确定人群中SARS-CoV-2的患病率的系统和方法

摘要

提供了一种系统，该系统被配置为确定液体样本中预定抗原的载量。该系统包括被配置为在其中接收液体样本的测量室、传感器电路和分析单元。传感器电路包括多于一个工作电极、至少一个参比电极和至少一个对电极，每个工作电极在其表面上包括与预定抗原之一相关联的抗体。电极的近端设置在传感器电路的读取区上，读取区设置在测量室内。分析单元被配置为通过测量电极的电气特性来促进确定每种抗原的载量。

说明书

技术领域

本发明公开的主题涉及用于确定人群中SARS-CoV-2的患病率的方法，以及用于执行此类方法的系统。

背景

为了管理大流行病或其他爆发，卫生主管部门需要得到关于疾病传播的当前信息的帮助。虽然对个体进行单独检测可以提供这种信息，但获得合适地代表不同位置的数据集(特别是同一人群随时间变化的多于一个数据集)通常是不切实际的。

基于废水的流行病学是一种获得关于疾病传播的位置特定信息的方法。收集废水的样本并对样本测试病原体的存在和载量(load)。基于该信息，并考虑到每个样本被获取的位置，主管部门可以获得疾病传播的大致情况，而不需要对个体执行检测。

概述

根据本发明公开的主题的一个方面，提供了一种系统，该系统被配置为确定液体样本中多于一种预定抗原中的每一种的载量，预定抗原中的至少一种与SARS-CoV-2的变体相关联，该系统包括：

测量室，该测量室被配置为在其中接收液体样本，测量室被设置在入口和出口之间，该入口设置在测量室的上游并具有粗过滤器，该出口设置在测量室的下游并具有细过滤器，其中粗过滤器允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过，而细过滤器不允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过；

传感器电路，该传感器电路包括多于一个工作电极、至少一个参比电极(reference electrode)和至少一个对电极(counter electrode)，每个工作电极在其表面上包括与预定抗原之一相关联的抗体，电极的近端设置在传感器电路的读取区上，读取区设置在测量室内；和

分析单元，该分析单元被配置为通过测量电极的电气特性(electricalproperties)来促进确定每种抗原的载量。

将理解，在本文中，本说明书和所附的权利要求对抗原数量的引用(例如，“多于一种预定抗原(a plurality of predetermined antigens)”)指的是抗原类型的数量，而不是单独的分子和/或分子结构的数量，除非从上下文中另有明确规定。

该系统还可以包括在入口上游的混合室，该混合室被配置在其中接收液体样本以与缓冲溶液混合。

混合室可以被配置为在其中注入缓冲溶液。

缓冲溶液可以是缓冲的盐溶液(saline solution)。

缓冲溶液可以构成氧化还原对(redox couple)。

分析单元可以被配置为测量传感器电路的频率响应。

分析单元可以包括恒电位仪电路(potentiostat circuit)。

工作电极可以由金制成。

每个参比电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

每个对电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

参比电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。

与单个参比电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

对电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。与单个对电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

预定抗原中的一种或更多种可以包括SARS-CoV-2包膜子粒(peplomer)的S1亚基(submit)。

预定抗原中的一种或更多种可以包括SARS-CoV-2包膜子粒的S2亚基。

预定抗原中的一种或更多种可以是全病毒抗原(whole-virus antigen)。

该系统还可以被配置为确定液体样本中与SARS-CoV-2以外的病原体相关联的一种或更多种预定抗原的载量。

预定抗原中的至少两种可以与SARS-CoV-2的不同变体相关联。

根据本发明公开的主题的另一方面，提供了一种系统，该系统被配置为确定液体样本中多于一种预定抗原中的每一种的载量，该系统包括：

测量室，该测量室被配置为在其中接收液体样本；

传感器电路，该传感器电路包括多于一个工作电极、至少一个参比电极和至少一个对电极，每个工作电极在其表面上包括与预定抗原之一相关联的抗体，电极的近端设置在传感器电路的读取区上，读取区设置在测量室内；和

分析单元，该分析单元被配置为通过测量电极的电气特性来促进确定每种抗原的载量。

测量室可以设置在入口和出口之间，该入口设置在测量室的上游并具有粗过滤器，该出口设置在测量室的下游并具有细过滤器，其中粗过滤器允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过，而细过滤器不允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过。

该系统还可以包括在入口上游的混合室，该混合室被配置在其中接收液体样本以与缓冲溶液混合。

混合室可以被配置为在其中注入缓冲溶液。

缓冲溶液可以是缓冲的盐溶液。

缓冲溶液可以构成氧化还原对。

分析单元可以被配置为测量传感器电路的频率响应。

分析单元可以包括恒电位仪电路。

工作电极可以由金制成。

每个参比电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

每个对电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

参比电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。

与单个参比电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

对电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。与单个对电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

预定抗原中的一种或更多种可以包括包膜子粒的S1亚基。根据一些示例，包膜子粒是SARS-CoV-2包膜子粒。

预定抗原中的一种或更多种可以包括包膜子粒的S2亚基。根据一些示例，包膜子粒是SARS-CoV-2包膜子粒。

预定抗原中的一种或更多种可以是全病毒抗原。

多于一种预定抗原中的至少两种可以与不同的病毒相关联。

多于一种预定抗原中的至少两种可以与同一病毒的不同变体相关联。

预定抗原中的至少一种可以与SARS-CoV-2的变体相关联。

根据本发明公开的主题的另一方面，提供了一种系统，该系统被配置为确定液体样本中与SARS-CoV-2的变体相关联的至少一种预定抗原的载量，该系统包括：

测量室，该测量室被配置为在其中接收液体样本；

传感器电路，该传感器电路包括多于一个工作电极、至少一个参比电极和至少一个对电极，每个工作电极在其表面上包括与预定抗原之一相关联的抗体，电极的近端设置在传感器电路的读取区上，读取区设置在测量室内；和

分析单元，该分析单元被配置为通过测量电极的电气特性来促进确定每种抗原的载量。

测量室可以设置在入口和出口之间，该入口设置在测量室的上游并具有粗过滤器，该出口设置在测量室的下游并具有细过滤器，其中粗过滤器允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过，而细过滤器不允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过。

该系统还可以包括在入口上游的混合室，该混合室被配置在其中接收液体样本以与缓冲溶液混合。

混合室可以被配置为在其中注入缓冲溶液。

缓冲溶液可以是缓冲的盐溶液。

缓冲溶液可以构成氧化还原对。

分析单元可以被配置为测量传感器电路的频率响应。

分析单元可以包括恒电位仪电路。

工作电极可以由金制成。

每个参比电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

每个对电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

参比电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。

与单个参比电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

对电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。与单个对电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

预定抗原可以包括SARS-CoV-2包膜子粒的S1亚基。

预定抗原可以包括SARS-CoV-2包膜子粒的S2亚基。

预定抗原可以是全病毒抗原。

该系统可以被配置为确定液体样本中多于一种预定抗原中的每一种的载量。

该系统还可以被配置以确定液体样本中与SARS-CoV-2以外的病原体相关联的一种或更多种预定抗原的载量。

预定抗原中的至少两种可以与SARS-CoV-2的不同变体相关联。

根据本发明公开的主题的另一方面，提供了一种系统，该系统被配置为确定液体样本中至少一种预定抗原的载量，该系统包括：

测量室，该测量室被配置为在其中接收液体样本，测量室被设置在设置入口和出口之间，该入口设置在测量室的上游并具有粗过滤器，该出口设置在测量室的下游并具有细过滤器，其中粗过滤器允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过，而细过滤器不允许与预定抗原相关联的病原体从其中通过；

传感器电路，该传感器电路包括多于一个工作电极、至少一个参比电极和至少一个对电极，每个工作电极在其表面上包括与至少一种预定抗原之一相关联的抗体，电极的近端设置在传感器电路的读取区上，读取区设置在测量室内；和

分析单元，该分析单元被配置为通过测量电极的电气特性来促进确定每种抗原的载量。

该系统还可以包括在入口上游的混合室，该混合室被配置在其中接收液体样本以与缓冲溶液混合。

混合室可以被配置为在其中注入缓冲溶液。

缓冲溶液可以是缓冲的盐溶液。

缓冲溶液可以构成氧化还原对。

分析单元可以被配置为测量传感器电路的频率响应。

分析单元可以包括恒电位仪电路。

工作电极可以由金制成。

每个参比电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

每个对电极可以唯一地与工作电极之一相关联。

参比电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。

与单个参比电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

对电极中的至少一些可以与多于一个工作电极相关联。与单个对电极相关联的多于一个工作电极可以包括彼此相同的抗体。

预定抗原中的一种或更多种可以包括包膜子粒的S1亚基。根据一些示例，包膜子粒是SARS-CoV-2包膜子粒。

预定抗原中的一种或更多种可以包括包膜子粒的S2亚基。根据一些示例，包膜子粒是SARS-CoV-2包膜子粒。

预定抗原中的一种或更多种可以是全病毒抗原。

该系统可以被配置为确定液体样本中多于一种预定抗原中的每一种的载量。

多于一种预定抗原中的至少两种可以与不同的病毒相关联。

多于一种预定抗原中的至少两种可以与同一病毒的不同变体相关联。

预定抗原中的至少一种可以与SARS-CoV-2的变体相关联。

根据本发明公开的主题的另一方面，提供了一种监测人群中SARS-CoV-2的患病率的方法，该方法包括提供一个或更多个根据上述任何方面的系统，并执行测量，该测量包括：

从预定位置获得由人群的至少一部分生成的废水的液体样本；

使用该系统确定液体样本中与SARS-CoV-2相关联的一种或更多种抗原的载量；和

将抗原的载量与人群中SARS-CoV-2的患病率相关。

该方法还可以包括监测SARS-CoV-2的不同毒株(strain)的患病率。

患病率可以是相对患病率。

该方法还可以包括在多于一个位置处执行测量。

该方法还可以包括在同一位置处多于一次执行测量。

该系统可以被配置为自主地确定一种或更多种抗原的载量。

该系统可以被配置为将与所确定的抗原载量相关的信息发送到远程位置。

附图简述

为了更好地理解本文中所公开的主题并且举例说明如何可以在实践中执行该主题，现在将参考附图仅通过非限制性示例的方式来描述实施方式，在附图中：

图1示意性地示出了用于确定液体样本中SARS-CoV-2的载量的根据本发明公开的主题的系统；

图2示意性地示出了根据图1示出的系统的一些示例的传感器电路的读取区的一部分；

图3示意性地示出了根据图1示出的系统的一些示例的恒电位仪电路；

图4是表示图1示出的系统的工作电极的频率响应的奈奎斯特图(Nyquist plot)的示例；和

图5示出了监测人群中SARS-CoV-2的患病率的方法。

详细描述

如图1所示，提供了一种系统，该系统概括地以10来表示，该系统被配置用于确定液体样本中与严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(下文为SARS-CoV-2)相关联的一种预定抗原或多于一种预定抗原的载量。根据一些示例，该抗原包括SARS-CoV-2包膜子粒(即刺突蛋白)的至少一部分(例如其S1亚基和/或S2亚基)。根据一些示例，该抗原是全病毒抗原。

将理解，本文中确定SARS-CoV-2的载量的描述是作为非限制性示例提供的，并且根据一些示例，系统10可以被配置为确定其他病毒的载量(例如，除SARS-CoV-2的载量之外的病毒载量)。因此，根据本发明公开的主题的系统10可以被配置为确定单个液体样本中多于一种预定抗原中的每种预定抗原的相应载量，其中的一些或全部与SARS-CoV-2不相关联。还将理解，本文中对确定抗原载量的系统10的描述仅是为了方便，并且这种描述除其他事物外，包括确定多于一种抗原中的每种抗原的相应载量，除非根据上下文另有明确规定(经过必要的修正(mutatis mutandis))。

系统10还可以被配置为确定和/或帮助确定SARS-CoV-2和/或其他病原体在社区中的患病率和/或传播速度(例如基于对该社区的废水执行的测量)。

系统10包括采样单元12和分析单元14，该采样单元12被配置为与液体样本物理交互。根据一些示例，例如，如下文将进一步描述的，采样单元12被配置为重复性地和选择性地与分析单元14配合(mate)和断开，从而允许单个分析单元与多于一个采样单元配合(每个依次进行)。根据其他示例，采样单元12和分析单元14被提供为单个集成设备。

采样单元12包括测量室16，该测量室16被配置为在其中接收液体样本。根据一些示例，测量室16设置在入口18和出口20之间，该入口18用于通过其中引入液体样本，该出口20用于使液体通过其中排出(egress)。为了对液体样本执行初始提纯，可以在入口18内提供额定尺寸大于SARS-CoV-2病毒粒子的粗过滤器22，以及可以在出口20处提供额定尺寸小于SARS-CoV-2病毒粒子的细过滤器24。

估计SARS-CoV-2病毒粒子直径尺寸范围在50nm-200nm之间；因此，粗过滤器22可以是额定300nm的过滤器，而细过滤器24可以是额定50nm的过滤器。因此，由于其尺寸可能太大而不可能是SARS-CoV-2病毒粒子的颗粒(particle)被阻止进入测量室16。此外，在测量室16中的颗粒中，只有由于其尺寸可能太小而不可能是SARS-CoV-2病毒粒子的那些颗粒被允许离开测量室。

采样单元12还可以包括在测量室16的入口18上游的混合室26。混合室被配置为经由样本入口28在其中接收液体样本，并通过缓冲液入口30在其中接收缓冲溶液。测量室16的入口18构成混合室26的出口。

缓冲溶液可以被配置为将液体样本稀释到预定的程度。此外，它可以是盐溶液(例如构成氧化还原对)。

缓冲溶液可以与SARS-CoV-2病毒粒子等渗，例如促进保持其完整性。缓冲溶液可以具有生理范围内的pH，例如，具有大约7.3和大约7.5之间的pH。

根据一些示例，缓冲溶液可以是但不限于磷酸盐缓冲盐水或HEPES缓冲溶液。

根据一些示例，液体样本被引入到通过样本入口28插入的拭子(未示出)上。

根据一些示例，使用注射器32通过缓冲液入口30提供缓冲溶液。由注射器32提供的将缓冲溶液注入混合室26中的压力可以同时迫使缓冲溶液-液体样本混合物通过测量室16的入口18进入测量室16。

采样单元12还可以包括一个或更多个传感器电路34，这些传感器电路34各自具有设置在测量室16内的其读取区36，从而促进由此测量液体样本。

每个传感器电路34包括一个或更多个工作电极38，这些工作电极38各自包括针对SARS-CoV-2的抗体(例如，被针对SARS-CoV-2的抗体生物功能化)，如下文将进一步论述的。每个工作电极38可以包括针对SARS-CoV-2的单个变体、针对SARS-CoV-2的多于一个变体(例如，如下所示)和/或针对一个或更多个SARS-CoV-2变体和至少一个其他病原体的抗体。根据一些示例，抗体包括单克隆抗体(mAb)和/或多克隆抗体。工作电极可以由金制成。

传感器电路34还包括一个或更多个参比电极40，这些参比电极40各自与工作电极38中的一个或更多个相关联。传感器电路34还包括一个或更多个对电极42，这些对电极42各自与工作电极38中的一个或更多个相关联。电极38、40、42中的每一个的近端延伸到读取区36中。

根据其他示例，例如，如图2所示，每个传感器电路34包括多于一个工作电极38、一个或更多个参比电极40和一个或更多个对电极42。单个传感器电路34中的所有工作电极38可以包括针对SARS-CoV-2的同一变体的抗体。根据一些修改，单个电路可以包括多于一个工作电极38，其中至少一些工作电极38包括不同于其他工作电极的针对变体的抗体，例如，一些工作电极可以包括针对B.1.1.7谱系(根据PANGO命名法；通常称为“英国变体”)的抗体，同一传感器电路34中的一些工作电极可以包括针对B.1.351谱系(通常称为“南非变体”)的抗体，传感器电路中的一些工作电极可以包括P.1谱系(通常称为“巴西变体”)的抗体，等等。

根据进一步的修改，一些单独的工作电极38可以包括针对SARS-CoV-2不同变体的抗体混合物，而同一传感器电路34中的不同工作电极可以包括其不同组合。

根据一些示例，每个参比电极40唯一地与相应的工作电极38之一相关联，即，工作电极和参比电极之间存在一对一的关系。

根据其他示例，参比电极40中的至少一些与多于一个工作电极38相关联。在这种情况下，与单个参比电极相关联的工作电极38的电气特性可以使用相同的电气参数同时测量(例如如下所述)，或者同时测量。根据一些修改，与单个参比电极40相关联的所有工作电极被类似地生物功能化，即，它们包括对应于与跟同一参比电极相关联的其他工作电极相同的抗原的抗体。

根据一些示例，单个对电极42与工作电极38中的几个或全部相关联；根据其他示例，每个对电极唯一地与工作电极之一相关联。

根据一些示例，传感器电路34包括单个工作电极38和单个参比电极40。

在工作电极38上提供抗体可以通过任何合适的方法来完成，其中一些方法是本领域已知的。这可以经由SARS-CoV-2衣壳特异性mAb的共价固定来完成。

根据一些示例，传感器电路34的灵敏度被校准(例如，通过设计配量(dosing)策略，例如，使用本领域已知的模型系统)。SARS-CoV-2衣壳特异性mAb可以用作生物识别元件。整合到工作电极38上的mAb然后可以被验证用于检测利用刺突蛋白或任何其他Sars-CoV-2抗原形成假型的模式病毒(pseudo-typed)(例如SARS-CoV-2刺突蛋白假型水泡性口炎病毒(VSV))和/或真实样本。根据一些示例，pVSV-ΔG-GFP质粒可以利用编码VSV核衣壳(N)、磷酸蛋白(P)和大聚合酶亚基(L)的质粒连同编码SARS-CoV-2包膜子粒的质粒来转染。

根据一些示例，可以使用利用SARS-CoV-2刺突蛋白形成假型的各种慢病毒载体(lentivirus vectors)作为模型。在不同的示例中，基于由S表达质粒组成的HIV-1骨架(backbone)和掺入萤光素酶报告基因的HIV-1包装系统，可以开发具有SARS-CoV-2感染特性的假型病毒模型。

mAb可以从商业来源获得，和/或可以例如使用噬菌体生物淘选与未经免疫的人(

分析单元14被配置为测量传感器电路26中的每一个的电气特性。根据一些示例，例如如图3所示，分析单元14可以包括恒电位仪电路44，该恒电位仪电路44连接到电极38、40、42中的每一个的远端。

如上所述，采样单元12可以被配置为重复性地和选择性地与分析单元14配合和断开，从而允许单个分析单元与多于一个采样单元配合(每个依次进行)。根据一些示例，分析单元14包括连接器(例如按照通用串行总线(USB)标准)，其中电极38、40、42的远端形成为连接器或与连接器电气接触，该连接器形成为与分析单元的连接器配合。根据一些修改，分析单元14被配置为与例如智能手机的便携式计算设备配对，以促进分析，例如如下所述。

恒电位仪电路44包括：输入源46，该输入源46被配置为以恒定电压提供电流；静电计48，该静电计48被配置为测量工作电极38和参比电极40之间的电压差；电流电压(I/E)转换器50，该电流电压(I/E)转换器50被配置为测量当传感器电路34的读取区36浸没在液体样本中时实现的电化学电池的电流；以及控制放大器52，该控制放大器52被配置为通过调整其输出来维持工作电极和参比电极之间的电压。由于恒电位仪是众所周知的，所以本领域普通技术人员将能够实现和操作恒电位仪电路44。

将理解，上面参考图3描述的以及如图3所示的恒电位仪电路44仅作为非限制性示例提供，并且本领域技术人员将认识到，可以采用其他电路设计来代替其以便实现所需要的测量。

在使用中，当例如携带目标抗原的病原体与工作电极38接触时，这些病原体与工作电极38结合，从而导致传感器电路34的阻抗变化。由于阻抗变化随结合到工作电极38的近端的病原体的量而改变，因此阻抗的变化可以与液体样本中的抗原载量相关联。

因此，分析单元14可以被配置为在传感器电路34已经暴露于液体样本预定时间量之后测量传感器电路34的频率响应。根据一些示例，预定时间量是大约十分钟。

分析单元14可以被配置为当传感器电路34暴露于液体样本和缓冲溶液中的氧化还原对时对传感器电路34执行法拉第电化学阻抗谱(faradaic electrochemicalimpedance spectroscopy)(例如，如本领域众所周知的)。奈奎斯特图(例如，如图4所示)可以用于在视觉上表示传感器电路34在不同频率处的阻抗的实部分量(Z

曲线A(由图4中的正方形描绘)表示其中工作电极38不包括任何抗体的传感器电路34的频率响应。曲线B(由图4中的圆形描绘)表示其中工作电极38已经利用抗体生物功能化的传感器电路34的频率响应。曲线C(由图4中的三角形描绘)表示其中工作电极38已经利用抗体生物功能化，并且已经暴露于具有已知抗原载量的液体样本的传感器电路34的频率响应。类似的曲线可以用于校准分析单元，使得可以准确地测量未知液体样本的抗原载量。

等效电子电路(例如Randles电路)可以用于对从电化学阻抗谱中获得的数据进行建模，例如，如本领域众所周知的。

如图5所示，方法100可以被提供以利用如上文参考图1至图4所述和如图1至图4所示的系统10，以监测人群中SARS-CoV-2的患病率。所测量的患病率可以是相对患病率，例如，SARS-CoV-2在人群的一个区域的患病率与SARS-CoV-2在人群的另一个区域的患病率相比大多少/低多少，SARS-CoV-2的患病率与较早的时间相比大多少/低多少，等等。

在该方法的步骤110中，在预定位置处从废水中获取已经由人群的至少一部分生成的液体样本，该预定位置与人群的该部分相关联。根据一些示例，预定位置是废水收集系统的分支，该分支仅服务于人群的相关部分。根据其他示例，预定位置是废水处理厂。将理解，液体样本可以从废水收集系统中的多于一个位置获取，以便获得关于人群的详细信息。

在该方法的步骤112中，系统10用于确定在每个位置处获取的液体样本中SARS-CoV-2抗原的载量。

根据一些示例，获得样本是手动执行的。因此，用户可以例如在拭子上获取样本，并将其插入系统10的混合室26中。可以注入合适的缓冲溶液，例如如上所述。缓冲溶液在混合室26中与液体样本混合，并进入测量室16。在经过合适的时间量(例如在大约10分钟和大约30分钟之间)之后，测量系统10的工作电极38的电气特性，例如如上所述。通过这种方式，可以确定液体样本中一种或更多种抗原的载量。

根据一些示例，系统10被配置为自主地执行测量。根据另外的示例，系统10被配置为将与所确定的抗原载量相关的信息发送到远程位置。该信息可以包括确定的载量，和/或直接从电极读取的数据，使得最终确定可以在远程位置处执行，例如考虑到执行的其他读数，例如同时在其他位置处、在其他时间在同一位置处等执行的读数。

在该方法的步骤114中，至少部分地基于在步骤112中确定的载量来确定人群中SARS-CoV-2的患病率。这可以使用任何合适的方式(例如使用本领域熟知的一种或更多种数学技术)来完成。

将认识到，本文描述的示例、实施方式、修改、选项等将被解释为包含性和非限制性的，即，在本文单独描述的两个或更多个示例等不被解释为彼此互斥或以任何其他方式进行限制，除非这被明确声明和/或另有明确规定。本发明所属领域的技术人员将容易理解，在不脱离本发明公开的主题的范围的情况下，可以进行许多变化、改变和修改(经过必要的修正)。