表达Cry1Da蛋白的转基因玉米事件ME240913的核酸分子，转基因细胞、植物和种子，其用途，植物产品，用于检测所述事件的方法、试剂盒和扩增子，以及生产转基因植物和防控鳞翅类害虫的方法

摘要

本发明涉及一种表达截短或修饰形式的Cry1Da杀虫蛋白的新的转基因玉米事件，其命名为事件ME240913。本发明涉及事件ME240913特有的核酸。还定义了用于检测事件ME240913的存在的引物、扩增子、方法和试剂盒。本发明还涉及含有所述事件的玉米植物、其用途、用于防控鳞翅类害虫的方法和组合物。本发明描述了一种显示出针对由鳞翅目(包括草地贪夜蛾)以及Cry1F抗性昆虫摄食引起的损伤的高水平植物保护的玉米事件。本发明的事件对草地贪夜蛾显示出高度毒性。

说明书

技术领域

本发明涉及植物分子生物学、植物转化和植物繁殖及害虫防控领域。更具体地讲，本发明涉及包含新转基因基因型的对鳞翅类害虫具有抗性的转基因玉米(玉蜀黍(Zeamays))植物、其用途、防控鳞翅类害虫的方法以及检测植物产品及其组合物中转基因玉米植物专有的核酸的存在的方法。

背景技术

基因工程技术的持续进步已使得可开发具有商业重要性的转基因植物，其含有可赋予这种植物期望的性状的感兴趣的异源基因。感兴趣的基因中有赋予植物对除草剂、环境胁迫、疾病和无脊椎动物害虫的抗性的基因。

在编码用于防控无脊椎动物害虫的蛋白的基因背景下，可提及源于革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的cry基因。天然存在于几种生境(包括土壤、叶面、谷物残留物、灰尘、水、植物物质和昆虫)中的所述细菌，具有在静止和/或孢子形成期期间形成蛋白晶体的固有特征。占总细胞蛋白20-30％的蛋白晶体或δ-内毒素(Boucias & Pendland，1998)可具有特异性杀虫特性，并且可具有各种形状，比如：双锥体、球形、矩形、立方形和不规则形。双锥体晶体比其他形状的晶体具有更高的毒性频率，特别是对鳞翅类。

具有杀虫作用的Cry蛋白的作用机制通常涉及目标昆虫中肠中晶体的溶解、昆虫肠道中存在的蛋白酶对原毒素的消化作用、活性毒素对中肠受体的粘附以及所述活性Cry毒素插入到顶端细胞膜中，产生离子通道或孔隙(细胞溶解)。这些通道一旦形成，就会改变昆虫的摄食习惯并破坏肠道完整性，导致生长减少并且甚至死亡。

在农业中使用Cry蛋白的一个优点为这些蛋白中的每一种对各种害虫物种具有选择性毒性，并且其对其他脊椎动物生物体比如鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物具有无毒性质。Cry蛋白的另一个优点为其对来自不同作物的害虫的相对特异性。几种cry基因为已知的。Cry1、cry2和cry9基因通常对鳞翅类具有活性；cry2、cry4A、cry10、cry11、cry17、cry19、cry24、cry25、cry27、cry29、cry30、cry32、cry39和cry40基因通常对双翅类具有活性；cry3、cry7和cry8基因通常对鞘翅类具有活性；和cry5、cry12、cry13和cry14基因通常对线虫类具有活性。目前正在生产含有具有杀虫活性的Bt-Cry蛋白的商品，并将其用作生物杀虫剂。这些产品占销售的高百分比，并且60多年来主要用于防控鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)害虫。这种Cry蛋白的另一个用途是它们在转基因植物中的表达。

尽管在转基因玉米植物中使用特定的Bt蛋白防控害虫，但其使用已经产生了对其中一些Bt蛋白具有抗性的鳞翅目和鞘翅目(Coleoptera)群体(Tabashnik，B.E.；Brévault，T.；Carrière，Y.Insect resistance to genetically engineered crops：successes andfailures.ISB News Report：Agricultural and Environmental Biotechnology，2014年1月.)。一种特定情况为出现对Cry1F和Cry1A基因具有特异性抗性的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)群体，其在热带条件下最常见。灰翅夜蛾属(Spodoptera)为全世界玉米生长区域发现的主要害虫，并且对Cry1F和Cry1A蛋白的抗性发展对于这些区域的玉米生产提出重大挑战。在田地发现对Cry1F蛋白具有抗性的灰翅夜蛾属群体被发现：(1)2010年在波多黎各(Storer，N.P.；Babcock，J.M.；Schlenz，M.；Meade，T.；Thompson，G.D.；Bing，J.W.；Huckaba，R.M.Discovery and characterization of field resistance toBt maize：S.frugiperda(Lepidoptera：Noctuidae)in Puerto Rico.Journal ofEconomic Entomology，v.103，p.1031-1038，2010.)，(2)在美国(Huang，F.；Qureshi，J.A.；Meagher JR，R.L.；Reisig，D.D.；Head，G.P.；Andow，D.A.；NI，X.；Kerns，D.；Buntin，G.D.；Niu，Y.；Yang，F.；Dangal，V.Cry1F resistance in fall armyworm S.frugiperda：singlegene versus pyramided Bt maize.)和(3)在巴西(Farias，J.R.；Andow，D.A.；Horiksoshi，R.J.；Sorgatto，R.J.；Fresia，P.；Santos，A.C.；Omoto，C.Field-evolvedresistance to Cry1F maize by S.frugiperda(Lepidoptera：Noctuidae)inBrazil.Crop Protection，v.64，p.150-158，2014)。在巴西，还发现了对Cry1Ab具有抗性的草地贪夜蛾群体(Omoto，C.；Berbardi，O.Salmeron，E.；Sorgatto，R.J.；Dourado，P.M.；Crivellari，A.；Carvalho，R.A.；Willse，A.；Martinelli，S.；Head，G.P.Field-evolvedresistance to Cry1Ab maize by S.frugiperda in Brazil.Pest Management Science，Chichester，2016)。由于来自基于含有对草地贪夜蛾具有活性的单个cry1基因的转基因植物的产品的选择压力，其中一些抗Cry1F的草地贪夜蛾群体迅速发展。

由于对玉米植物中单个Cry1F表达基因的抗性发展这一巨大问题所致，可获得含有两个或更多个杀虫基因比如cry1Ab、Cry1F、vip3A、cry1A.105、cry2Ab、cry3Bb、cry34Ab、cry35Ab、mcry3A、ecry3.1Ab和dvsnf7的组合的商业品种。

因此，在所谓的蛋白聚合(pyramiding)中使用表现出不同作用模式的蛋白是至关重要的，这会减缓抗性发展的速率。因此，例如，对继续发现对草地贪夜蛾具有活性的新蛋白具有巨大兴趣，所述草地贪夜蛾并不显示与已经对于Cry1F具有抗性的那些的交叉抗性。

基因dvsnf7为另一种害虫防控技术，其使用双链RNA来抑制对昆虫存活重要的基因。然而，其对极其贪婪并快速导致落叶的鳞翅目影响甚微。

因此，非常需要开发对野生型昆虫群体和Cry1F/Cry1A抗性群体两者均具有毒性的新备选蛋白。这些新蛋白对于用于转基因策略应具有很高的价值，适用于转基因技术，并且能够防控转基因作物中的鳞翅类害虫。

其中一种蛋白为由一些Bt菌株产生的Cry1Da，并且已知对草地贪夜蛾具有毒性(Costa，ML，Lana，UG，Barros，EC，Paiva，LV and Valicente，FH，J of AgriculturalScience，2014，vol 6，pp128-136)。然而，Cry1Da蛋白在先前报告中被描述为对鳞翅类害虫的毒性谱有限(von Frankenhuyzen，2009)和对鳞翅类物种的不同群体(比如草地贪夜蛾)具有不同毒性。例如，Monnerat等人(2006)发现Cry1Da蛋白对哥伦比亚和墨西哥采集的草地贪夜蛾具有毒性，但对巴西采集的群体无毒(Applied and EnvironmentalMicrobiology，2006，vol 72，p.7029-7035)。

对鳞翅类害虫相对小的活性谱及其毒性方面的可变性已经成为Cry1Da使用的重要限制。具体地讲，yon Frankenhuyzen(Frankenhuyzen，K.2009.Minireview：Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins.Journal ofInvertebrate Pathology.101：1-16)报道了与测试的主要Cry1A和2Aa蛋白(对＞80％的测试物种具有活性)相比较，在Cry1蛋白中，Cry1Da为对多种鳞翅类物种具有最低活性谱的一种(仅对44％的测试物种具有毒性)。由于天然Cry1Da蛋白在活性谱及其可变毒性水平方面的限制所致，研究人员一直致力于改进天然Cry1Da蛋白的结构，以使其对更广泛的鳞翅目害虫(更具体地讲为玉米穗虫(corn earworm)(玉米螟(Helicoverpa zea))变得更加有效。

WO2007107302描述了使用Cry1C、Cry1D或Cry1Da序列来产生对玉米穗虫具有潜在活性的新的嵌合蛋白。同样地，文献WO2015143311和WO2016061377描述了Cry1Da蛋白的结构修饰，以试图扩大其对其他鳞翅类害虫，特别是玉米穗虫(玉米螟)的谱，包括天然Cry1Da氨基酸序列的修饰或与其他杀虫蛋白融合以增加对更广泛的鳞翅类害虫的杀虫活性。由于这些实验和研究结果一直集中于扩大Cry1Da对其他鳞翅类的活性谱，因此基本上没有关于Cry1Da或其天然存在的变体对草地贪夜蛾群体(包括对Cry1F具有抗性的那些)的毒性可用的数据。唯一涉及评价转基因玉米植物中表达的Cry1Da的研究表明，这种蛋白对由草地贪夜蛾(工作中未指定的群体)引起的叶面损伤具有小或中等保护作用。此外，没有显示这种蛋白对这种害虫的毒性的具体数据。鉴于上述研究中造成的损伤程度，可以合理地得出结论，转基因植物对昆虫仅有小的毒性作用。

对于遗传修饰的植物，将编码期望的蛋白的DNA构建体通过遗传转化单独插入到植物基因组中。目前的植物转化方法主要使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，其通常导致宿主植物基因组中基因构建体的拷贝数低。基因构建体包含启动子、编码区和终止子。启动子为时间上和尤其是基因上两者的调控和表达决定元件。通常，对于足够大的表达，如产生杀虫蛋白以防控鳞翅类害虫的情况，构建体使用组成型启动子，比如控制玉米中泛素基因表达的启动子。

DNA构建体整合到宿主基因组中为随机的，并且这种随机插入到植物基因组DNA中可能会影响其产物对植物存活至关重要的基因，从而使所得植物无法生存。此外，随机插入可靶向可能会对感兴趣的基因的表达产生负面影响的宿主基因组区域，而与使用组成型启动子无关。在其他实例中，构建体基因产物的过量产生对细胞具有有害影响，主要导致产量下降。由于这些潜在问题，通常会产生数十个(在一些情况下为数百个)不同事件，并针对具有对于商业目的期望的转基因表达模式和水平的单个事件进行筛选。

具有期望的转基因表达水平或模式的事件可用于通过传统的有性杂交转移到同一物种的其他遗传背景。存在对以下基因的报道，所述基因即使在亲本基因型的高组成型表达水平下，也不一定在其他遗传背景中呈现出相同反应。因此，合乎期望的是，除充分的时空表达之外，转化事件还应在与其他基因型(不同背景)的杂交中呈现出低的基因表达变化。

在这种情况下，这种杂交的后代保留了初始转化宿主植物的转基因表达特征。该策略用于确保在非常适于当地生长条件的多个品种中进行可靠的基因表达。这受到以下影响：将整合的DNA插入到基因组内的最佳位置，从而提供最佳水平的时空表达、跨多代和跨多个遗传起源的稳定性。因此，插入的DNA的物理基因组位置成为所得产物有效性的关键特征，并因此为新的。

建立一种能够检测特定转化事件的存在以在植物或加工样品中确定所述事件的存在以用于测试种子质量和田野释放的方法，也是非常有意义的。这种方法还可用于确定和监测有性杂交后代的基因分离，通过杂交筛选事件并在源于重组植物的食物中检测它。众所周知的核酸检测方法为(但不限于)使用多核苷酸引物的体外DNA扩增PCR(聚合酶链反应)技术。另一种方法为使用核酸探针进行DNA杂交。检测方法可使用基于不同基因构建体之间的普通元件或基于构建体特定区域的引物或探针。

由于以上原因，需要鉴定基于转基因玉米事件特有的新的核酸序列、可用于鉴定转基因玉米事件和检测植物产品中来自转基因玉米事件的核酸的检测方法，以及包含用于检测植物产品中这些核酸所需的试剂的试剂盒。

发明内容

本发明涉及一种转基因玉米事件，其命名为ME240913，包含新的转基因基因型，该基因型含有优化用于在玉米中表达的cry1Da核酸序列。cry1Da编码序列编码SEQ ID NO：3的天然Cry1Da蛋白的截短变体，该变体令人惊讶地赋予植物高水平的保护以免由巴西天然存在的几种草地贪夜蛾群体(野生型和对Cry1F具有抗性的两者)引起的叶损伤。重要的是，事件ME240913的叶组织对鳞翅类害虫，比如夜蛾科(Noctuidae)昆虫，特别是草地贪夜蛾，产生了意想不到的高毒性。除cry1Da编码序列之外，本发明进一步提供事件ME240913特有的其他核酸，即由使用特异性引物进行PCR反应以确认5’接合序列、3’接合序列、5’和3’侧翼序列和/或其互补物而产生的扩增子序列。本发明进一步提供包含事件ME240913的特有核酸的扩增子、包含事件ME240913的特有核酸的转基因玉米植物及转基因玉米植物的种子。

本发明还涉及用于通过如下产生包含本发明特有核酸的转基因玉米植物的方法：将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物进行有性杂交以产生多个第一代后代植物，其中所述亲本植物中的至少一者包含事件ME240913特有的核酸，选择对鳞翅类害虫侵染具有抗性的第一代后代植物，自花授粉第一代后代植物以产生多个第二代后代植物，并从第二代后代植物中选择对鳞翅类害虫具有抗性的植物。

本发明进一步描述用于防控鳞翅类害虫比如夜蛾科的那些害虫，特别是草地贪夜蛾的方法。本发明包含事件ME240913的玉米植物和方法可有效防控特定鳞翅类害虫群体，比如对表达Cry1F蛋白的植物变得具有抗性的草地贪夜蛾。

用于产生杂交玉米种子的方法也被公开。这种方法包括以下步骤：种植包含至少一个事件ME240913特有的核苷酸序列的第一先天性玉米品系的种子及具有不同基因型的第二先天性品系的种子，使由种植的所述种子产生的玉米植物生长直至开花时间，去雄其中一种先天性玉米品系的植物花朵，使两种不同的先天性品系彼此进行有性杂交，并收获由此产生的杂交种子。

包含事件ME240913特有的核酸的种子样品以及相应地种子生长的玉米植物，以登录号PTA-126224保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)。除本发明新的基因型赋予玉米植物的那些形态和生理特征之外，本发明的转基因玉米植物基本上表现出非转基因同基因玉米植物的所有相应形态和生理特征。本发明还提供来自ME240913玉米植物、组织和种子的植物产品和提取物。

本发明进一步提供通过使含有事件ME240913的植物，比如(但不限于)从以登录号PTA-126224保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子获得的植物，进行有性杂交而将事件ME240913渗入到玉米品系中的方法。

根据本发明，事件ME240913可通过本领域已知的方法比如基因聚合与其他玉米转基因事件组合。ME240913对由各种巴西草地贪夜蛾群体(包括Cry1F抗性昆虫)引起的植物损伤产生高水平防控的教导确立了，新事件对巴西Cry1F抗性草地贪夜蛾群体具有毒性。这些结果还表明，事件ME240913通过与Cry1F不同的作用机制发挥作用，并且因此，当使用基因聚合与整合到植物中的其他杀虫基因组合时，玉米事件将非常有效。事件ME240913还表达除草剂抗性pat(bar)基因。因此，事件ME240913还可用于使用基因聚合降低除草剂抗性率。

基因聚合的实例包括(但不限于)除草剂和害虫抗性事件。使用这种方法，事件ME240913可例如与含有选自以下的一种或多种基因的事件组合：pat基因、cp4 epsps(5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶)基因、cry1Ab基因、cry1F基因、vip3A基因、cry1A.105基因、cry2Ab基因、cry3Bb基因、cry34Ab基因、cry35Ab基因、mcry3A基因、ecry3.1Ab、dvsnf7基因和amy797E基因。

本发明进一步提供包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物的一对多核苷酸引物，其在于样品中存在事件ME240913的DNA模板的情况下共同起作用以产生事件ME240913的诊断扩增子，其中第一多核苷酸引物包含5’侧翼序列、3’侧翼序列和/或其互补物的一部分，其中第二多核苷酸引物包含特定插入序列或其互补物的一部分，和其中所述玉米事件ME240913具有含有玉米基因组中的事件插入物和侧翼序列的特定序列。

本发明涉及转基因玉米植物及其细胞和组织，其包含本发明的核酸分子。

在一个实施方案中，转基因玉米植物对鳞翅类害虫具有抗性。在一个最优选的实施方案中，转基因玉米植物对由巴西玉米产区发现的天然存在的草地贪夜蛾群体引起的叶损伤具有高度抗性。

在另一个实施方案中，转基因玉米植物对草地贪夜蛾具有高度毒性，当喂食新鲜叶组织时导致100％的死亡率。在另一个实施方案中，转基因玉米植物为对草地贪夜蛾具有高度毒性的植物，如通过用人工膳食以1∶25的比率(重量/重量)稀释事件ME240913的冻干叶之后草地贪夜蛾的高死亡率和发病率证明的。事件ME240913的冻干植物叶组织的高毒性表明，所述事件在防控草地贪夜蛾方面非常有效，并且可用于聚合几个昆虫防控基因。

包含本发明核苷酸分子的玉米种子也被公开。在一个实施方案中，玉米种子以登录号PTA-126224保藏于美国典型培养物保藏中心并用于产生转基因玉米植物。

此外，本发明涉及事件ME240913的玉米植物产品、其组织或种子，其包含本发明的核苷酸序列或其互补物，并且其中序列可经核酸扩增或核酸杂交方法在植物产品中检测到。

本发明进一步考虑植物产品，比如(但不限于)玉米谷物、饲料、玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉及全部或部分由玉米衍生产品制成的谷类食物。

本发明进一步提供用于检测事件ME240913特有的核酸的试剂盒，其包含至少一种核酸分子，所述核酸分子为引物或探针，所述引物或探针包含含有特定序列的核酸序列及其互补物，其中所述引物或探针通过扩增或杂交样品中的目标核酸序列，然后检测扩增子或与目标序列的杂交来诊断样品中事件ME240913特有的核酸序列的存在。

进一步公开了用于检测包含玉米核酸的样品中至少一种事件ME240913特有的核酸分子的存在的方法，其中所述方法包括以下步骤：使样品与本发明的一对特异性引物接触，进行核酸扩增反应以产生扩增子以及检测所述扩增子，其中所述扩增子包含事件ME240913特有的核酸序列或其互补物，和其中所述玉米事件ME240913具有含有玉米基因组中的事件插入物和侧翼序列的特定序列。

用于检测包含来自玉米的核酸的样品中事件ME240913特有的核酸分子的存在的另一种方法包括以下步骤：使样品与在高度严格条件下与事件ME240913的DNA杂交并且在高度严格条件下不与对照玉米植物的DNA杂交的探针接触，其中探针包含事件ME240913特有的核苷酸序列及其互补物，使样品和探针两者经受高度严格的杂交条件，并检测探针与核酸分子的杂交，其中所述玉米事件ME240913具有含有玉米基因组中的事件插入物和侧翼序列的特定序列。

进一步地，公开了一种用于防控玉米植物中鳞翅类害虫的方法，其中玉米植物包含核酸分子，所述核酸分子包含事件ME240913特有的核酸序列或其互补物，其中所述方法包括在易受鳞翅类害虫影响的玉米植物的生长区域，种植从包含事件ME240913特有的所述核酸序列的植物获得的种子的步骤。

此外，描述了用于在玉米植物中防控鳞翅类害虫的方法，其中玉米植物含有通过表达事件ME240913特有的核酸序列的特有序列产生的截短和修饰的Cry1Da蛋白，导致截短和修饰的Cry1Da蛋白在叶中的表达水平增加，该水平对巴西天然存在的群体引起的叶损伤为高度保护性的，并且对草地贪夜蛾也为高度毒性的，正如在所进行的研究中发现的高死亡率所示。

进一步公开了包含事件ME240913的植物、植物细胞、植物部分或种子用于与第二植物杂交、再生植物、种植或生长植物田野或者生产植物产品的用途。

本发明的这些和其他方面从以下详细描述将变得更加显而易见。

序列表中的序列描述

SEQ ID NO：1为在事件ME240913中存在的针对玉米中的表达优化的编码截短的Cry1Da蛋白的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2为事件ME240913的全长转基因构建体的核酸序列，其按以下顺序包含：Tvsp基因的3’UTR终止子区；膦丝菌素乙酰转移酶基因编码区(bar)，翻译增强子区(tev)；重复的CaMV 35S基因启动子区，泛素(ubi)基因启动子区；密码子优化的cry1Da基因核酸序列(SEQ-ID-NO：1)；以及胭脂碱合酶基因的3’UTR终止子区。

SEQ ID NO：3为由事件ME240913表达的截短的Cry1Da蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4为5’接合序列。

SEQ ID NO：5为3’接合序列。

SEQ ID NO：6为5’侧翼序列。

SEQ ID NO：7为3’侧翼序列。

SEQ ID NO：8为包含事件ME240913的5’侧翼序列(核苷酸1-116)、全长插入序列(核苷酸117-6306)和3’侧翼序列(核苷酸6307-6424)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9为用于扩增5’接合序列的正向引物序列。

SEQ ID NO：10为用于扩增5’接合序列的反向引物序列。

SEQ ID N：11为说明性PCR扩增子序列，其使用对于确认3’接合序列特异性的引物获得。

SEQ ID NO：12为用于检测5’接合序列的探针序列。

SEQ ID NO：13为用于扩增3’接合序列的正向引物序列。

SEQ ID N：14为用于扩增3’接合序列的反向引物序列。

SEQ ID NO：15为说明性PCR扩增子序列，其使用对于确认5’接合序列特异性的引物获得。

SEQ ID NO：16为用于检测3’接合序列的探针序列。

附图说明

图1为事件ME240913的插入物和定义所述事件的相应核苷酸序列(包括玉米基因组的5’和3’接合和侧翼序列)的代表性图解。

图2为描绘插入到TDNA左右边界之间的二元载体pTF101.1的Hind III和EcoRI酶位点中的事件ME240913插入物的基因构建体Ubi：：cry1Da：：NOS e 2x35S：：bar：：Tvsp的图解。

图3显示使用新鲜玉米叶对事件ME240913对草地贪夜蛾防控进行为期5天的评估结果。显示了非GMO玉米(a)和用Cry1Da遗传修饰的玉米(b)的新鲜叶样品。

图4显示草地贪夜蛾暴露于来自两种含有事件ME240913的遗传背景的新鲜叶组织的测定结果。在将新近孵化的幼虫于两种不同遗传背景(杂合体和RC1F1)下暴露于新鲜对照玉米叶和表达事件ME240913的玉米叶之后多达3天评价草地贪夜蛾存活率(％)并显示。

图5显示在暴露于在人工对照膳食和事件ME240913中以1∶25稀释度冻干的叶14天之后新近孵化的幼虫的存活率。

图6显示与对照膳食相比较，在暴露于在人工膳食中以1∶25稀释的事件ME240913的冻干叶组织7(A)和10(B)天之后存活毛虫的大小。

图7显示在6种不同草地贪夜蛾群体侵染的地块中，对照玉米植物(conv)和事件ME240913(GMO)叶的损伤程度结果。

图8显示在由来自Palotina/PR(8A)、Rondonópolis/MT(8B)、Rondonópolis+CampoVerde/MT(8C)、Paracatu/MG(8D)、Sete Lagoas/MG(8E)和Ivatuba/PR(8F)的草地贪夜蛾群体侵染的田野，对照玉米植物(左)和事件ME240913玉米植物(右)的损伤照片。

图9是指显示1970年橡树量表(Oak scale)中由草地贪夜蛾侵染引起的损伤评分(±CI，P＝0.05)的图表。处理1-包含本发明密码子优化的cry1Da核酸序列(SEQ ID NO：1)的转基因玉米+Cry1F抗性毛虫群体；处理2＝非转基因L3玉米品系+Cry1F抗性毛虫群体；处理3＝包含本发明密码子优化的cry1Da核酸分子(SEQ ID NO：1)的转基因玉米+易感毛虫群体；处理4＝非转基因L3玉米品系+易感毛虫群体。

具体实施方式

除非另外定义，否则本领域中使用的所有术语、本文中使用的注释和其他科学术语旨在具有本发明领域中的本领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，在本文件中定义了具有通常理解含义的术语，目的是为了清楚起见和/或为了及时参考，并且在本文件中包含这种定义不应一定解释为代表相对于现有技术中通常理解的实质性差异。

本文件中描述或指涉的技术和程序通常被本领域的技术人员很好地理解和使用常规方法采用。在适当情况下，涉及使用市售试剂盒和试剂的过程通常按照制造商定义的方案和/或参数进行，除非另外指明。

值得一提的是，在适当情况下，本发明不限于如所描述的方法、方案、细胞系、属或动物物种、构建体和特定试剂，这些显然可以变化。另外，本文件中使用的术语仅出于描述其具体实施方案的实例的目的，并且不旨在限制本发明的范围。

在整个本文件中，单数形式“一个/种(a)”和“该/所述(the)”或者任何术语或表达的单数形式包括对复数的指涉，除非上下文另外明确规定。

在整个本文件中，词语“包含”及其任何变化，比如“含有”或“包括”，应解释为“开放式术语”，这可能意味着包含未明确提及的不具有限制性特征的另外要素或要素组。

在整个本文件中，词语“由...组成(consists)”以及任何变化比如“由...组成(consist)”或“由...组成(consisting)”应解释为“封闭式术语”，并且可能不意味着包含未明确描述的具有限制性特征的另外要素或要素组。

在整个本文件中，关于特定因子、量、浓度或特定偏好提供的精确值或精确值的范围应解释为也提供近似值的相应值或范围，比如通过表达“约”。

在整个本文件中，词语和表达比如“优选地”、“特别地”、“例如”、“比如”、“如”、“更特别地”等及其变化必须解释为完全任选的特征、优选的实施方案或可能的非详尽实例，而不限制本发明的范围。

在整个本文件中，词语和表达比如“核酸”、“核苷酸”等应解释为天然存在的、合成的或人工的核酸或核苷酸。其包括单链或双链的，以有义或反义构型存在的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)或其任何核苷酸类似物和聚合物或杂合体。除非另外说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指明的序列。术语“核酸”在本文件中可与术语“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”、“核酸分子”或“引物”互换使用。

表达“核酸分子”、“核酸序列”等是指从5’到3’末端读取的单链或双链DNA或RNA碱基的聚合物。其包括染色体DNA、自我复制质粒、起主要结构作用的感染性DNA或RNA聚合物等。它们还指如通常用于本发明技术领域的代表核苷酸或基因的缩写、字母、字符或词语的连续列表。

如本文使用的术语“扩增的”意指使用至少一种核酸分子作为模板构建核酸分子的多个拷贝或与核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括(但不限于)聚合酶链反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如：Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications，D.H.Persing，等人，Ed.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1993)。扩增产物被描述为扩增子。

“编码序列”为转录成RNA比如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地，然后RNA在生物体中被翻译以产生蛋白。

在整个本文件中，词语和表达比如相对于另一个序列的“序列相似性”、“同一性”等，应该解释为在序列对齐以及必要时引入缺口以达到最大的序列同一性百分比之后，序列中与另一个序列中的核苷酸相同的核苷酸百分比。根据本发明，短语“至少70％相似性”例如定义为70％-100％相似性或同一性。优选地，相似性百分比为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。

“基因”为位于基因组内的定义区域，并且其尽管有上述编码序列，但可包含其他序列，主要是负责控制表达即编码区的转录和翻译的调控核酸序列。基因还可含有其他5’和3’非翻译序列和终止序列。可能存在的其他元件为例如内含子。

“感兴趣的基因”是指当转移至植物中时，赋予植物期望的性状比如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性或对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、提高的营养价值、改善的工业过程性能或改变的生殖能力的任何基因。

如本文使用的“基因型”为从亲本玉米植物继承的遗传物质。基因型ME240913是指在植物基因组内转化的异源遗传物质以及插入序列侧翼的遗传物质。

“异源”核酸序列为与它引入其中的宿主细胞不天然相关的核酸序列，包括核酸序列的多个拷贝的非天然存在。

“同源”核酸序列为与它引入其中的宿主细胞天然相关的核酸序列。

玉米叶组织的“高毒性”是指叶组织样品在叶组织暴露的7天内导致鳞翅类物种比如草地贪夜蛾100％死亡率的能力。“高毒性”定义的另一部分为用常规玉米叶组织以1∶25稀释的干叶组织在暴露于叶组织膳食的14天内导致＞95％的死亡率和发病率的能力。

“可操作地连接”是指将核酸序列缔合成单个核酸片段，使得其中一个的功能影响另一个的功能。例如，当启动子能够影响编码序列或功能性RNA的表达时(即当编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下时)，启动子可操作地连接于编码序列或功能性RNA。有义或反义方向的编码序列可以可操作地连接于调控序列。

如本文使用的“植物保护”是指完整玉米植物抵抗由易感鳞翅类害虫引起的叶面损伤(包括(但不限于)保护以免由草地贪夜蛾引起的叶损伤)的能力。可通过检查植物或植物照片以比较对照玉米植物中发现的损伤与表达Cry1Da的玉米植物中观察到的损伤来观察保护情况。如本文使用的“植物保护”还指完整植物抵抗来自易感鳞翅类害虫的损伤的能力，包括(但不限于)使用标准和公认的植物损伤分类方法。

如本文使用的“引物”为分离的核酸，其通过核酸杂交退火至互补的目标DNA链，以在引物和目标DNA链之间形成杂合体，并然后通过聚合酶(比如DNA聚合酶)沿着目标DNA链延伸。引物对或引物组可用于扩增核酸分子，例如经聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。

“探针”为分离的核酸，其与常规可检测标记或报告分子比如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶结合。这种探针与目标核酸链，在本发明的情况下与来自玉米事件ME240913的基因组DNA链互补。来自事件ME240913的DNA可以来自玉米植物或来自包含来自事件ME240913的DNA的样品。本发明的探针不仅包括核糖核酸或脱氧核糖核酸，而且还包括聚酰胺和其他特异性地结合于目标DNA序列并可用于检测该目标DNA序列的存在的探针材料。

引物和探针的长度通常在10-15个核苷酸之间或者更长。引物和探针的长度也可为至少20个核苷酸或更长，或者至少25个核苷酸或更长，或者至少30个核苷酸或更长。这种引物和探针在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。本发明的引物和探针可具有与目标序列互补的全长序列，尽管可通过常规方法设计与目标序列不同并且保持与目标序列杂交能力的探针。

“严格条件”或“严格杂交条件”包括指涉探针将以比其他序列更高的可检测程度与其目标序列杂交的条件。严格条件取决于目标序列，并将根据多核苷酸结构而不同。通过控制杂交严格性和/或洗涤条件，可鉴定与探针(同源探针)100％互补的目标序列。或者，可调整严格条件以允许序列中存在一些错配，使得检测到较低程度的相似性(异源探针)。较长的序列在较高温度下特异性地杂交。关于核酸杂交的详尽指南见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier：NewYork；and Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人，Eds.，GreenePublishing and Wiley-Interscience：New York(1995)以及Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(5

特异性一般地为杂交后洗涤的函数，最终洗涤液的离子强度和温度为关键因素。通常，高度严格杂交和洗涤条件选择为低于特定序列在确定的离子强度和pH下的热解链点(T

用于在Southern印迹或Northern印迹滤器中杂交具有超过100个互补残基的互补核酸的高度严格杂交条件的一个实例为42℃下50％甲酰胺加1mg肝素，进行杂交过夜。非常高度严格的洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl在72℃持续大约15分钟。高度严格洗涤条件的一个实例是65℃下0.2x SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，见下文Sambrook)。

用于本发明的杂交条件的一个良好实例包括在7％SDS，0.25M NaPO

对于约10-50个核苷酸的探针，高度严格条件一般地涉及在pH 7.0-8.3下小于约1.0M Na离子的盐浓度，一般地浓度为约0.01-1.0M Na离子(或其他盐)，和温度一般地为至少约30℃。还可通过添加去稳定剂比如甲酰胺来实现高度严格条件。通常，在特异性杂交测定中对不相关探针观察到的信噪比的2x(或更高)表明检测到特异性杂交。如果在高度严格条件下彼此不杂交的核酸编码的蛋白基本上相同，则它们仍然基本上相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性创建核酸拷贝时，就会发生这种情况。

以下为可用于杂交与本发明的参考核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的杂交/洗涤条件组的良好实例：参考核苷酸序列优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO

在整个本文件中，词语和表达比如“启动子”、“启动子序列”等应解释为DNA序列，一旦可操作地连接于感兴趣的核苷酸序列，其能够控制感兴趣的核苷酸序列转录成RNA。启动子位于它控制其mRNA转录的感兴趣的核苷酸序列的转录起始位点的5’(或上游)，并且提供用于转录起始的RNA聚合酶和其他转录因子的特异性结合位点。其可包括本领域技术人员已知的其他调控序列。根据本发明，启动子对于相应的细胞或宿主可为异源或同源的。如果核酸序列源于不同物种，或者如果源于相同物种，它由其初始形式进行修饰，则它对于生物体或第二核酸序列为“异源的”。

如本文使用的术语事件ME240913“特有的”意指事件ME240913的独特特征。因此，在不同于ME240913的玉米植物中未发现事件ME240913特有的核酸。

如本文使用的术语“玉米”是指物种玉蜀黍，并且包括可与玉米一起繁殖的所有植物品种，包括野生型玉米物种。

如本文使用的“检测试剂盒”是指用于检测样品中是否存在ME240913植物特有的核酸的部件试剂盒，其中试剂盒包括在高度严格条件下与目标DNA序列特异性地杂交的本发明核酸探针和/或引物，以及实现核酸扩增或杂交方法所需的其他材料。

在整个本文件中，术语“转化”等应解释为用于将异源DNA引入到细胞、植物组织或植物中的过程。其可在天然或人工条件下，比如使用本领域众所周知的几种方法，在原核或真核宿主细胞中发生。该方法通常基于待转化的宿主细胞进行选择，并且可包括(但不限于)病毒感染、电穿孔、脂质转染、粒子轰击(生物弹射)和农杆菌属介导的方法。

在整个本文件中，术语“转基因”应解释为通过实验操纵引入到细胞中(无论是否整合到基因组中)的任何核酸序列。转基因可为“内源性DNA序列”或“外源性DNA序列”(即“异源的”)。术语“内源性DNA序列”是指天然存在于它所引入的细胞中的核苷酸序列。术语“外源性DNA序列”是指非天然存在于它所引入的细胞中的核苷酸序列。关于转化的生物体，术语“转基因的”意指用重组DNA分子转化的生物体，该重组DNA分子优选地包含可操作地连接于感兴趣的DNA序列的合适启动子。

在整个本文件中，术语“载体”应解释为含有DNA序列的构建体，该DNA序列可操作地连接于能够导致所述DNA序列在合适宿主中表达的一个或多个合适的控制序列。这种控制序列包括例如进行转录的启动子、用于控制这种转录的任选操纵子序列、编码针对核糖体的合适mRNA结合位点的序列以及控制转录和翻译结束的序列。

几种载体适合于进行本发明。这些载体可在宿主生物体中自主复制或由染色体复制。载体也可为质粒。根据本文件，术语“质粒”和“载体”有时可互换使用。优选地，本发明的载体包含含有如本文定义的SEQ ID NO：1的核酸序列的cry1Da核酸分子。

如本文使用的术语转基因“事件”是指通过用异源DNA(例如包含感兴趣的基因的表达盒)转化和再生植物组织或细胞而产生的重组植物。术语“事件”是指包含异源DNA的初始转化体和/或转化体后代。术语“事件”还指由转化体和另一玉米品种之间的有性杂交产生的后代。此外，即使在与轮回亲本反复回交之后，来自转化亲本的插入DNA和侧翼DNA仍存在于杂交后代中的相同染色体位置处。术语“事件”还指来自初始转化体的DNA，其包含插入的DNA和紧邻插入的DNA的侧翼序列，由于包含插入DNA的一个亲本品系(例如由自交产生的初始转化体和后代)和不含插入DNA的亲本品系的有性杂交所致，预计将被转移至接受插入DNA(包括感兴趣的转基因)的后代中。通常，植物组织转化会产生多个事件，每个事件代表将DNA构建体插入到植物细胞基因组中的不同位置中。基于转基因表达或其他合乎期望的性状，选择特定事件。因此，术语“事件ME240913”和“事件”可互换使用。

昆虫抗性ME240913玉米植物可通过以下进行繁育：使由从转基因ME240913玉米植物生长的玉米植物，比如从以登录号PTA-126224保藏于ATCC的种子生长的ME240913玉米植物，及其衍生于用赋予鳞翅类害虫抗性的本发明实施方案的表达盒进行的转化的后代组成的第一亲本玉米植物，与可显示或可不显示对鳞翅类害虫的抗性的第二亲本玉米植物进行第一有性杂交，从而产生多个第一第一代后代植物；并然后选择对鳞翅类害虫具有抗性的第一第一代植物；且将第一代后代植物进行自交，从而产生多个第二代后代植物；并且然后从第二代后代植物中选择对鳞翅类害虫具有抗性的那些植物。这些步骤可进一步包括第一代鳞翅类害虫抗性植物或第二代鳞翅类害虫抗性植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物的回交，从而产生对鳞翅类害虫具有抗性的玉米植物。这种方法可用于将事件ME240913基因渗入到玉米品系中以及用于聚合事件ME240913与其他转基因事件。

在整个本文件中，表达“宿主细胞”、“宿主生物体”等应解释为特定宿主生物体或特定目标细胞，但也应解释为这些生物体或细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境效应，某些修饰可能在连续世代中出现，因此这些后代不一定需要与亲本细胞相同。然而，它们仍然包括在本发明的保护范围内。根据本发明，宿主细胞可为原核的或真核的。优选地，本发明的宿主细胞为植物宿主细胞。优选地，其包含事件ME240913特有的选自SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5及其互补物的核酸序列。

在整个本文件中，词语和表达比如“转基因植物细胞”、“转基因植物”等应解释为通过实验操纵具有并优选地表达转基因的细胞或植物，并且进一步指如上文的转基因植物的后代及植物的后续世代。

在整个本文件中，术语“植物”等应解释为全部或部分的植物生物体。在该上下文中的“部分”意指植物细胞和组织、器官以及以其所有表现形式的植物部分，比如种子、叶、花药、纤维、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收集的材料、植物组织、再生组织和细胞培养物。可生成本发明的转基因植物并进行自交或与其他个体杂交，以获得另外的转基因植物。转基因植物也可通过转基因植物细胞的营养繁殖而获得。

在整个本文件中，词语和表达比如“害虫”、“鳞翅类害虫”等应解释为鳞翅目的昆虫，包括(但不限于)凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、草螟科(Crambidae)和谷蛾科(Tineidae)，更特别地为夜蛾科灰翅夜蛾属物种(Spodoptera sp.)，特别是草地贪夜蛾(S.frugiperda)(夜蛾科)，和草螟科(cambids)杆草螟属物种(Diatraea sp.)，特别是小蔗螟(D.saccharalis)(草螟科)。

本发明的一个实施方案涉及防控作物中鳞翅类害虫(包括(但不限于)毛虫)的方法。防控作物中鳞翅类害虫的任何方法均包括在本发明的范围内，与实现本发明的实施方案不是特别关联，只要本发明的作物包含至少一个事件ME240913特有的选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及其互补物的核酸序列，其中方法优选地包括在易受鳞翅类害虫影响的作物栽培区，种植从包含至少一个如本文定义的事件ME240913特有的核酸序列的植物获得的种子。

“Cry1Da”类蛋白进一步包含其同源物。“同源的”意指所述蛋白或多肽与Cry1Da类蛋白的其他成员具有确定的关系。

本发明涉及产生经修饰以防控鳞翅类害虫的截短的Cry1Da蛋白的遗传改进的玉米品系。本发明特别设计用于命名为ME240913的包含新基因型的转基因玉米事件，以及用于检测生物样品中事件ME240913特有的核酸的组合物和方法。本发明进一步设计用于包含ME240913基因型的玉米植物、玉米植物的转基因种子以及通过杂交包含ME240913基因型的自交玉米或另一玉米品系来生产包含ME240913基因型的玉米植物的方法。本发明包含ME240913基因型的玉米植物可用于防控鳞翅类害虫，包括(但不限于)夜蛾科和/或草螟科，优选地为草地贪夜蛾和小蔗螟。来自事件ME240913的玉米植物表现出对敏感鳞翅类害虫(包括(但不限于)野生型Cry1F抗性和Cry1A抗性的草地贪夜蛾)的植物保护作用。

在另一个实施方案中，玉米植物对易感鳞翅类害虫(包括(但不限于)草地贪夜蛾)表现出高毒性。

在一个实施方案中，本发明涉及一种包含事件ME240913特有的核苷酸序列的分离的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸分子，其将引入到事件ME240913的基因组中的异源DNA分子与事件ME240913中的基因组DNA结合，其包含异源DNA分子的至少10个或更多个(例如15、20、25、30个或更多个)连续核苷酸和异源DNA分子插入位点侧翼的基因组DNA的至少10个或更多个(例如15、20、25、30个或更多个)连续核苷酸。还包括包含事件ME240913的连续插入序列的10个或更多个核苷酸以及邻近插入序列的事件ME240913的侧翼DNA的至少一个核苷酸的核苷酸序列。这种核苷酸序列为事件ME240913特有的，并且对事件ME240913具有诊断性。事件ME240913的基因组DNA的核酸杂交或扩增产生包含这种特有序列的扩增子，从而使得可诊断事件ME240913。在该实施方案的一个方面，核苷酸序列选自SEQ ID NO：4、5和8及其互补物。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含含有来自事件ME240913的至少一个接合序列的核苷酸序列，其中接合序列通过配对所述事件ME240913特有的且诊断事件ME240913的插入位点跨越插入到玉米基因组中的异源表达盒和玉米基因组DNA之间的接合。在该实施方案的一个方面，接合序列选自SEQ ID NO：4和5及其互补物。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种将异源DNA分子连接于事件ME240913中的玉米植物基因组的分离的核酸分子，其包含至少一个选自ID NO：4、5及其互补物的序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含事件ME240913特有的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的蛋白。在该实施方案的一个方面，核苷酸序列为SEQ ID NO：8和/或其互补物。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含选自4、5和8及其互补物的核苷酸序列的分离的核酸分子。在该实施方案的一个方面，分离的核酸分子存在于以登录号PTA-126224保藏于美国典型培养物保藏中心的玉米种子或从所述种子生长的植物中。

在本发明的一个实施方案中，提供一种包含事件ME240913特有的核苷酸序列的扩增子。在该实施方案的一个方面，核苷酸序列选自SEQ ID NO：11和15及其互补物。

在另一个实施方案中，本发明包括用于检测事件ME240913的侧翼序列引物。这种侧翼序列引物包含来自5’或3’侧翼序列的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列。在该实施方案的一个方面，连续核苷酸选自SEQ ID NO：6(5’侧翼序列)或其互补物的至少10个连续核苷酸。在该实施方案的另一方面，5’侧翼序列的引物具有SEQ ID NO：9或其互补物的序列。在该实施方案的另一方面，连续核苷酸选自SEQ ID NO：7(3’侧翼序列)或其互补物的至少10个连续核苷酸。在该实施方案的仍然另一方面，3’侧翼序列的引物具有SEQ ID NO：12或其互补物的序列。

在仍然另一个实施方案中，本发明包括包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物的一对多核苷酸引物，其在于样品中存在来自事件ME240913的DNA模板的情况下共同起作用以产生事件ME240913的诊断扩增子。在该实施方案的一个方面，第一引物和/或第二引物选自SEQ ID NO：9、10或其互补物。在该实施方案的另一方面，第一引物和/或第二引物选自SEQ ID NO：13、14及其互补物。在该实施方案的仍然另一方面，由引物对产生的扩增子包含SEQ ID NO：11、15或其互补物。

在另一个实施方案中，本发明包括包含第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物的一对多核苷酸引物，其在于样品中存在来自事件ME240913的DNA模板的情况下共同起作用以产生事件ME240913的诊断扩增子。其中第一引物与来自玉米植物基因组的匹配插入到事件ME240913基因组中的异源DNA序列的插入点的序列等同或互补，和第二多核苷酸引物序列与插入到事件ME240913的基因组中的异源DNA序列等同或互补。

在该实施方案的一个方面，第一多核苷酸引物包含来自SEQ ID NO：8的1-116和6307-6424位及其互补物的至少10个连续核苷酸。在该实施方案的另一方面，第一引物选自SEQ ID NO：9、13及其互补物。在该实施方案的另一方面，第二多核苷酸引物包含来自SEQID NO：8的117-6306位或其互补物的至少10个连续核苷酸。在该实施方案的仍然另一方面，第二多核苷酸引物选自SEQ ID NO：10、14及其互补物。

在该实施方案的另一方面，如SEQ ID NO：9所示的第一多核苷酸引物和如SEQ IDNO：10所示的第二多核苷酸引物，在于样品中存在事件ME240913的DNA模板的情况下共同工作以产生事件ME240913的诊断扩增子。在该方面的一个实施方案中，扩增子包含如SEQ IDNO：11所示的核苷酸序列。

在仍然另一个实施方案中，本发明涉及一种用于检测包含玉米核酸的样品中事件ME240913特有的核酸分子的存在的方法，其中方法包括：(a)使样品与一对引物接触，(b)进行核酸扩增反应以产生扩增子，和(c)检测扩增子。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于检测包含玉米核酸的样品中事件ME240913特有的核酸分子的存在的方法，其中方法包括：(a)使样品与在高度严格条件下与来自事件ME240913的基因组DNA杂交并且在高度严格条件下不与来自对照玉米植物的DNA杂交的探针接触，其中探针包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及其互补物的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸；(b)使样品和探针经受高度严格杂交条件下；和(c)检测探针与核酸分子的杂交。可通过本领域众所周知的任何手段进行检测，所述手段包括荧光、化学发光、放射性、免疫学等。在其中杂交用作扩增特定序列以产生诊断事件ME240913的扩增子的手段的情况下，通过本领域众所周知的任何手段对扩增子的产生和检测表明与目标序列杂交，其中使用至少一种探针或引物。

术语“生物样品”定义源于含有或疑似含有核酸的玉米植物的样品，所述核酸在插入的异源DNA序列的两个末端的一端或另一端连接于其中插入异源DNA序列的染色体内的基因组DNA序列的点的任一侧，包含5-10个的核苷酸，在本文件中也称为接合序列。此外，接合序列包含少至两个核苷酸：其中它们为邻近与插入的异源DNA序列内第一个核苷酸共价连接的核苷酸的侧翼或基因组DNA内的第一个核苷酸。在该实施方案的一个方面，探针包含含有SEQ ID NO：4、5及其互补物的至少10个连续核苷酸的核苷酸序列。

在仍然另一个实施方案中，本发明涉及一种用于检测生物样品中事件ME240913特有的核酸的试剂盒。试剂盒包含至少一种在检测核酸的方法中用作引物或探针的具有足够长度的连续多核苷酸的核酸分子。对样品中的目标核酸序列进行扩增或杂交，然后检测扩增子或与目标序列的杂交，可诊断样品中事件ME240913特有的核酸序列的存在。试剂盒进一步包含允许核酸扩增或杂交所需的其他材料。在该实施方案的一个方面，试剂盒中存在的核酸分子包含选自SEQ ID NO：9、10、12、13、14、16及其互补物的核苷酸序列。在该实施方案的另一方面，核酸分子为选自SEQ ID NO：9、10、13、14及其互补物的引物。在该实施方案的仍然另一方面，扩增子包含SEQ ID NO：11、15或其互补物。可使用多种检测方法，包括(但不限于)TAQMAN、热扩增、连接酶链反应、Southern印迹、ELISA及比色和荧光检测方法。特别是，本发明提供用于检测含有来自ME240913的基因组核酸的样品中的目标序列(即至少SEQID NO：4、5或接合序列的序列)的存在的试剂盒。试剂盒包括至少两种能够于目标位点或基本上邻近目标位点结合的多核苷酸和至少一种用于检测多核苷酸与目标位点的结合的手段。检测手段可为荧光、化学发光、比色法或同位素法，并且可至少与免疫学方法偶联以检测结合。试剂盒还可利用两个或更多个多核苷酸序列检测样品中的目标位点(即至少SEQID NO：4、5或事件ME240913的接合序列的序列)的存在，所述多核苷酸序列一起能够结合于邻近目标序列或目标序列的约100个碱基对之内的核苷酸序列，并且可一起延伸以形成至少含有目标位点的扩增子。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于检测生物样品中的Cry1Da蛋白的方法，方法包括：(a)从事件ME240913中提取组织蛋白；(b)使用包含对由事件ME240913产生的Cry1Da蛋白具有特异性的抗体的免疫学方法分析提取的蛋白；和(c)检测所述抗体与Cry1Da蛋白的结合。

在仍然另一个实施方案中，本发明涉及一种源于事件ME240913的玉米植物、组织或种子的植物产品，其中植物产品包含与事件ME240913特有的序列等同或互补的核苷酸序列，并且其中序列可使用核酸扩增或杂交方法在植物产品中检测到。在该实施方案的一个方面，核苷酸序列与SEQ ID NO：4、5及其互补物中的至少一个等同或互补。在该实施方案的另一方面，植物产品选自玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉及全部或部分制造的含有基于玉米的产品的谷类食物。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种源于ME240913玉米植物、组织或种子的植物产品的提取物，其包含与ME240913特有的序列等同或互补的核苷酸序列。在该实施方案的一个方面，序列可使用核酸扩增或杂交方法在提取物中检测到。在该实施方案的另一方面，序列与SEQ ID NO：4和5中的至少一个等同或互补。此外，在该实施方案的另一方面，植物产品选自玉米面、玉米粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉及全部或部分制造的含有基于玉米的产品的谷类食物。

本发明的另一个实施方案涉及一种包含转基因事件ME240913的基因型的玉米植物或其部分及玉米植物的种子，其中基因型包含SEQ ID NO：4、5或其互补物中的至少一个核苷酸序列。玉米种子的一个实例包含于10/28/2019保藏并分配了登录号PTA-126224的本发明核酸分子。在该实施方案的一个方面，玉米植物来自Hill玉米品系。然而，本领域的普通技术人员应当认识到，ME240913基因型可引入到可与玉米(包括野生型玉米物种)繁育的任何植物品种中，并因此以这种方式繁殖的品系的列表不应受到限制。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种包含至少第一和第二DNA序列(其连接形成连续核苷酸序列)的玉米植物，其中第一DNA序列位于接合序列内并且包含选自SEQ ID NO：8的核苷酸1-116和6307-6424及其互补物的至少约10个连续核苷酸，其中第二DNA序列位于插入的异源DNA序列内并且包含选自SEQ ID NO：8的核苷酸117-6306及其互补物的至少约10个连续核苷酸；和其中第一和第二DNA序列可用作探针或核苷酸引物以检测生物样品中玉米事件ME240913核酸序列的存在。在该实施方案的一个方面，在DNA扩增方法中使用核苷酸引物，以从提取自玉米植物的标准DNA扩增目标DNA序列，并且通过产生对应于包含SEQID NO：11、15及其互补物的DNA序列的扩增子，可从其他玉米植物中鉴定出该玉米植物。

在一个实施方案中，本发明涉及一种玉米植物，其中基因型ME240913赋予玉米植物对鳞翅类害虫的抗性。在该实施方案的一个方面，赋予本发明玉米植物对鳞翅类害虫的抗性的转基因基因型包含截短或修饰的cry1Da基因。

在另一个实施方案中，玉米植物表达合适的叶浓度的截短的cry1Da蛋白，该蛋白经修饰以向植物叶提供高水平的保护以免草地贪夜蛾的损伤。在另一个实施方案中，发现在巴西的几种草地贪夜蛾群体中发生高水平的植物叶保护，所述群体包括已知具有高频率cry1F抗性草地贪夜蛾的群体。在另一个实施方案中，来自玉米植物ME20913的cry1Da基因的插入在叶组织中产生截短和修饰的cry1Da蛋白的充分表达，从而对易感鳞翅类物种(包括草地贪夜蛾)产生高度毒性。在仍然另一个实施方案中，玉米植物ME20913对Cry1F抗性草地贪夜蛾具有高度毒性。

在仍然另一个实施方案中，本发明提供一种用于产生对鳞翅类害虫具有抗性的玉米植物的方法，其包括以下步骤：将第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物进行有性杂交，其中所述第一或第二亲本玉米植物包含事件ME240913的DNA，以产生多个第一代后代植物；选择包含事件ME240913的第一代后代植物。优选地，方法进一步包括将第一代后代植物进行自交，以产生多个第二代后代植物；并从第二代后代植物中选择包含事件ME240913的一种植物。在一个实施方案中，选择步骤可基于评价对鳞翅类害虫的抗性，根据本发明教导的方法检测事件ME240913DNA或用除草剂处理并选择事件ME240913中存在的除草剂抗性基因PAT(bar)促进的除草剂抗性植物。在一个优选的实施方案中，用于产生本发明包含特有核酸的转基因玉米植物的方法包括将含有事件ME240913的第一亲本玉米植物与第二非转基因亲本玉米植物进行有性杂交以产生后代植物，选择对鳞翅类害虫侵染具有抗性的第一代后代植物，重复回交周期4次，将含有事件ME240913的亲本植物进行自交，以获得纯合植物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种产生杂交玉米种子的方法，其包括以下步骤：种植包含事件ME240913的第一先天性玉米品系的种子及具有不同基因型的第二先天性品系的种子；将两种不同的先天性品系进行有性杂交；并收获由此产生的杂交种子。在一个优选的实施方案中，方法包括至少一个以下步骤：栽培由所述种植产生的玉米植物直至花季，并去雄其中一种先天性玉米品系的植物花朵。在该实施方案的一个方面，第一繁育玉米品系提供雌性后代。在该实施方案的一个方面，第一繁育玉米品系提供雄性后代。本发明进一步涉及通过本发明方法产生的杂交种子以及从该种子生长的杂交植物。

以下实施例的唯一目的为说明本发明的一个或多个优选实施方案，并且不应解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1-基因构建体

含有泛素启动子、优化用于在玉米中表达的编码SEQ ID NO：3的截短Cry1Da杀虫蛋白的氨基酸序列的SEQ ID NO：1的核苷酸序列和农杆菌属胭脂碱合酶基因的3’区域的基因构建体，在DNA克隆服务(DNA Cloning Service)(http：//www.dna-cloning.com/)处合成于pUC载体中，侧翼为HindIII和EcoRI限制性位点。按照制造商的说明(LifeTech)，使用EcoRI和HindIII限制酶及T4连接酶，使构建体从pUC转移至pTF101载体(Paz等人，2004)。使用大观霉素通过转化大肠杆菌DH5a进行重组pTF101 UBI：：cry1Da：：NOS质粒的选择，并通过测序及用HindIII和BamHI酶切割来确认克隆。对于测序，使用商业试剂盒BigDyeTerminator v3.1(Applied Biosystems)。对来自两个含有基因构建体的细菌菌落的质粒DNA进行测序，并与感兴趣的序列进行比较，且发现它们为相同的。

一旦确认UBI：：cry1Da：：NOS基因克隆到质粒pTF101中，就使用电穿孔方法(BioRad/MicroPulser)将这种基因构建体用于转化根癌农杆菌EHA101菌株。进行与以上确认转化相同的程序以证明在根癌农杆菌中存在含有cry1Da基因的二元载体。从根癌农杆菌菌落中分离质粒DNA，用引物扩增以检测bar基因。

含有感兴趣的基因构建体(UBI：：cry1Da：：NOST和35S：：bar：：35T)的根癌农杆菌EHA101用于对玉米进行遗传转化。

实施例2-经根癌农杆菌对未成熟HiII玉米胚的遗传转化

根据Frame等人(2002)的方案稍作修改，该转化方案中使用的基因型为HiII玉米(Armstrong等人，1991)。简言之，对于这种基因型的转化，收集长度在1.8-2.0mm之间(授粉之后10-12天)的未成熟胚。将用于收集胚的穗浸入商业漂白剂(2.5％次氯酸钠)和含有1-2滴Tween 20的蒸馏H

借助于刮刀，从谷粒的浅表切口收集未成熟胚。为将基因构建体转移至玉米，使用根癌农杆菌EHA101。从在-80℃下保存于甘油中的含有感兴趣的基因构建体的根癌农杆菌的储用培养物，在含有必要抗生素(100mg.L

对于未成熟玉米胚的感染，在1mL感染培养基加乙酰丁香酮中收集50-100个胚。在收集之后，将胚漂洗两次，加入1mL细菌培养物，并使悬浮液在23℃下温育5分钟。在感染之后，将胚转移至共培培养基(4.0g.L

将选择的愈伤组织转移至再生培养基(4.62g.L

将测量长度约5cm(14-20天)的根和叶结构发育良好的幼苗移植到含有土壤和有机质的市售混合物(2/3土壤和1/3有机质(TDP 30/15))的温室中的盆中，具有中间适应阶段。

在获得带有事件ME240913的Hill基因型之后，使用分子标志物辅助选择将事件从HiII基因型基因渗入至热带L3品系中。

实施例3-生物测定

为评价表达截短的Cry1Da蛋白的转基因玉米对草地贪夜蛾的易感性，在实验室进行了生物测定。

生物测定如下进行：将新近孵化的草地贪夜蛾毛虫用于侵染转基因cry1Da玉米植物和非转基因同基因品系(isoline)的叶(每株植物5条毛虫)。使用的玉米发育阶段为V7和V8，并且实验在塑料容器中进行，且在适应的生长室(28℃和60％湿度，光照12小时)中温育。损伤评分的评价在05天之后进行。在每种情况下，实验设计由“实验组”(含有截短的cry1Da构建体的转基因玉米的事件ME240913)和“对照组”(非转基因玉米)组成。

评估的参数为：使用1970年由Carvalho提出的量表的损伤评分(0：植物的叶未损伤；1：植物的叶变薄；2：植物的叶穿孔；3：植物的叶撕裂；4：植物显示柱体损伤，和5：植物显示柱体破坏)；毛虫存活率(计数每个盆中存活毛虫的数量)；和毛虫生物量(使用四位小数点的精确度等级)。

实施例4-使用转基因玉米事件ME240913防控草地贪夜蛾的生物测定

草地贪夜蛾测定：首先，测试事件ME240913对这种害虫的防控。使事件种子在温室中发芽，并且当植物达到V10和V12叶期之间的阶段时，将每株植物的两片最年轻叶用于草地贪夜蛾生物测定。进行了3次重复，每次重复5条毛虫。HiII和L3玉米叶用作阴性对照(毛虫正常生长)，和

表1-草地贪夜蛾防控中事件ME240913的评估

重复用该事件进行的生物测定，使用4次重复，每次重复20条毛虫，并且结果证实，该事件具有防控草地贪夜蛾发育的能力(表2)。图3代表在非转基因玉米和本发明的转基因玉米中的草地贪夜蛾摄食生物测定。在该实验中，没有使用以Viptera玉米基因型进行的处理。

表2-比较的转基因玉米事件对草地贪夜蛾防控的评估(生物测定2)

实施例5-暴露于来自含有事件ME240913的两种遗传背景的新鲜叶组织

在该实验中，使用Helix L85品系X Embrapa L3 ME240913品系杂合体1(叶V8和V9)。杂合体2为HiII ME240913 X Embrapa L3品系(V5和V6叶)和对照为Helix L85品系XEmbrapa L3品系杂合体(V8和V9叶)。两个杂合体对事件ME240913均为杂合的。

使用金属切割器切割直径为1.8cm的新鲜叶的圆盘，并将其置于128孔塑料生物测定托盘(Bio-Ba-128，CD International，Pitman，NJ，USA)中的2.0％琼脂(1mL/孔)中。

来自Embrapa Milho e Sorgo的秋粘虫(草地贪夜蛾)的易感标准实验室群体，即Omoto等人2016使用的相同群体(Omoto，C.，Bernardi，O.，Salmeron，E.，Sorgatto，R.J.，Dourado，P.M.，Crivellari，A.，Carvalho，R.A.，Willse，A.，Martinelli，S.，& Head，G.P.(2016).Field-evolved resistance to Cry1Ab maize by Spodoptera frugiperda inBrazil.Pest Management Science，72(9)，1727-1736.)，在测试中用作易感性标准，维持于人工膳食而没有任何杀虫或Bt选择压力。

使用细刷将新近孵化的幼虫(0-24小时)置于含有叶盘的每个孔中。平板用Bio-CV-16粘合剂(C-D International，Pitman，N.J.，USA)密封，并置于适应室中(温度26±1℃；相对湿度60±10％；14：10h光：暗光周期)。每次处理使用120条幼虫。

暴露24小时之后评价死亡率，并然后每天评价死亡率，直至100％死亡率。死毛虫被认为是对刷的触碰没有反应的那些毛虫。

表达来自事件ME240913的叶组织的新鲜玉米叶从饲喂之后第二天起导致草地贪夜蛾死亡，和3天之后100％死亡。在测试的两种杂合体中观察到相同的快速和完全死亡模式。结果如图4所示。

实施例6-暴露于在人工膳食中以1∶25稀释的事件ME240913的叶冻干组织

该实验评价在含有事件ME240913的Helix L85 X Embrapa L3品系(在V8和V9阶段收获的叶)之间繁育的事件ME240913和作为对照的Helix L85 X Embrapa L3品系的杂合体(叶V8和V9)。将结果与使用同样在V8和V9阶段收获的对照杂合体Helix L85 X Embrapa L3的叶获得的那些结果进行比较。

上述两种玉米杂合体的约7株植株在生长27天之后收获。将V8和V9发育阶段之间的叶置于用液氮冷冻的塑料袋中，并转移至-80℃的超低温冰箱中。使用冷冻干燥冻干叶组织。冻干之后，使用组织研磨机(IKA A11 Basic)研磨材料。在室温下把冻干和研磨的叶样品储存于带有密封盖的塑料杯中。

以4％(w/w)在用于草地贪夜蛾的人工膳食中，以1∶25的比率制备冻干的转基因玉米叶。阴性对照含有4％冻干的非转基因组织。约1L的草地贪夜蛾人工膳食为按照修改方案制备的，所述修改方案仅含有总量为常规方案的56％的琼脂。根据需要将膳食冷却并在水浴中保持于55℃下。对于每次处理，将160g草地贪夜蛾膳食添加至含有预先称重的冻干组织的塑料杯中。用刮刀混合片状组织直至视觉上均匀。将混合物转移至一端有孔的厚塑料袋中，并通过将膳食压过整个袋子(作为裱花袋)，将膳食添加至生物测定托盘(128孔CD-International托盘)中的每个孔中。对于每种转基因和非转基因材料，将约0.8ml膳食/叶粉混合物分配到128个单独的孔中的每一个中(总共256个)。

如上述测试中所述，使用标准易感草地贪夜蛾群体。

使用细刷将新近孵化的幼虫(0-24小时)置于每孔中。平板用Bio-CV-16粘合剂(CDInternational，Pitman，NJ，USA)密封，并置于适应室中(温度26±1℃；相对湿度60±10％；14：10h光：暗光周期)。

在暴露之后第3、6-10和13-14天记录死亡率。当通过细刷触碰时没有移动的明显不活动的幼虫被认为是死亡的。

在该实验中，第7天观察到67％的死亡率和在第14天观察到97％的死亡率(125/128幼虫)。与以对照(对照)叶组织为食的幼虫相比较，其余3条幼虫显示出显著的生长抑制。

图5说明新近孵化的草地贪夜蛾毛虫的存活率(％)结果，如在从事件ME240913和对照的叶获得的人工膳食中暴露于以1∶25的比率的冻干叶之后长达14天评价的。

实施例7-在由来自不同来源的6种不同草地贪夜蛾群体侵染的田野中，在事件ME240913的玉米植物中针对叶损伤的保护从Helix L85 X Embrapa L3品系之间的杂合体获得对照植物。从Helix L85 x Embrapa L3 ME240913品系之间的杂合体获得含有事件的植物。

如所描述的，在巴西6个不同玉米生产场地于幼虫阶段收集天然存在的草地贪夜蛾群体：两个群体收集于巴拉那州(State of Paraná)(Palotina和Ivatuba)，两个收集于马托格罗索州(State of Mato Grosso)(Rondonópolis和Campo Verde)和两个收集于米纳斯吉拉斯州(State of Minas Gerais)(Paracatu和Sete Lagoas)。幼虫在实验室条件下用人工膳食饲养直至成年(周期约～30天)而没有来自杀虫剂或Bt的任何选择压力。然后在田野条件下，使新近孵化的幼虫在V4生长阶段的植物上进行侵染。

处理由两种杂合体和六种昆虫群体的组合组成，具有3个重复。种植了各自5行的5米长的地块；这些地块的侵染在用于评价的3个中心行中进行。其余两行用作缓冲区(边界)。

根据Davis等人1992，对由以玉米植物为食的毛虫引起的损伤进行了评价。总之，使用了从0到9的等级，其中0代表没有损伤的植物和9代表具有扩展叶破坏的植物。因此，等级的单位增加代表较高的叶损伤水平。

在暴露之后7、14和21天时记录田野评分。

使用玉米杂合体L85XL3的防控处理的叶的平均视觉损伤，对6种不同草地贪夜蛾群体在对照处理中产生了在3.4-5.19的范围内的侵染评分，而在表达Cry1Da的杂合体中侵染评分接近零。也就是说，在含有具有Cry1Da的事件的杂合体中评价的植物平均评分要小得多(＜0.1)。

图7说明由在田野中以不表达事件ME240913的常规杂合体(conv)和玉米杂合体ME240913为食的不同草地贪夜蛾群体(±置信区间，概率为5％)引起的从0至9的损伤评分结果(Davis等人，1992量表)。评价在侵染之后14天进行。

图8A-8F显示从Helix-L85 x Embrapa-L3品系之间的繁育获得的单一对照(常规)杂合体(照片左侧)及其含有事件的Helix-L85 x具有事件ME240913的Embrapa-L3的相应同基因版本(照片右侧)。每张照片显示分别由在巴西以下地点收集的6种不同草地贪夜蛾群体中的每一种侵染的常规版本和含有事件ME240913的版本：在Palotina-PR(8A)、Rondonópolis-MT(8B)、Rondonópolis+Campo Verde-MT(8C)、Paracatu-MG(8D)、Sete Lagoas-MG(8E)和Ivatuba-PR(8F)收集的群体。在每张照片左侧的对照中观察不到叶损伤，而含有事件ME240913的杂合体(每张照片右侧的杂合体)显示没有损伤。

实施例8-使用对含有Cry1F基因的转基因玉米具有抗性的毛虫群体的生物测定

进行测定以验证事件ME240913在防控对Cry1F蛋白具有抗性的草地贪夜蛾群体中的潜力。

通过种植含有事件ME240913的转基因玉米和非转基因玉米(阴性对照)，在温室中进行实验。将属于两种不同草地贪夜蛾群体(一种对Cry1F基因具有抗性的群体和另一种对同一基因敏感的群体)的新近孵化的幼虫接种于处于V7和V8阶段的玉米植物上(每株植物15条毛虫)。侵染之后，用纱虫笼(voil cage)隔离盆，并在7、14和21天之后进行损伤评价。实验设计由各自具有5个盆的4种处理组成，每盆含有2-3株玉米植物：

处理1：根据Leite等人，2016，用对Cry1F蛋白具有抗性的草地贪夜蛾群体侵染转基因事件ME240913。

处理2：根据Leite等人2016，用Cry1F抗性草地贪夜蛾群体侵染非转基因同基因L3品系。

处理3：用在Embrapa Milho e Sorgo昆虫学实验室中饲养和维持的易感毛虫群体侵染转基因事件ME240913。

处理4：用在Embrapa Milho e Sorgo昆虫学实验室中饲养和维持的易感毛虫群体侵染非转基因同基因品系。

结果表明，包含事件ME240913的转基因植物能够通过抑制其发育(图9)和保护植物免受这种害虫的攻击，如易感群体一样有效地防控Cry1F蛋白抗性草地贪夜蛾群体的侵染，正如通过损伤评分(±CI，P＝0.05)所观察到的。如在不同处理下释放毛虫之后21天评价的，草地贪夜蛾的存活百分比对于处理1和3为0％，和对于处理2和4分别为约65％和35％。如将毛虫置于不同处理下之后21天评价的，草地贪夜蛾生物量对于处理1和3为0％，和对于处理2和4分别为约260mg和300mg。在两者情况下，非重叠CI平均值彼此不同(P＝0.05)。

实施例8描述了使用密码子优化的Cry1Da序列以生产表达截短的Cry1Da序列的玉米植物，该截短的Cry1Da序列对野生型和Cry1F抗性草地贪夜蛾群体两者均具有高毒性水平(100％死亡率)。当使用来自事件ME240913的新鲜叶喂食这些草地贪夜蛾群体时，鉴定出在对Cry1F具有抗性的草地贪夜蛾群体中死亡率为100％这一事实证实以下事实：从Cry1Da基因表达的截短和密码子修饰的蛋白通过与含有Cry1F基因的商业事件中存在的机制不同的机制发挥作用。

生物材料保藏

来自上文公开的事件ME240913的玉米种子根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)以登录号PTA-126224于2019年10月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，1801University Boulevard，Manassas，VA 20110。