小麦抗叶锈病基因Lr29的两个分子标记及其应用

摘要

本发明公开了小麦抗叶锈病基因Lr29的分子标记XsdauLH3388和Xsdau19A20A及其应用。本发明的分子标记XsdauLH3388的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为共显性的InDel标记；分子标记Xsdau19A20A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，为共显性的CAPS标记。利用分子标记XsdauLH3388或Xsdau19A20A可以检测小麦抗叶锈病基因Lr29以及含有Lr29基因的植株基因型。因此，本发明的分子标记可以用于抗叶锈病小麦的分子标记辅助选择育种，加速了小麦的育种进程，适于大规模的推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及小麦抗叶锈病基因Lr29的两个分子标记XsdauLH3388与Xsdau19A20A及其应用。

背景技术

小麦是世界上种植范围最广且最重要的粮食作物之一。小麦是全球约35％-40％人口的主食，并提供了人类约20％的能量。近年来我国小麦种植面积约3.6亿亩，年产量维持在1.3亿吨左右。

小麦叶锈病(Puccinia recondita f.sp.tritici)是我国小麦生产上的一个重要病害,具有破坏性强、循环式侵染、专性寄生等特点，发生普遍。我国是世界上小麦叶锈病最大流行区之一，主要分布在长江流域、黄淮海和西南麦区，华北、东北麦区也曾发生叶锈病大流行，损失严重。小麦叶锈病主要危害小麦的叶片，茎秆、叶鞘、穗部也可发病，叶锈病发病时会吸收小麦叶片中的营养物质，破坏细胞壁造成光合作用下降，进而导致小麦千粒重降低，通常可减产5％～15％。随着全球气候变暖，气候条件愈发适合小麦叶锈病的发生与流行，若不及时采取对策，未来可能会造成更大的危害。因此加快选育抗病品种，培育具有持久、稳定且广谱抗性的小麦品种，是防控病害流行的重要措施，对保障我国小麦生产安全具有重要意义。

小麦族共包含约350～500个物种，广泛分布于世界各地。小麦近缘种属含有很多优良抗性基因，是普通小麦遗传改良的基因库。通过育种手段及现代生物技术将小麦近缘种属中的有利基因导入普通小麦中，是目前改良小麦各种性状的主要方式之一。抗叶锈病基因Lr29来源于小麦的近缘野生种长穗偃麦草，是显性全生育期抗叶锈病基因。普通小麦背景下，Lr29位于7E/7D易位染色体，易位长度超过7D染色体短臂。Lr29对我国流行的叶锈菌小种具有高度抗性，且不与其他不良农艺性状连锁，具有重要的利用价值。

传统育种途径通过表型鉴定进行选择，费时、费力且可靠性低。相比之下，利用分子标记进行基因型鉴定的方式具有明显优势。基因型由品种自身遗传特性决定，不受环境影响与时间限制，因此该方式准确性高且在植株生育早期即可进行鉴定。

共显性分子标记，既能检测样品是否携带目标基因，还能判定目标基因的纯合或杂合状态。通过Lr29基因共显性分子标记明确基因型，会给小麦育种带来极大的便利，不仅可预测小麦是否抗叶锈病，还有助于开展抗叶锈病小麦的分子标记辅助选择育种，获得抗叶锈病基因纯合的小麦。

目前尚未出现有关小麦抗叶锈病基因Lr29共显性分子标记的报道，亟待开发该类标记以加快抗叶锈病小麦的育种进程。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供小麦抗叶锈病基因Lr29的两个共显性分子标记。利用该标记可以检测小麦抗叶锈病基因Lr29以及含有Lr29基因的植株基因型。因此，本发明的分子标记可以用于抗叶锈病小麦的分子标记辅助选择育种，加速了小麦的育种进程，适于大规模的推广应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供小麦抗叶锈病基因Lr29的两个共显性分子标记，所述两个共线性分子标记分别为InDel标记和CAPS标记。其中：

所述InDel标记为缺失/插入多态性，位于中国春参考基因组v1.0第7号染色体(7D)第379323570-379324596bp处，命名为XsdauLH3388；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述CAPS标记为酶切扩增多态性，位于中国春参考基因组v1.0第7号染色体(7D)第182832530-182833169bp处，命名为Xsdau19A20A；其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二方面，提供两组分别用于扩增上述分子标记的引物，所述分子标记XsdauLH3388的引物序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述分子标记Xsdau19A20A的引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。具体如下：

XsdauLH3388-F：5′-GGGCTGACAGATGGTTTTGCT-3′；(SEQ ID NO.5)

XsdauLH3388-R：5′-TGGCTCTGATGGAAGGGTGT-3′；(SEQ ID NO.6)

Xsdau19A：5′-CAATTTTGTTCTATTTCTGTCCAG-3′；(SEQ ID NO.7)

Xsdau20A：5′-ATATGCCCACTTGAATCACAGAG-3′。(SEQ ID NO.8)

本发明的第三方面，提供用于检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含上述SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物或SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物。

本发明的第四方面，提供上述分子标记、引物对或试剂盒在如下1)-4)至少一项中的应用：

1)小麦抗叶锈病基因Lr29的检测；

2)抗叶锈病小麦株的早期筛选；

3)含有Lr29基因的植株基因型的鉴定；

4)抗叶锈病小麦的育种。

本发明的第五方面，提供一种小麦抗叶锈病基因Lr29的检测方法，包括以下步骤：

提取待测小麦的基因组DNA并将其作为模板，采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，得到第一扩增产物；将第一扩增产物进行电泳检测，若得到长度为923bp的条带，则待测小麦中含有抗叶锈病基因Lr29；

或者，提取待测小麦的基因组DNA并将其作为模板，采用SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的引物进行PCR扩增，得到第二扩增产物；将第二扩增产物用Hpy188Ⅰ限制性内切酶酶切，电泳检测酶切后的扩增产物，若得到长度为140bp的条带，则待测小麦中含有抗叶锈病基因Lr29。

优选的，PCR扩增的反应体系为：100ng/μL的模板DNA 1μL，2xMaster Mix 7.5μL，10μmol/L正向及反向引物各0.5μL，ddH

PCR扩增的反应条件为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 15s，退火54℃ 15s，延伸72℃ 10s，循环数38个循环，后延伸72℃ 5min，15℃保存；

优选的，酶切的反应体系为：10μL PCR产物，10U/ml Hpy188Ⅰ 0.3μL，10xCutsmart1.9μL，1.8μL ddH

本发明的第六方面，提供一种鉴定含有Lr29基因的植株基因型的方法，包括以下步骤：

提取待测小麦的基因组DNA并将其作为模板，采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，得到第一扩增产物；将第一扩增产物进行电泳检测，除得到一条852bp的非特异扩增条带外，若得到长度为923bp条带，则待测小麦为Lr29纯合基因型；若得到长度为1027bp条带，代表lr29纯合基因型；若同时出现1027bp、923bp条带，则代表Lr29lr29杂合基因型；

或者，提取待测小麦的基因组DNA并将其作为模板，采用SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的引物进行PCR扩增，得到第二扩增产物；将第二扩增产物用Hpy188Ⅰ限制性内切酶酶切，电泳检测酶切后的扩增产物，除得到一条353bp的非特异扩增条带外，若得到长度为140bp条带，则待测小麦为Lr29纯合基因型；若得到长度为287bp条带，代表lr29纯合基因型；若同时出现140bp、287bp条带，则代表Lr29 lr29杂合基因型。

优选的，PCR扩增的反应体系为：100ng/μL的模板DNA 1μL，2xMaster Mix 7.5μL，10μmol/L正向及反向引物各0.5μL，ddH

PCR扩增的反应条件为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 15s，退火54℃ 15s，延伸72℃ 10s，循环数38个循环，后延伸72℃ 5min，15℃保存。

优选的，酶切的反应体系为：10μL PCR产物，10U/ml Hpy188Ⅰ 0.3μL，10xCutsmart1.9μL，1.8μL ddH

第一扩增产物的电泳检测条带中，长度为923bp的条带所对应的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；长度为1027bp的条带所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第二扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示。若第二扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，酶切后会出现两段140bp的条带和一段353bp的条带，酶切后电泳展示的结果为一条353bp的条带和一条140bp的条带；若第二扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，酶切后会出现一段287bp的条带和一段353bp的条带，酶切后电泳展示的结果为一条353bp的条带和一条287bp的条带。

本发明的有益效果：

1)本发明提供了扩增小麦抗叶锈病基因Lr29分子标记的PCR引物，所述引物稳定性好、扩增条带特异性强。上述标记为共显性InDel标记或共显性CPAS标记，能准确鉴别Lr29Lr29、Lr29lr29、lr29lr29三种基因型，与目前仅有的显性标记相比有明显优势。

2)本发明提供了所述两对引物在筛选抗叶锈病小麦中的应用。采用PCR筛选含有抗叶锈病基因Lr29的小麦，阳性植株即为扩增结果出现923bp或140bp的条带、含有Lr29基因的小麦，阴性植株即为扩增结果无923bp或140bp的条带、不含有Lr29基因的小麦。利用所述引物检测分子标记XsdauLH3388或Xsdau19A20A，可以对小麦的抗叶锈病性状进行有效选择，加速抗叶锈病小麦的育种进程。所述标记检测简便快捷、成本低、实用性强，适于大规模推广应用。

附图说明

图1：Lr29NIL(左)、Delibab(中)、CB037(右)三个品种的小麦叶锈病表型鉴定。

图2：实施例2中分子标记XsdauLH3388扩增图谱及Xsdau19A20A的酶切图谱；图中，A)分子标记XsdauLH3388的PCR扩增电泳图；B)分子标记Xsdau19A20A的PCR产物酶切后电泳图。

图3：实施例3中利用分子标记XsdauLH3388(A)、Xsdau19A20A(B)检测Lr29NIL/Delibab F

图4：实施例3中Lr29NIL/Delibab组合F

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，抗叶锈病基因Lr29来源于小麦的近亲种属长穗偃麦草，是一个显性全生育期抗叶锈病基因，对我国流行的叶锈菌小种具有高度的抗性，且不与其他不良的农艺性状连锁，是一个优良的抗叶锈病基因。开发研究抗叶锈病基因Lr29的分子标记，对于抗叶锈病小麦的分子标记辅助育种具有十分重要的意义。

现有关于抗叶锈病基因Lr29分子标记的报道很少，而且均为早期的随机扩增(random amplified polymorphic DNA，RAPD)，RAPD的重复性较差，不稳定，限制了抗叶锈病基因Lr29在小麦育种中的应用。

插入/缺失(insertion-deletion，InDel)是指近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基。InDel是同源序列比对产生空位(gap)现象，但大多数情况下无法获知祖先序列，很难判断空位位点是哪个序列发生了插入突变，或哪个序列发生了缺失突变，所以一般统称为插入/缺失突变。InDel标记属于PCR扩增技术，本质上属于长度多态性标记。

酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS)，是利用己知位点的DNA序列设计出一套特异性的PCR引物，用引物特异扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段。CAPS标记也属于PCR扩增技术，揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异的信息。

由于Lr29基因位于小麦-长穗偃麦草易位染色体，涉及很长的染色体区段，与普通小麦染色体不能正常联会及发生交换。因此，对Lr29基因的定位研究进展缓慢，缺乏有效的分子标记。同时，由于缺少Lr29基因供体材料的全基因组序列，也限制了该基因分子标记的开发。

本发明通过对种质材料RL6080进行重测序及利用基因组共线性，获得了两个与Lr29基因连锁的分子标记。其中一个为共显性InDel标记，位于中国春参考基因组第7号染色体(7D)第379323570-379324596bp处，将其命名为XsdauLH3388，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。另外一个为共显性CAPS标记，位于中国春参考基因组第7号染色体(7D)第182832530-182833169bp，将其命名为Xsdau19A20A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

为了实现本发明的分子标记XsdauLH3388在抗叶锈病小麦的分子标记辅助育种中的应用，本发明还开发设计了用于扩增所述分子标记XsdauLH3388的引物，具体如下：

XsdauLH3388-F：5′-GGGCTGACAGATGGTTTTGCT-3′；(SEQ ID NO.5)

XsdauLH3388-R：5′-TGGCTCTGATGGAAGGGTGT-3′。(SEQ ID NO.6)

Xsdau19A：5′-CAATTTTGTTCTATTTCTGTCCAG-3′；(SEQ ID NO.7)

Xsdau20A：5′-ATATGCCCACTTGAATCACAGAG-3′。(SEQ ID NO.8)

本发明所设计的上述两对引物具有非常好的特异性，利用本发明的引物能够准确有效地对分子标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过电泳或者测序检测能够有效实现对该分子标记的检测。

而且，本发明的分子标记均为共显性标记，既能检测小麦是否含有Lr29基因，还能检测含有Lr29基因的植株基因型为Lr29Lr29或Lrlr29。通过共显性分子标记明确基因型，会给小麦育种带来极大的便利。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：Lr29NIL、Delibab、CB037三个品种的表型鉴定

Lr29NIL材料是含有抗叶锈病基因Lr29的Thatcher近等基因系RL6080；CB037和Delibab为不携带Lr29基因的小麦品种。通过接菌单一叶锈小种PCJT，采用涂抹的方法接菌鉴定表型。

抗叶锈病表型如图1所示，Lr29NIL、Delibab、CB037，其中左为Lr29NIL，叶片表面无反应，为免疫的表型。Delibab在中间、右为CB037均有较大较多的叶锈孢子出现，且伴随卫星孢子，为高感的表型。在相同地点相同时间采用相同方法接相同的叶锈菌，可以得出结论，含Lr29基因的材料能够免疫叶锈病。

实施例2：分子标记XsdauLH3388及Xsdau19A20A的设计及检测。

通过Lr29NIL植物样本采集及DNA提取，获得DNA样品进行重测序。经文库构建、库检、上机测序、重测序后，共获得6.5×10

批量设计能够扩增7A、7B、7D染色体的通用引物，通过将引物扩增的目标序列与Lr29NIL重测序数据进行比对，筛选得到两对特异引物。所述引物分别命名为XsdauLH3388-F、XsdauLH3388-R(具体核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示)，Xsdau19A、Xsdau20A(核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示)。所述引物能通过PCR扩增特异条带，准确鉴定小麦抗叶锈病基因Lr29的基因型。

取Lr29NIL、Delibab、CB037,及Lr29NIL/Delibab杂交后代的抗病单株混合池(R-pool)、感病单株混合池(S-pool)叶片组织提取DNA，进行PCR扩增，预变性95℃ 3min，变性95℃ 15s，退火54℃ 15s，延伸72℃ 10s，循环数38个循环，后延伸72℃ 5min，15℃保存。用TAE缓冲液配制1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电压170V，电泳40min。

特异引物XsdauLH3388-F、XsdauLH3388-R的扩增结果显示，Lr29NIL及抗病单株混合池具有一条长度为923bp的特异条带(图2A)。对特异引物Xsdau19A、Xsdau20A的扩增产物进行Hpy188Ⅰ酶切，结果显示，Lr29NIL及抗病单株混合池具有一条长度为140bp的特异条带(图2B)。

实施例3：利用Lr29NIL和Delibab杂交后代F

对F

利用单一叶锈小种PCJT，通过涂抹法接菌对Lr29NIL以及Lr29NIL/Delibab组合F

综上所述，本发明的小麦抗叶锈病基因Lr29共显性分子标记XsdauLH3388和Xsdau19A20A均能够有效检测小麦Lr29基因以预测小麦是否抗叶锈病；同时还能够对小麦的抗叶锈病性状进行有效选择，用于抗叶锈病小麦的分子标记辅助选择育种，从而加速小麦育种进程。所述共显性分子标记检测简便快捷、成本低、实用性强，适于大规模推广应用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 小麦抗叶锈病基因Lr29的两个分子标记及其应用

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 923

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggctctgat ggaagggtgt cttcagctat acttaaagat ggttctgttg ttgaagctga 60

tacagttacg atctttattt tctcaacatg ttcttatgct gcagtagcaa atcctaaacc 120

atgaaaatca tcgagattcc tgcatttaag ttcctactgt tggtcttggc cttattaaga 180

gcacccgtta tattagatta tttaatgaca agattatgac cacttagatc cacttgatat 240

tatgtttgaa aggcatttga taataaccaa cttatctttg aaatcctgtt agtagaaagc 300

atctagacaa cctaatccct cagaagtgaa gtagagtcta tgataggtgt gctatccttc 360

tacattttat ggttagctaa taaactagac tgacaagcaa agtcctaaat tctggaaacc 420

agtaagttct ggtgtgtgat gggtagaaaa tgccgagttt tcagtatgga ggtttcatgg 480

taatgctgat ggtggtggct ctagtggagg ggaagagagg gggagaatga ggaagtcttt 540

taaatctttg attaggaaac caacttgatt tctcaagaat cagactcagt attgttctcg 600

ctgtccacaa actaatctgc ttagaaaccc tgctggtcgt ggttggatat tgttggcatc 660

agcctctgtt tggtgaacgg tagtattagc ccaaaatgtg tgtcgtgatc aaatgtctgc 720

tgaggcagca gaagttacat acagtttatt atattatcac taggagcatc agctactatt 780

tattatattt gatattatct tcttatgtac atattcttaa actgctgaaa ccgtatggat 840

tcatatcatg agatcttctt atgttgacat tacattctaa tgcaggttat tgttggtata 900

ggagcaaaac catctgtcag ccc 923

<210> 2

<211> 1027

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggctctgat ggaagggtgt cttcagctat acttaaagat ggttctgttg ttgaagctga 60

tacagttacg atctttattt tctcaacacg ttcttatgct gcagtaccaa atcctaaacc 120

atgaaaatca tcgagattcc tgcatttgag ttcccactgt tggtcttggc cttattaaga 180

gcacccgtta tattagatta tttaatgaca agattatgac cacttagatc cacttgatat 240

tatgttcgaa aggcatttga taataaccaa cttatctttg aaatcctctt agtagaaagc 300

atgtagacaa cctaattcct cagaagtgaa gtagagtcta tgataggtgt ctatccttct 360

actccctccg ttctaaatta ctcgtcgcag aaatggatgt atctagaact aaaatacatc 420

tagatacatc catacctgcg acaagtaatt cggaacggag ggagtacatt ttatggttag 480

ctaataaact agactgacaa gcaaagtcct aaattctgga aaccagtaag ttctggtgtg 540

tgatgggtag aaaatgccga gttttcagta tggaggtttc atggtaatgc tgatggtggt 600

ggctctagtg gaggggaaga gagggggaga atgaggaagt cttttaaatc tttgattagg 660

aaaccaactt gatttctcaa gaatcagact cagtattgtt ctcgctgtcc acaaactaat 720

ctgcttagaa accctgctgg tcgtggttgg atattgttgg cgccagcctc tgtttggtga 780

aaggtagtat tagcccaaaa tgtgtgtcgt gatcaaatgt ctgctgaggc aacagaagtt 840

acatacagtt tattatatta tcagtaggag catcagctac tatttattat atttgatatt 900

atcttcttat gtacgtattc ttaaactact gaaaccgtat ggattcatat catgagatct 960

tcttatgttg acattacaat gtaatgcagg ttattgttgg tataggagca aaaccatctg 1020

tcagccc 1027

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<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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aaaggttgaa gtggatgcta gattttcaac aaaatatagt acacatgatt tcataggaaa 120

aattcctata ggatacaatc ctatgaatca aatgaccaat gtaagaaaaa ttcctaagga 180

ctctagccct ccaaaaatcc tatgattttt tttgaatcaa aggagtcctc ggtggtttgc 240

acatggtttt atatggctaa ggatgaatgg aaatgccagc tcaacaacta acgtacggcg 300

tcaagtcctt tgtttacttc atggccatgc cctgcacgct agttgttgtg atcagatgta 360

gagggtccca ccaggatgtt ttgtgtttta aggcatgggc ctaccttcta gaagataagg 420

gagattccct agaatctttt gtagctgaag atttatgtga aaatacaact gtaaacatgt 480

gggcatatgt gtccgaagtg aaaagaaaaa ttaaaaaata gtaaaaaagt caaatacctt 540

ttgcaacaaa catggtctac cgatatactc atgtataaag tttcatgaga aaaatacttc 600

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<210> 4

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acatggtttt atatggctaa ggatgaatgg aaatgccagc tcaacaacta acgtacggcg 300

tcaagtcctt tgcttacttc atggccatgc cctgcaagtt agttgttgtg atcagatgta 360

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<210> 5

<211> 21

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<213> 人工序列

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<210> 6

<211> 20

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atatgcccac ttgaatcaca gag 23