDS序列如SEQ ID NO:30所示，mBnaC04T001741编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。mBnaC04T005325，突变的BnaC04T005325的CDS序列如SEQ ID NO:32所示，mBnaC04T005325编码的氨基酸序列如SEQID NO:33所示。mBnaC07T004394，突变的BnaC07T004394的CDS序列如SEQ ID NO:34所示，mBnaC07T004394编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。

3、甘蓝型油菜不同拷贝突变体的功能分析

将不同拷贝的突变体，通过LR重组，重组到pHZM137-BrBGRpro上。转化农杆菌后，进行油菜(Westar)的遗传转化。获得转基因株系并分析表型。

从表型上看，所有不同基因突变体的转基因材料均与转bgr植株表型类似，即植株矮化，分枝紧凑，叶子皱缩(图11)。这表明油菜这些同源基因编码的蛋白其保守基序LGTPTRE中的E突变为K，突变后的蛋白对于调控甘蓝型油菜的株型是保守的，均能使甘蓝型油菜植株矮化，株型紧凑。不同拷贝BnaA01T000997、BnaA03T004751、BnaA08T002216、BnaC03T001151、BnaC04T001741、BnaC04T005325和BnaC07T004394LGTPTRE基序中E突变为K，可以实现甘蓝型油菜株型的调控。

实施例13通过引导序列编辑实现定点突变

1、引导序列编辑的人工合成及载体构建

以BnBGR(5′-GAgAAGAAATCCGATGCATG-3′，g为靶标突变位点)为靶点，参照Jiang等人的方法设计并合成引导编辑序列，并将其构建到pZ1WS载体上(由中国农业大学陈启军教授惠赠)，得到pZ1WS-PEbgr(图12)。构建方法参照实施例11。

引导编辑序列如下(5′-3′)(SEQ ID NO:36)：

其中，粗体部分，gRNA；波浪线，scofford RNA；单下划线，反转录的模版；双下划线，PBS(primer binding site)；小写字母，HDV(ribozyme from hepatitis deltavirus)。

2、油菜的遗传转化

以westar为受体材料，进行遗传转化，方法参照实施例3。

3、表型分析

westar基因编辑后代出现了植株矮化，株型紧凑，分枝变小的表型，与前述的DHD1和转bgr植株表型类似。将这些基因编辑材料，进行分析发现westar的编辑靶标位点已有G突变为A。由此可知，该位点的突变体可以通过引导序列编辑获得。

实施例14甘蓝型油菜Bnbgr具有明显的杂种优势

1、二倍体白菜型油菜突变体bgr-JT育种评估

利用白菜型油菜纯合突变体与黄籽沙逊杂交所得的F1代种种子，评估bgr-JT在二倍体杂交育种中的潜力，结果发现，纯合突变体bgr-JT为极度矮化，育性差；F1的株高介于野生型和突变体之间，且分枝紧凑。从单株考种结果来看：与野生相比，F1的株高降低约30％左右，角果长度减少30％左右，角果籽粒数降低30％左右，单株产量降低50％左右；角果密度显著增加60％左右。

由此可知，在二倍体背景下，该基因在提高白菜型油菜材料的产量方面没有潜力。

2、在四倍体甘蓝型突变体育种潜力评估

以上述获得的甘蓝型油菜bgr为母本与甘蓝型油菜(C76)杂交，获得杂种F1，杂种F1具有显著的杂种优势。

单株性状分析：杂种F1株高120.57±8.56cm，分枝角度小于30°。数据显示：与父本相比，F1在株高、初分枝高度和节间距都显著降低，分别减少30.10±2.91％，64.29±13.64％和43.76±13.17％；分枝数(一次有效分枝)、单株角果数及单株产量都显著高于父本，分别提高42.86±13.67％，49.09±9.18％和45.34±6.44％；生物量与父本相比无显著差异，但收获指数显著高于父本，提高了30.77±3.18％。

由此可知，在四倍体背景下，该基因具有育种潜力。为此，我们又进行了甘蓝型油菜F1杂交种产量分析：甘蓝型油菜bgr可作为油菜细胞质雄性不育系统的保持系，将CMS不育系50A(母本)与bgr株型(父本)杂交，然后用bgr连续回交5代，获得不育系bgrA。

将BnbgrA与甘蓝型油菜恢复系(PM112)杂交，配制成F1杂交种，2021年10月份在分别在云南罗平和陕西杨陵两个地方测定杂交种的生产能力。并于2022年5月份收获，测试结果如下：

在陕西杨凌种植面积74.4m

在云南罗平进行了大面积生产示范，于2022年5月份收获，种植面积656.6m

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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