乳腺癌肺特异性转移的标志物及其药物组合物与应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌的肺特异性转移的标志物及其药物组合物与应用。本专利研究发现RGCC在乳腺癌肺特异性转移细胞中高度表达，通过影响PLK1激酶的活性，进一步激活AMPKα2和下游信号，从而调节参与TNBC肺特异性转移的氧化磷酸化和脂肪酸氧化；表明RGCC可作为乳腺癌肺特异性转移的生物标志物，RGCC/PLK1/AMPK2轴可作为乳腺癌肺转移的重要治疗靶点。本专利还提供了一种用于预防或治疗乳腺癌肺特异性转移的药物组合物，靶向RGCC与与PLK1抑制剂、AMPK活性抑制剂、化疗方案等联合应用，可有效抑制乳腺癌细胞向肺转移，减少肺转移结节，延长肺转移的乳腺癌患者生存期。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌的肺特异性转移的标志物及其药物组合物与应用。

背景技术

乳腺癌是全世界女性最常见的致命恶性肿瘤，三阴性乳腺癌(TNBC)则是所有乳腺癌亚型中侵袭性最强、预后最差的一种亚型。TNBC患者90％以上的死亡率归因于具有不同器官转移部位的癌症转移，其中，肺是TNBC转移的常见部位。然而，TNBC转移的确切机制，尤其是驱动因素，对本领域技术人员来说尚不清晰。因此，识别驱动转移的关键调节因子并深入研究将有助于探索更有效的转移靶向策略和药物开发。

肿瘤的远处转移是一个极具挑战性的过程，只有少数播散性肿瘤细胞(DTC)能够在继发部位存活。作为恶性肿瘤的一个基本特征，代谢重编程在癌症进展和转移中起着关键作用。这些播散的肿瘤细胞通过代谢重编程在播散和定植过程中获得了保持进化的有利特征。线粒体作为细胞能量代谢的主要参与者，在肿瘤进展中发挥着许多关键功能。例如，据报道，PGC-1α介导的线粒体生物发生和氧化磷酸化在乳腺癌转移中起着重要作用。与正常前列腺癌细胞不同，前列腺癌细胞在病理变化期间逐渐转向线粒体氧化磷酸化依赖性代谢。然而，在转移性肿瘤细胞中，尤其是在器官转移性肿瘤中，线粒体代谢是否普遍活跃尚不清楚。

AMPK是一种异三聚体复合物，可以在能量代谢应激的条件下被激活，使其充当细胞的能量传感器。通常，AMPKα2(AMPK复合亚基)中苏氨酸残基(Thr172)的磷酸化诱导AMPK的高活性。先前的研究表明AMPK是一种肿瘤抑制剂，但越来越多的研究似乎对这一传统概念提出了挑战。AMPK通过维持NADPH的主要功能，在能量应激期间促进肿瘤细胞的存活。另一项研究发现，AMPK介导的PDHA(丙酮酸脱氢酶复合物)磷酸化驱动肿瘤肺转移。然而，AMPK的激活是否有助于肿瘤细胞在远处器官部位的定植和存活，以及AMPK活性的潜在调节机制仍有待阐明。

RGCC，也称为RGC32，是补体应答基因。RGCC的表达受到多种因素的刺激和诱导，包括补体、生长因子、细胞因子、促血管生成因子和激素，并在细胞迁移、分化和纤维化中发挥主要作用。此外，RGCC通过直接结合CDK1并增强其激酶活性，促进主动脉平滑肌细胞进入S期。另一项研究表明，RGCC可以通过调节葡萄糖代谢相关基因(GFPT1、GLUT2和GLP2R)来改善碳水化合物胁迫下的葡萄糖漂移，以维持血糖稳态。在多种原发性恶性肿瘤中观察到RGCC的异常表达，无论是鼓励还是阻止肿瘤在不同的恶性环境中的生长。在人类肺癌LTE细胞中，RGCC的下调显著降低了LTE细胞的增殖、迁移和侵袭。相反，RGCC诱导G2/M阻滞并抑制胶质瘤细胞的生长。迄今为止，RGCC在肿瘤器官转移中的功能作用鲜有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种RGCC在制备用于诊断乳腺癌肺特异性转移的标志物中的应用，RGCC在乳腺癌肺特异性转移细胞中高度表达，可作为TNBC肺转移的潜在诊断因素。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

RGCC在制备用于诊断乳腺癌肺特异性转移的标志物中的应用。

进一步，所述RGCC在NCBI数据库中的Gene ID为28984。

进一步，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

进一步，所述RGCC在乳腺癌肺特异性转移的细胞中特异性上调。

进一步，所述乳腺癌肺特异性转移的细胞为嗜肺转移性三阴性乳腺癌细胞。

本发明的目的之二在于提供一种检测RGCC表达水平的试剂在制备用于乳腺癌肺特异性转移预后诊断的产品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

检测RGCC表达水平的试剂在制备用于乳腺癌肺特异性转移预后诊断的产品中的应用。

进一步，所述检测RGCC表达水平的试剂为检测RGCC mRNA和/或蛋白表达水平的试剂。

本发明的目的之三在于提供一种RGCC抑制剂在制备乳腺癌细胞肺转移的治疗药物中的应用，本专利研究发现RGCC是肺特异性转移性TNBC的关键驱动因素，可作为乳腺癌肺特异性转移的重要治疗靶点。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

RGCC抑制剂在制备乳腺癌细胞肺转移的治疗药物中的应用。

研究发现，肺特异性转移中CEBPA与RGCC呈负相关，通过促进CEBPA过表达有助于RGCC的下调，进而抑制乳腺癌细胞向肺转移。

进一步，所述RGCC抑制剂包括CEBPA促进剂。

本发明的目的之四在于提供一种RGCC抑制剂和PLK1抑制剂的联合应用在制备用于抑制乳腺癌细胞肺转移的药物中的应用。

TNBC细胞中高表达的RGCC直接结合并刺激PLK1的激酶活性，产生AMPKα2的磷酸化，以调节线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)和脂肪酸氧化，从而促进肺转移；因此，通过抑制RGCC表达、PLK1激酶活性、氧化磷酸化和脂肪酸氧化可有效抑制乳腺癌细胞向肺转移。

本发明的目的之五在于提供一种用于预防或治疗乳腺癌肺特异性转移的药物组合物。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于预防或治疗乳腺癌肺特异性转移的药物组合物，所述药物组合物含有以下任一项或多项的组合：

1)靶向RGCC的药物和/或RGCC抑制剂；

2)CEBPA促进剂；

3)PLK1激酶抑制剂；

4)AMPK活性抑制剂；

5)氧化磷酸化抑制剂和/或脂肪酸氧化抑制剂；

6)紫杉醇和/或卡铂。

进一步，所述药物组合物在制备抑制乳腺癌细胞向肺转移、减少肺转移结节、延长肺转移的乳腺癌患者生存期的产品中的应用。

乳腺癌患者的死亡率几乎总是由转移引起，而器官向性(器官特异性)是肿瘤转移和扩散的一个重要特征，尽管本领域技术人员已对器官特异性转移进行了一些开创性研究，但转移的精确分子机制仍然严重不足。而本专利研究发现RGCC在TNBC的肺转移中起着关键作用，RGCC在TNBC肺特异性转移细胞中高度表达，其影响PLK1激酶的活性，导致下游AMPKα2磷酸化，从而调节参与TNBC肺特异性转移的氧化磷酸化和脂肪酸氧化。本专利确定了RGCC是肺特异性转移性TNBC的关键驱动因素，并作为TNBC肺转移的潜在诊断因素，以及新确定的RGCC/PLK1/AMPK2轴是TNBC肺转移的治疗靶点。同时，靶向RGCC及其下游信号与化疗方案联合作用，可协同抑制肺转移，并为TNBC肺转移治疗带来明显的治疗效益。

本发明的有益效果在于：

1.本发明首次发现RGCC在嗜肺转移性TNBC细胞中特异性上调，并在其肺特异性转移过程中发挥关键调节作用，RGCC可作为TNBC肺转移的潜在诊断因素。

2.本专利明确了RGCC/PLK1/AMPK2轴则是TNBC肺转移的治疗靶点；RGCC在乳腺癌肺特异性转移细胞中高度表达，通过影响PLK1激酶的活性，进一步激活AMPKα2和下游信号，从而调节参与TNBC肺特异性转移的氧化磷酸化和脂肪酸氧化。RGCC驱动OXPHOS和脂肪酸氧化作为乳腺癌肺特异性转移的重要治疗靶点具有极大的潜在价值，本专利为TNBC肺转移的预防、治疗以及预后提供了一个新的方向。

3.本专利研究发现RGCC在TNBC、结直肠癌、骨肉瘤、胰腺癌以及前列腺癌等多类恶性肿瘤的肺转移中表达增强，各项数据表明肺特异性转移中RGCC的增加与TNBC的不良预后密切相关。RGCC是乳腺癌和其他实体瘤的肺向转移驱动因素。

附图说明

图1A为显示三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的器官转移小鼠模型建立的示意图；图1B为主要器官中MDA-MB-231细胞向肺转移的代表性生物发光图像；图1C为肺转移细胞(LM3)和亲代细胞(P)之间基因表达改变的火山图；左图：4T1，右图：MDA-MB-231；图1D为热图；图1E为不同转移器官中RGCC mRNA表达的相对倍数的图；P：亲代；LM3/HM3/BM3：第三肺/肝/脑转移细胞；图1F为来源于各种器官损伤和亲代细胞的转移性4T1中RGCC蛋白水平的蛋白质印迹分析结果图；

图2A-图2C为基于TCGA数据库的数据集，分析具有不同器官转移的人类乳腺癌亚型(图2A)和BC患者(图2B、图2C)中RGCC表达的结果图；在方框图中，中间线表示中值，底部和顶部线对应于第25和75个百分位数；图2D-图2F为基于来自不同转移性实体瘤的微阵列数据集分析结果图；图2G为Kaplan-Meier分析结果图；

图3A-图3D为静脉注射RGCC敲除的TNBC细胞或对照细胞一个月，显示肺转移的代表性生物发光成像(图3A、图3C)、肺表面结节和H&E图像(图3B、图3D)；图3E-图3H为静脉注射RGCC过表达的TNBC细胞或对照细胞一个月，显示肺转移的代表性生物发光成像(图3E、图3G)、肺表面结节和H&E图像(图3F、图3H)；图3I为以图3A-图3H表示的TNBC转移小鼠的Kaplan-Meier生存分析结果图；

图4A为使用JASPAR数据库分析RGCC启动子中CEBPA的识别基序(上)和示意图(下)；图4B为使用TCGA-TNBC数据集的Pearson相关分析结果图；图4C为293T和MDA-MB-231/LM3细胞的荧光素酶活性结果图；图4D为ChIP测定结果图；图4E为qRT-PCR测定CEBPA对RGCC的调节的结果图；图4F为蛋白质印迹测定CEBPA对RGCC的调节的结果图；图4G为MSP检测结果图；图4H为BC肿瘤和正常组织中的CEBPA甲基化水平的生存方法数据图；图4I为基于CEBPA启动子CpG岛高或低甲基化水平的BC患者Kaplan-Meier生存曲线图；

图5A为Venn图；图5B为与RGCC相互作用的潜在蛋白质的质谱鉴定结果图；图5C为Co-IP测定结果图；图5D为IF共染色结果图；图5E为分子动力学模拟分析结果图；图5F为RGCC和PLK1的最小能量对接相位图；图5G为RGCC敲低或过度表达下PLK1蛋白水平的蛋白质印迹分析结果图；图5H为PLK1激酶测定结果图；

图6A为KEGG通路分析结果图；图6B为磷酸位点数据库分析结果图；图6C为基因集富集分析(GSEA)结果图；图6D为体外激酶活性测试结果图；图6E为RGCC/PLK1轴通过激活AMPKα2促进肺转移的测试结果图；

图7A为假设AMPKα2模型通过氧化磷酸化和脂肪酸氧化促进肺转移的流程图；图7B为JC-1染色测定线粒体膜电位的结果图；图7C为使用Seahorse XF24细胞外通量分析仪检测线粒体耗氧率的结果图；图7D为用微量板读数仪检测脂肪酸氧化的结果图；图7E为用微量板读数仪检测NADPH/NADP+比值的结果图；图7F为通过DCFH-DA探针测量ROS水平的结果图；图7G为在使用或不使用OXPHOS抑制剂(IACS-10759)或脂肪酸氧化抑制剂(Etomoxir)治疗下，RGCC敲除MDA-MB-231/LM3细胞的原位转移的图；每组7只小鼠)；

图8A为紫杉醇和卡铂的IC

图9A为热图；图9B为在脂肪垫中注射4T1细胞30天的小鼠下，主要器官中小鼠4T1乳腺癌细胞向肺转移的代表性生物发光成像；图9C为亲代和衍生细胞中RGCC表达的Western blot分析结果图(231:MDA-MB-231)；

图10-图11为Western blotting检测结果图；图10为4T1和231肺转移细胞中敲低RGCC的情况；图11为MDA-468和HCC1806细胞中慢病毒载体过表达RGCC的情况；图12-图15为Transwell分析结果图；图12-13为敲低RGCC后细胞的侵袭情况；图14-15为过表达RGCC后细胞的侵袭情况。

图16为Venn图；

图17为qRT-PCR测定结果图；

图18为临界预后指数图；

图19A为使用海马XF24细胞外通量分析仪检测基础呼吸的结果图；图19B为通过CCK8测定评估细胞活力的图。

以上附图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，细胞培养方案为：小鼠TNBC细胞系4T1、人TNBC细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-549、Hs578T和HCC1806从美国典型培养物保藏中心(ATCC，USA)获得；4T1和HCC1806细胞在含有10％FBS(HyClone)和1％青霉素/链霉素(中国上海贝奥蒂姆)的1640培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养，其他细胞在含有10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM培养基(Gibco，USA)中培养；所有细胞系均在37℃的5％CO

本发明实施例中，所有动物实验均经重庆医科大学动物护理伦理委员会授权。

本发明实施例中，侵入性transwell分析方案为：肿瘤细胞(2×10

本发明实施例中，RNA制备、qRT-PCR和RNA测序方法为：使用TRIzol试剂(日本Takara)提取总RNA，然后使用PrimeScript RT试剂盒(日本Takara)合成cDNA；使用SYBRPremix Ex Taq II试剂盒(日本Takara)进行定量PCR；第二代RNA测序由盛银生物技术(中国上海)完成，并使用DESeq2软件包进行差异基因表达(DEG)分析。

用于qRT-PCR的实验的所有引物如下：

shNC：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’；RGCC#1(Mus)：5’-GCCAAATTAGGTGACACTAAA-3’；RGCC#2(Mus)：5’-CGAAGACTTCATTGCCGATCT-3’；RGCC#1(Homo)：5’-CCUGCAGUUUGAUGCUGAUTT-3’；RGCC#2(Homo)：5’-CAGAUUCACUUUAUAGGAA-3’。

本发明实施例中，蛋白质印迹分析方案为：TNBC细胞在RIPA缓冲液(Beyotime，中国)中裂解以提取总蛋白；将等量的蛋白质进行SDS–PAGE并转移至PVDF膜(Bio-Rad，美国)；在室温下用5％脱脂牛奶封闭膜1小时，并在4℃下与一级抗体孵育过夜；而后将膜与辣根过氧化物酶偶联的二级抗体在室温下孵育2小时和免疫印迹通过增强化学发光系统(Bio-Rad，Hercules，EDA USA)可视化；所用的一级抗体如下：RGCC(1:1000；#30125；SAB)、CEBPA(1:500；ab40764；Abcam)、PLK1(1:1000，MG67093；abmart)、AMPKα2(1:1000：18167-1-AP；Proteintech)、P-AMPK(Thr172)(1:1000、#50081；细胞信号)、β-肌动蛋白(1:1000)；所有实验重复3次。

本发明实施例中，稳定细胞系的建立和质粒方案如下：

RGCC和对照shRNA NC的慢病毒表达载体从GenePharma(中国上海)获得；乳腺癌细胞(4T1-LM3和231-LM3)由4μg/ml聚胺的慢病毒转导，并根据制造商的说明通过G418(Beyotime，中国)选择稳定的细胞系。

本研究中使用的RGCC和shRNA NC序列的靶序列如下所示：

RGCC(Homo)：F:5’-AACAGACTCTACCCCAGCTCT-3’，R:5’-GGCTTCTAGCTCTTTTGTGTCT-3’；RGCC(Mus)：F:5’-CTCCAACCAACTCCTCTCC-3’，R:5’-GACCCCAAACTCCTTGCT-3’；

CEBPA(Homo)：F:5’-GCCAAGAAGTCGGTGGACAA-3’，R:5’ATTGTCACTGGTCAGCTCCA-3’；CEBPA(Mus)：F:5’-GAGCCCCCTCTGAGTCAG-3’，R:5’-GCAAAAACATCTTGTTGAG-3’；

β-actin(Homo)：F:5’-GCCGAGGACTTTGATTGC-3’，R:5’-CCTGTGTGGACTTGGGAGA-3’；β-actin(Mus)：F:5’-GCTATGCTCTCCCTCACG-3’，R:5’-ACGCACGATTTCCCTCT-3’。

对于RGCC过表达，使用聚胺转染用RGCC野生型或突变质粒(Genechem，中国)转染乳腺癌细胞(MDA-MB-468和HCC1806)，并通过嘌呤霉素选择稳定的细胞系；使用HEK293T和231-LM3细胞通过逆转录病毒感染产生稳定的过度表达RGCC的细胞系；为了获得pGL3 RGCCWT报告子或pGL3 RGCC MUT报告子，将含有CEBPA野生型结合位点(WT)和突变结合位点(MUT)的启动子克隆到pGL3荧光素酶报告子载体(GenePharma，中国)中。

本发明实施例中，细胞活力测定方法为：将细胞以1000/孔的密度接种到96孔板上，并培养特定时间；根据制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8(Beyotime，中国)测量细胞活力。

本发明实施例中，免疫组织化学(IHC)方案为：根据制造商的方案，使用患者或小鼠的组织切片进行IHC染色。具体地，将组织切片在二甲苯中脱蜡以提取抗原，并用山羊血清封闭，然后在4℃下与RGCC(1:150)和p-AMPK(1:1.50)孵育过夜；在室温下用二级抗体孵育切片1小时后，用DAB试剂盒(Beyotime，中国)对切片进行染色，并捕获图像。

本发明实施例中，根据制造商的方案处理细胞，然后测量线粒体膜电位(ΔΨm)和耗氧率(OCR)。

本发明实施例中，细胞中脂肪酸氧化、NADPH和ROS的检测方法为：用市售试剂盒(ab222944，Abcam)检测脂肪酸氧化；根据制造商的方案处理细胞，并通过NAPDH试剂盒(S0179，Beyotime)和ROS试剂盒(SO033S；Beyotime)检测细胞的ROS和NADPH水平；所有测试均严格按照试剂盒手册中的说明进行。

本发明实施例中，生物信息学分析方法为：本发明中查阅的微阵列数据是从基因表达综合数据集收集的，登录号为GSE14020、GSE32489、GSE5327、GSE32981、GSE34153、GSE74685和GSE68468；从GSEA获得的基因集(https://www.broadlnstitute.org/gsea/)并且使用GSEA软件进行基因集富集分析(GSEA)分析。

本发明实施例中，统计分析方法如下：数据表示为平均值±S、D.使用SPSS软件程序(20.0版)和GraphPad Prism(8.0版)进行统计分析；使用Kaplan–Meier分析对小鼠或患者进行生存分析；皮尔逊相关系数用于测试RGCC表达与其他RNA之间的相关性；P<0.05被认为具有统计学意义。

本发明实施例中，RGCC在NCBI中Gene ID为28984。

本发明实施例中，PROMO数据库：http://alggen.lsi.upc.es/；JASPAR数据库：http://jaspar.genereg.net/。

本发明实施例中，本研究涉及的CEBPA甲基化特异性引物和非甲基化特异引物是通过methyprimer在线网站((http://www.urogene.org/methprimer/))设计的并由SangonBiotech(中国上海)合成。

实施例1.小鼠器官转移模型得建立和TNBC的临床预后分析

1.建立三阴性乳腺癌的实验转移模型：以4T1和MDA-MB-231细胞作为亲代细胞，以1×10

如图1A所示，本发明使用荧光素酶标记的TNBC细胞系4T1和MDA-MB-231，通过重复脂肪垫注射和体内转移克隆选择/扩增，生成TNBC的器官特异性转移衍生物；由此产生的亚群根据其来源器官和世代来命名。

2.生物发光成像(BLI)：将小鼠麻醉并通过腹腔注射给予底物D-荧光素(150mg/kg)；成像完成后，通过活体图像软件v.2.50计算每只小鼠的光子通量。

如图1B，图9B所示，LM3衍生物(例如MDA-MB-231/LM3，第三代肺转移细胞)通过体内生物发光成像(BLI)检查，具有显著的肺特异性，而不是其他器官的转移潜能，表明建立了成功的TNBC肺嗜性转移小鼠模型。

3.RNA测序分析

为了确定与肺转移行为相关的基因表达模式，本实施例进行了RNA测序分析，包括两个肺转移细胞(4T1-LM3，231-LM3)与其相应的亲代细胞(4T2-P，231-P)。如图1C所示，褶皱变化的截止阈值>2.0和P<0.05，共有181个基因在4T1/LM3中普遍上调，353个基因下调，而在MDA-MB-231/LM3中共有381个基因上调，269个基因下调。

热图如图1D和图9A所示，该图显示了40个基因的变化，图1D显示了MDA-MB-231/LM3和MDA-MB/231/P细胞之间20个最上调或下调的基因；图9A显示了4T1/LM3和4T1/P细胞之间有20种最上调和下调的RNA；与亲本细胞相比，RGCC是转移衍生物中显著最高的一种。值得注意的是，RGCC的表达仅在肺转移衍生物中检测到，而不是在脑或肝转移中，详见图1E-图1F。此外，随着世代筛选，肺转移瘤中的RGCC蛋白增加，详见图9C。以上数据表明RGCC在促进TNBC向肺转移中的潜在作用。

4.BC患者TCGA数据库(RNAseq数据)中RGCC的表达

为了进一步了解RGCC在乳腺癌肺特异性转移中的临床意义，本实施例分析了BC患者TCGA数据库中RGCC的表达，如图2A所示，与其他乳腺癌亚型相比，RGCC在恶性基底样乳腺癌(TNBC)中的表达最高。对基因表达综合(GEO)中乳腺癌队列数据的进一步分析表明，RGCC的高水平与肺转移而非其他器官转移有关，详见图2B-图2C。本发明还从多个公共数据集中研究了与肺转移相关的其他肿瘤，RGCC的增加在多个实体瘤(如结直肠癌、骨肉瘤、胰腺癌和前列腺癌)的肺转移中共享，而不是在其他器官转移中共享，如图2D-图2F所示，与其他器官转移或原发性肿瘤相比，肺转移中RGCC mRNA表达增加。此外，临床统计分析揭示了TNBC患者RGCC表达与总生存率之间的负相关，详见图2G。以上数据揭示了乳腺癌肺部特异性转移中RGCC的增加，与患者的不良预后密切相关。

实施例2.RGCC促进TNBC向肺转移

为了了解RGCC是否在肺嗜性转移中具有因果作用，它在LM3群体(4T1/LM3/RGCCKD，MDA-MB-231/LM3/RCCC KD)中被稳定敲低(参见图10)，并在选择性TNBC细胞系(MDA-MB-468/RGCC，HCC1806/RGCC)中过度表达(参加图11)，以通过生物发光成像追踪其在小鼠中的转移，如图3A-图3H所示。与对照小鼠相比，LM3中RGCC的缺失显著降低了肺转移结节(图3A-图3D)，延长了携带肺转移的小鼠的生存期(图3I，左图)。而MDA-MB-468和HCC1806中的异位RGCC导致更具侵袭性的转移活性，详见图3E-图3I。与RGCC增加促进体内肺转移的结果一致，RGCC缺陷细胞的细胞侵袭能力显著低于对照细胞，异位RGCC过表达增加了体外细胞侵袭，详见图12-图15。以上数据表明RGCC对TNBC癌细胞的肺转移至关重要。

实施例3.RGCC受CEBPA负调节

1.为了探讨肺特异性转移中RGCC上调的潜在机制，本实施例通过PROMO数据库进行生物信息学分析，以确定RGCC基因的潜在转录因子(TF)并且鉴定了一个重叠的TF(CEBPA)，如图16所示。根据这一发现，两种LM3衍生物中的CEBPA(抑制剂1，2)均减少，详见图17。本实施例使用JASPAR数据库进行进一步分析揭示了RGCC启动子中潜在的CEBPA结合共有序列(E1)，详见图4A。

2.双荧光素酶报告物测定和染色质免疫沉淀(CHIP)分析

用Lipofectamine 3000将pGL3 RGCC WT报告子或pGL3 RGCC MUT报告子转移到细胞中，并使用Renilla荧光素酶报告子载体(PRL-TK载体)作为对照；收集细胞裂解物，并使用双荧光素酶报告物测定系统(Promega，USA)测量雷尼拉和萤火虫的荧光素素酶活性；使用ChIP试剂盒(Thermo，MA，USA)根据制造商的说明使用cebpa和IgG抗体进行ChIP测定；共沉淀RNA用于cDNA合成并通过qRT-PCR定量；本研究中使用的芯片引物序列如下所示：

CEBPA(Mus)：

F:5’-AGGGGAACTTAGAACCTTGTGGGAA-3’，R:5’-AGGCTTCCTTCTGATGGCCAACCCA-3’；

CEBPA(Homo)：

F:5’-AGATTGCGCACCATTAGAAGTGGGT-3’，R:5’-TTAGAAACAAGGGACCTGTCCAGGC-3’。

RGCC水平与TCGA数据库中的CEBPA呈负相关，如图4B所示。荧光素酶活性显示了CEBPA对293T和MDA-MB-231/LM3细胞中RGCC转录物的调节；荧光素酶报告评估结果表明，CEBPA过表达细胞中RGCC的转录活性明显降低，详见图4C；染色质免疫沉淀分析验证了CEBPA与用CEBPA或对照载体转染的MDA-MB-231/LM3中RGCC启动子的结合亲和力；进一步证实了荧光素酶活性检测的结果，详见图4D。相应地，CEBPA过表达显著降低了4T1-LM3和231-LM3细胞中RGCC mRNA(参见图4E)和蛋白质表达(参见图4F)。

3.甲基化特异性PCR(MSP)

根据制造商的说明提取细胞基因组DNA，并用亚硫酸盐修饰1μg。MSP反应系统20μl；最终产品暴露后，将产品进行琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像仪(Bio-Rad，USA)拍摄以进行记录；用于MSP的所有实验引物如下所示：

CEBPA-Left-M：TTGGAGATTAGAGTTAGGAGACGT；CEBPA-right-M：ACACGAAATAAAAATAAAAAACGAA；

CEBPA-Left-U：TTTGGAGATTAGAGTTAGGAGATGT；CEBPA-right-U：ACACAAAATAAAAATAAAAAACAAA。

其中，M：Methylation primer(甲基化特异引物)；U：Unmethylation primer(非甲基化特异引物)。

CEBPA作为肿瘤抑制因子在多种癌症中被下调，这是由于白血病中DNA甲基化的表观遗传调控而被证实的。通过分析SurvivalMeth数据库发现CEBPA启动子上有两个甲基化位点。使用针对这些甲基化位点的探针，肿瘤中的甲基化水平明显高于正常组织，详见图4H。根据最佳临界预后指数(参见图18)，高风险组的BC患者生存概率显著低于低风险组，详见图4I。本实施例使用甲基化特异性聚合酶链反应检测(MSP)，与亲本细胞相比，在MDA-MB-231/LM3细胞中检测到CEBPA启动子的高甲基化，并且用去甲基化药物descitabine处理细胞可以降低MDA-MB/231/LM3中的高甲基水平，详见图4G。以上结果表明，肺特异性转移中CEBPA的降低有助于RGCC的上调。

实施例4.RGCC刺激PLK1激酶活性

1.体外PLK1激酶测定

根据制造商的说明，使用通用激酶活性试剂盒(研发系统)测量具有或不具有rgcc的特异性PLK1激酶活性。激酶活性取决于激酶反应中产生的ADP的量，这可以通过ADP释放的无机磷酸盐的浓度和激酶反应的偶联率来确定。激酶反应使用孔雀石绿试剂终止，并在600nm处测量光密度以确定磷酸化AMPK的量。

2.免疫沉淀和LC-MS/MS

(1)免疫沉淀：使用磁性蛋白A/G免疫沉淀珠(B23202，Bimake)进行免疫沉淀测定；RGCC和PLK1抗体用于免疫沉淀。具体的，在用NP40(P0013F，Beyotime)在冰上裂解30分钟后，将细胞以12000g离心30分钟；然后收集上清液；少量裂解物作为输入组；根据制造商的方案进行免疫沉淀反应；免疫沉淀后，洗涤珠粒并通过Western Blot分析。

(2)LC-MS/MS分析：用抗RGCC琼脂糖珠免疫沉淀稳定表达RGCC的231-LM3细胞。用适量的25mM NH

据先前研究报道，RGCC结合蛋白激酶并增强其激酶活性。为了研究RGCC在肺特异性转移中的分子机制，利用Inbio discover、String和Biogrid数据库进行了生物信息学分析，以预测RGCC的靶基因，如图5A所示，研究发现四个潜在的RGCC靶点，包括蛋白激酶PLK1和CDK1。

通过分离MDA-MB-231/LM3细胞中的RGCC相关蛋白复合物，并利用亲和纯化和液相色谱串联质谱进行鉴定。图5B为与RGCC相互作用的潜在蛋白质的质谱鉴定结果图，如图5B所示，PLK1在猎物列表中被识别；图5C为Co-IP测定结果图，以分别使用抗RGCC或抗PLK1的抗体确认MDA-MB-231/LM3细胞中RGCC和PLK1之间的直接相互作用，结果显示，RGCC与MDA-MB-231/LM3细胞中的PLK1直接结合；图5D为IF共染色结果图；免疫荧光染色检查结果显示，RGCC和PLK1主要共同定位在4T1/LM3和MDA-MB-231/LM3细胞的细胞质中。

为了了解RGCC是否会影响其PLK1的激酶活性，选择了具有最有利的结合自由能和合理取向的配体结构作为最佳对接构象，如图5E所示，RGCC和PLK1之间稳定结合。此外，PLK1蛋白和RGCC蛋白可以形成稳定的氢键相互作用网络，氢键相互作用氨基酸位点包括LEU-491和HIS-56、TYR-417和ASP-36、PHE-535和HIS-47以及其他氨基酸残基，详见图5F，它们有助于RGCC和PLK1之间形成稳定的复合物(结合能：-79.81kcal/mol)；在20ns模拟后，结合构象稳定。值得注意的是，RGCC敲低或过度表达下PLK1蛋白水平的蛋白质印迹分析结果显示，随着RGCC的沉默或过度表达，PLK1的表达没有显著变化，详见图5G。在此前提下，对激酶活性进行了测试，结果如图5H所示，数据表明RGCC对PLK1的激酶活性有很大影响，PLK1的EC50(达到50％最大激活所需的浓度)值较低(0.01936μM)。以上结果表明，RGCC可以有效地促进PLK1的激酶活性。

实施例5.RGCC/PLK1轴通过激活AMPKα2促进肺转移

本实施例进一步研究RGCC/PLK1轴介导的下游靶点，对来自GEO数据库(GSE157684)的大脑类器官队列中RGCC敲除和对照的相关基因表达谱进行了分析。图6A为KEGG通路分析结果，显示SangerBox使用微阵列数据集GSE157684分析的与RGCC相关的信号，结果表明，基于KEGG途径富集分析，RGCC可能主要负责调节AMPK和氧化磷酸化信号通路。同时，通过分析磷酸位点数据库发现，AMPK信号通路与PLK1的潜在磷酸化底物重叠(图6B)，基于PLK1潜在的磷酸化蛋白，SangerBox富集了与PLK1相关的重要途径。

先前的研究还表明，PLK1可以磷酸化AMPKα2(AMPK的催化亚基)，磷酸化的AMPKα1刺激强烈的AMPK信号，这通过促进分解代谢，特别是氧化磷酸化和脂肪酸氧化，导致代谢重编程。值得注意的是，GSEA分析结果显示，增强的RGCC与氧化磷酸化和脂肪酸氧化呈正相关，即RGCC表达与脂肪酸氧化和氧化磷酸化呈正相关，详见图6C。因此，为了证明RGCC是否能够通过PLK1促进AMPKα2的磷酸化，进行了体外激酶活性测试，数据证实RGCC和PLK1的协同作用显著增加了AMPKα2磷酸化，详见图6D。为了验证RGCC/PLK1轴通过激活AMPKα2促进肺转移，使用构建的MDA-MB-468/RGCC细胞的混合物通过尾静脉注射在体内测试其转移潜力。如图6E所示，与植入对照MDA-MB-468细胞的小鼠相比，植入RGCC过表达MDA-MB-468细胞的小鼠具有显著增加的肺转移；然而，在注射Volasertib(一种PLK1激酶抑制剂)或Dorsomorphin(一种AMPK活性抑制剂)的情况下，MDA-MB-468/RGCC注射小鼠的肺转移显著减少。以上结果表明，增强的RGCC通过RGCC驱动的PLK1活性在体内激活AMPKα2，以促进TNBC肺转移。

实施例6.RGCC/PLK1/AMPK2信号轴通过调节线粒体氧化磷酸化和脂肪酸氧化介导TNBC细胞肺转移

作为一种经典的能量传感器，AMPK参与调节代谢重编程，使转移癌细胞能够适应具有代谢压力的恶劣环境，并在次要部位茁壮成长。据报道，氧化磷酸化和脂肪酸氧化可提高癌细胞的存活和转移。因此，本发明提出了一个假设，即AMPK可能分别通过线粒体氧化磷酸化和脂肪酸氧化促进TNBC细胞的肺部定植和转移，参见图7A。一方面，RGCC缺陷细胞表现出线粒体活性降低(参见图7B)、线粒体耗氧率(OCR)降低(参见图7C)和基础呼吸率降低(参见图19A)；用Volasertib或Dorsomorphin处理的肿瘤细胞显示出与RGCC缺陷细胞中获得的相似的线粒体活性、OCR和基础呼吸率，详见图7B、图7C和图19A。另一方面，RGCC敲除细胞或用Volasertib或Dorsomorphin处理的细胞的脂肪酸氧化水平较低(参见图7D)，NADPH/NADP+比率降低(参见图7E)，ROS水平升高(参见图7F)。结果表明，RGCC/PLK1/AMPK2信号传导对肺转移性TNBC细胞的OXPHOS和脂肪酸氧化起关键作用。

为了了解RGCC/PLK1/AMPK2轴介导的代谢重编程是否会影响肺转移细胞的存活，从而在肺转移中发挥虚拟作用，从而评估肺转移的形成。正如预期的那样，RGCC缺乏、使用ACS-10759(一种氧化磷酸化抑制剂)抑制OXPHOS或使用依托莫司(一种脂肪酸氧化抑制剂)抑制脂肪酸氧化明显降低了细胞存活率，详见图19B；而在植入MDA-MB-231/LM3细胞的小鼠中，IACS-10759或依托莫司治疗后，肺定植和转移的负担显著降低；RGCC的敲除结合IACS-10759或依托莫司进一步显著减少了肺转移，具体如图7G所示。以上结果表明，RGCC/PLK1/AMPK2信号轴介导的氧化磷酸化和脂肪酸氧化对肺部播散性肿瘤细胞的生存至关重要，从而促进肺转移。

实施例7.靶向RGCC联合紫杉醇/卡铂提高肺特异性转移的治疗效益

为了在小鼠模型中进行原位治疗，将100μL PBS中的1×10

已有研究表明，卡铂/紫杉醇联合治疗是转移性乳腺癌的首选治疗方法，然而，联合治疗的益处有限。本实施例进一步研究靶向RGCC是否可以提高卡铂-紫杉醇联合方案治疗TNBC肺转移的疗效。本实施例采用紫杉醇和卡铂的系列稀释液处理具有沉默RGCC的肺特异性转移4T1/LM3和MDA-MB-231/LM3细胞和对照细胞，IC

为了进一步评估卡铂/紫杉醇联合方案靶向RGCC的效率，将注射MDA-MB-231/LM3RGCC工程细胞的小鼠模型用于化疗，小鼠治疗方案如图8C所示。与对照小鼠(标记为MDA-MB-231/LM3/shNC/载体)相比，卡铂联合紫杉醇治疗使小鼠存活时间延长，肺转移结节减少；RGCC的敲除结合卡铂/紫杉醇治疗进一步改善了这些小鼠的寿命并减少了肺转移结节，详见图8D和图8E。所有治疗方案对裸小鼠的体重、脾脏或肝脏体积均无明显副作用，表明药物治疗耐受性良好，无明显毒性，详见图8F-图8H；图8F-图8H中，数据以平均值表示±标准差。以上发现揭示了靶向RGCC、卡铂和紫杉醇联合方案协同抑制肺转移，并可能为TNBC肺转移治疗带来治疗益处。