一种选择绵羊超数排卵高产供体的方法

摘要

本发明公开了一种选择绵羊超数排卵高产供体的方法。所述方法包括以下步骤：检测发情的绵羊体内的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种或几种，根据检测结果选择得到绵羊超数排卵的供体；所述供体的选择标准为：抗缪勒管激素的浓度为176.0～192.0ng/mL、孕酮的浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸的浓度为33.0～80.0μg/mL中的一种或几种。本发明利用首次注射促卵泡激素前绵羊外周血中抗缪勒管激素、孕酮和精氨酸浓度作为指标，可选择到超数排卵中诱导发情的潜在高产供体，排除潜在低产供体，提升胚胎生产效率，有效选择出超排性能好的供体，提高超数排卵‑胚胎移植的效率并降低其成本。

说明书

技术领域

本发明涉及动物养殖技术领域，具体地，涉及一种选择绵羊超数排卵高产供体的方法。

背景技术

超数排卵是在供体发情周期的适当时机，利用超出体内正常水平的生殖激素，使卵巢中处于激素依赖期的生长卵泡和闭锁早期的卵泡继续生长发育，最终排出多个具备受精能力的卵子的过程。超数排卵-胚胎移植(MOET)是优良家畜快速扩繁常用的技术手段。通过促卵泡激素(FSH)和其他生殖激素的使用，供体母畜可以在一个发情周期内获得数十个胚胎。

在MOET过程中，除激素纯度、给药方案等外在因素外，母畜本身的状况也会很大程度地影响超数排卵的效果。如从新西兰引进的产奶量高、生长生产性能优良的东佛里生奶绵羊，其个体间超数排卵的效果差异显著，有些母羊一次超数排卵可获得高达40枚胚胎，而有些只能得到几枚甚至0枚胚胎。所以，即使年龄、体况、生产次数相似的供体母畜，其超数排卵的效果也有很大差异，甚至即使同一个供体，每次超数排卵的效果都不尽相同。供体的个体差异造成了激素、药物和饲养管理的极大浪费。

在现有技术中，为了保证超数排卵的效果，通常在给供体母畜实施超数排卵前，使用B超观察其卵巢中卵泡的发育状况，预测其超数排卵的效果。但是，卵巢反应是多次排卵过程中一个复杂的生理过程，在超数排卵前的观察评估，并不能确保在进行超数排卵的过程中小卵泡都能发育成熟，而且B超观察的工作繁琐，技术要求高，不便于大规模群体的监测管理。因此，经B超观察卵巢状况来预测超数排卵的效果在实际操作中有一定的误差。

因此，为了提升群体的超数排卵效果，降低激素、药物和饲养管理的成本，亟需利用简便、易行且低成本的技术选择合适的供体母畜。

发明内容

为了解决现有技术中缺少简便、易行且低成本筛选合适超数排卵供体母畜的技术，本发明提供了一种选择绵羊超数排卵高产供体的方法。

本发明的第一个目的是提供一种选择绵羊超数排卵的供体的方法。

本发明的第二个目的是提供一种检测试剂组合物在制备选择绵羊的超数排卵供体的试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种选择绵羊超数排卵的供体的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种评定绵羊超数排卵产生的总胚胎数的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH、17β-雌二醇E2、孕酮P4、抗缪勒氏激素AMH和其他生殖激素共同发挥作用促进卵泡的发育成熟。FSH和LH共同促进卵泡成熟、E2与排卵、黄体产生和维持有关。E2由颗粒细胞分泌，刺激卵泡发育诱导发情行为，而低浓度的E2可抑制FSH和LH的分泌。P4是卵巢分泌的主要孕酮之一，在体内对雌激素激发过的子宫内膜有显著形态学影响，为维持妊娠所必需，调节促性腺激素的负反馈。AMH是小有腔卵泡的产物，作为卵泡成熟的自分泌和旁分泌调节剂的功能。此外，AMH是人辅助生殖中卵巢储备检测的一种有效筛查指标。因此，某一时间点血中生殖激素的浓度可能是预测家畜超排效果的合适参数。

除激素外，血液中的代谢物在卵泡成熟中也起着重要作用。分子量<1000Da的代谢物在多种代谢途径中起底物和产物的作用，血液中的一些代谢物已成为多种疾病诊断和预测的识别标志物。代谢组学的处理技术多种多样，包括高效液相色谱-质谱LC-MS、色谱-质谱GC-MS、核磁共振NMR等。在这些技术中，超性能LC-MS UPLC-MS具有高通量处理、高分辨率、高灵敏度等特点，可获得更准确、全面的数据。

为分析血液中代谢物与超数排卵中胚胎回收数的关系，对外源激素注射前供体的血清代谢物采用UPLC-MS技术进行了全面对比分析，发现一些氨基酸与最终回收胚胎数相关。其中，精氨酸被认为在调节胚胎生长和分化中具有关键作用，特别是在囊胚阶段，它优先触发mTORC1信号复合物。精氨酸也是由NO合成酶产生的自由基一氧化氮NO的前体。在小鼠着床前胚胎中，NO限制囊胚期的耗氧量。所以，较高浓度的精氨酸有助于胚胎在体内的发育。

由此，本发明使用酶联免疫吸附测定ELISA技术检测血液中抗缪勒氏激素、孕酮的浓度，使用氨基酸自动分析仪来检测精氨酸的浓度，以此来选择出合适的超数排卵供体。

一种选择绵羊超数排卵的供体的方法，包括以下步骤：检测发情的绵羊体内的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种或几种，根据检测结果选择得到绵羊超数排卵的供体；所述供体的选择标准为：抗缪勒管激素的浓度为176.0～192.0ng/mL、孕酮的浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸的浓度为33.0～80.0μg/mL中的一种或几种。

优选地，所述供体的选择标准为：抗缪勒管激素的浓度为176.0～192.0ng/mL、孕酮的浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸的浓度为33.0～80.0μg/mL中的一种。

更优选地，所述供体的选择标准为：精氨酸的浓度为33.0～80.0μg/mL。

优选地，所述供体的选择标准为：抗缪勒管激素的浓度为179.0～192.0ng/mL、孕酮的浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸的浓度为47.0～80.0μg/mL中的一种或几种。

更优选地，所述供体的选择标准为：抗缪勒管激素的浓度为179.0～192.0ng/mL、孕酮的浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸的浓度为47.0～80.0μg/mL中的一种。

进一步优选地，所述供体的选择标准为：精氨酸的浓度为47.0～80.0μg/mL。

优选地，检测发情的绵羊体内的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种。

更优选地，检测发情的绵羊体内的精氨酸。

优选地，检测发情的绵羊外周血中的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种或几种。

更优选地，检测发情的绵羊外周血中的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种。

进一步优选地，检测发情的绵羊外周血中的精氨酸。

更优选地，检测发情的绵羊外周血血清中的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种或几种。

进一步优选地，检测检测发情的绵羊外周血血清中的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种。

更进一步优选地，检测检测发情的绵羊外周血血清中的精氨酸。

优选地，所述超数排卵的方法为使用激素组合物处理绵羊，所述激素组合物包含促卵泡激素、孕母马血清促性腺激素和氯前列醇。

更优选地，所述激素组合物的用量为：210～270μg/只的促卵泡激素、200～260IU/只的孕母马血清促性腺激素和120～170μg/只的氯前列醇。

进一步优选地，所述使用激素组合物处理绵羊包括以下步骤：先用210～270μg/只的促卵泡激素和200～260IU/只的孕母马血清促性腺激素注射绵羊，再用120～170μg/只的氯前列醇注射绵羊。

更优选地，所述激素组合物的用量为：250μg/只的促卵泡激素、250IU/只的孕母马血清促性腺激素和150μg/只的氯前列醇。

进一步优选地，所述使用激素组合物处理绵羊包括以下步骤：先用250μg/只的促卵泡激素和250IU/只的孕母马血清促性腺激素注射绵羊，再用150μg/只的氯前列醇注射绵羊。

优选地，所述发情的方法为诱导发情。

更优选地，所述诱导发情的方法为用激素催情。

进一步优选地，所述用激素催情的具体方法为用250～330mg/只的孕酮处理绵羊。

更进一步优选地，所述诱导绵羊发情的方法为用300mg/只的孕酮处理绵羊。

再进一步优选地，所述孕酮为孕酮阴道栓。

最优选地，所述诱导发情和绵羊超数排卵的方法包括以下步骤：用300mg/只孕酮缓释阴道栓诱导绵羊发情；诱导发情的第10～12天，对绵羊连续注射促卵泡激素共6次，每次间隔12h，促卵泡激素的注射剂量依次为53.4μg/只、48μg/只、43.2μg/只、38.9μg/只、35μg/只和31.5μg/只；首次注射促卵泡素时，同步注射孕母马血清促性腺激素250IU/只；在第5次注射卵泡激素时，同步注射氯前列醇，注射剂量为150μg/只；最后一次注射全部完成后，除去孕酮阴道栓。

上述方法以非疾病治疗诊断为目的。

一种检测试剂组合物在制备选择绵羊超数排卵的供体的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内，所述检测试剂检测抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种或几种。本发明不限制检测试剂的种类和组分，理论上，能够检测抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸的试剂均可实现本发明的检测目的。

优选地，所述检测试剂检测抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种。

更优选地，所述检测试剂检测精氨酸。

优选地，所述抗缪勒管激素的检测试剂为ELISA试剂盒。

优选地，所述孕酮的检测试剂为ELISA试剂盒。

优选地，所述精氨酸的检测试剂为用氨基酸自动分析仪检测精氨酸所用的试剂，包含精氨酸标准品、甲醇、盐酸、缓冲液和反应液。

一种选择绵羊超数排卵的供体的试剂盒，包含检测试剂，所述检测试剂检测抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种或几种。本发明不限制检测试剂的种类和组分，理论上，能够检测抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸的试剂均可实现本发明的检测目的。

优选地，所述检测试剂检测抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸中的一种。

更优选地，所述检测试剂检测精氨酸。

优选地，所述抗缪勒管激素的检测试剂为ELISA试剂盒。

优选地，所述孕酮的检测试剂为ELISA试剂盒。

优选地，所述精氨酸的检测试剂为用氨基酸自动分析仪检测精氨酸所用的试剂，包含精氨酸标准品、甲醇、盐酸、缓冲液和反应液。

一种评定绵羊超数排卵产生的总胚胎数的方法，检测发情的绵羊体内的抗缪勒管激素、孕酮或精氨酸的浓度，根据检测结果评定绵羊超数排卵产生的总胚胎数，具体评定标准为：

检测结果为：抗缪勒管激素浓度为176.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL中的一种或几种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为10～37枚；

检测结果为：待测样本的抗缪勒管激素浓度为179.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL中的一种或几种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为15～37枚。

优选地，检测结果为：抗缪勒管激素浓度为176.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL中的一种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为10～37枚。

更优选地，检测结果为：精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为10～37枚。

优选地，检测结果为：待测样本的抗缪勒管激素浓度为179.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL中的一种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为15～37枚。

更优选地，检测结果为：精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为15～37枚。

上述方法以非疾病治疗诊断为目的。

一种评定绵羊超数排卵产生的总胚胎数的系统，包括数据采集模块、数据存储模块、分析判断模块和输出模块；

所述数据采集模块用于获取待测样本的特征参数，所述特征参数包括待测样本的抗缪勒管激素浓度、孕酮浓度或精氨酸浓度中的一种或几种；

所述数据存储模块用于储存数据采集模块获得的特征参数和分析判断模块中的阈值；

所述分析判断模块用于根据特征参数和阈值判断待测样本超数排卵产生的总胚胎数，

具体评判标准为：

所述待测样本的特征参数为：抗缪勒管激素浓度为176.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL中的一种或几种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为10～37枚；

所述待测样本的特征参数为：抗缪勒管激素浓度为179.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL中的一种或几种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为15～37枚；

所述输出模块用于输出待测样本超数排卵产生的总胚胎数。

优选地，所述特征参数包括待测样本的抗缪勒管激素浓度、孕酮浓度或精氨酸浓度中的一种，所述分析判断模块用于根据特征参数和阈值判断待测样本超数排卵产生的总胚胎数，具体评判标准为：

所述待测样本的特征参数为：抗缪勒管激素浓度为176.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL中的一种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为10～37枚；

所述待测样本的特征参数为：抗缪勒管激素浓度为179.0～190.82ng/mL、孕酮浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL中的一种，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为15～37枚。

更优选地，所述特征参数为待测样本的精氨酸浓度；所述分析判断模块用于根据特征参数和阈值判断待测样本超数排卵产生的总胚胎数，具体评判标准为：

待测样本的精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为10～37枚；

待测样本的精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL，则所述待测样本超数排卵产生的总胚胎数为15～37枚。

任一上述的系统在绵羊超数排卵中的应用也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述检测试剂为外周血的检测试剂。

本发明对绵羊的品种没有特殊限定，可以是东佛里生羊、戴瑞奶绵羊、萨福克羊、德克塞尔羊等。

东佛里生羊原产德国，体型高大，生长速度快，是目前世界上产奶量最高的绵羊品种，被誉为绵羊界的“荷斯坦”。该品种平均产羔率约200％，是多羔品种。东佛里生羊原种引进极为昂贵，利用已有的个体通过现代繁殖技术进行快速扩繁显得尤为必要。

优选地，所述绵羊为东佛里生羊。

优选地，所述绵羊为经产母羊。

优选地，所述绵羊的年龄为1～2岁。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用首次注射促卵泡激素前绵羊外周血中抗缪勒管激素、孕酮和精氨酸浓度作为指标，可选择到超数排卵中诱导发情的潜在高产供体，排除潜在低产供体，提升胚胎生产效率，有效选择出超排性能好的供体，提高超数排卵-胚胎移植的效率并降低其成本。

附图说明

图1为超数排卵的流程图。

图2为AMH浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图3为P4浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图4为E2浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图5为FSH浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图6为LH浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图7为精氨酸浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图8为赖氨酸浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图9为胱氨酸浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图10为苏氨酸浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图11为群体中AMH浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图12为群体中P4浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

图13为群体中精氨酸浓度和诱导发情超排后总胚胎数目的相关性。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例中所用的羊均以常规方法进行饲养和管理。

本发明实施例中所用东佛里生羊来自位于内蒙古丰东知盈牧业科技有限公司，所选羊只均发育正常，膘情良好，健康无疾病。

实施例1一种常规的绵羊超数排卵及获取胚胎的方法

1、实验方法

(1)供体羊与种公羊的选择：

以1～2周岁的经产母羊作为供体羊；以2周岁左右健康公羊作为种公羊，收集精液用于人工授精。

(2)供体羊的诱导发情

如图1所示，在无发情期供体羊的阴道内插入孕酮缓释阴道栓(剂量为300mg/只)，记为诱导发情的第0天。

(3)超数排卵

诱导发情的第0天开始，对供体羊连续注射促卵泡激素共6次，每次间隔12h；促卵泡激素的注射剂量依次为53.4μg/只、48μg/只、43.2μg/只、38.9μg/只、35μg/只和31.5μg/只；首次注射促卵泡素时，同步对供体羊注射孕母马血清促性腺激素250IU/只；在第5次注射卵泡激素时，同步对供体羊注射氯前列醇，注射剂量为150μg/只；最后一次注射全部完成后，除去对供体羊体内的孕酮阴道栓。

(4)人工授精：

如图1所示，在诱导发情的第13天，检测供体羊的发情状况，选择处于发情期的供体羊实施人工授精，将种公羊的精液输入供体羊的子宫颈口；间隔12h后再重复一次人工授精的操作。

(5)胚胎收集：

如图1所示，在诱导发情的第13天早上人工授精时，向每只供体羊注射促黄体生成素(LH)100IU/只；在诱导发情的第19天，用盐酸利多卡因麻醉供体羊，通过手术冲洗子宫收集胚胎，统计胚胎数量。

2、实验结果

表1诱导发情的胚胎生产统计

如表1所示，37只供体母羊共收集到301枚胚胎，平均每只供体羊产生8.14±7.54枚胚胎，单个个体最多回收38枚，最少0枚。

实施例2供体羊外周血中生殖激素和氨基酸的测定

1、实验方法

对于实施例1中的所有供体羊，在使用CIDR诱导发情后，第一次注射外激素促卵泡激素刺激之前，收集全部供体羊的血清。

根据最终产生胚胎的数量，选取13只胚胎数不同(2～38枚)的供体母羊的血清，检测其中生殖激素和氨基酸的含量。具体方法如下：

(1)生殖激素的测定

采用ELISA试剂盒(生工生物技术，上海，中国)，检测血清中的生殖激素FSH、LH、雌二醇(E2)、孕酮(P4)和抗缪勒管激素(AMH)，用microplate reader(Thermo Scientific，上海，中国)读取ELISA板以记录光密度。绘制各标准曲线，计算各生殖激素的含量。

(2)氨基酸的测定

使用全自动氨基酸分析仪(日本株式会社日立高新技术科学，LA8080)对血清中赖氨酸、胱氨酸、精氨酸和苏氨酸进行分析。

样品的前处理方法：取50μL血清于离心管中，加入950μL 0.02mol/L盐酸溶解并定容到1mL，得到供试品。

分别向C18前处理小柱中加入5mL甲醇和5mL水进行活化；向活化的C18前处理小柱中加入上述供试品进行过柱，再加1.5mL 0.02mol/L盐酸洗涤残留在C18前处理小柱上的供试品；收集过柱后的供试品，用0.02mol/L盐酸定容到5mL，过0.45μm滤膜后，用全自动氨基酸分析仪进行检测。

全自动氨基酸分析仪的参数设定：波长设为570nm和440nm；进样量为20μL；反应温度为135±5℃。

全自动氨基酸分析仪的色谱柱为磺酸型阳离子树脂分离柱。

全自动氨基酸分析仪检测所用缓冲液的配方如表2所示。

表2缓冲液的配方

备注：使用高质量微孔滤膜抽滤缓冲液时，先使用0.45μm高质量微孔滤膜抽滤，再使用0.22μm高质量微孔滤膜抽滤，使用功率较大的真空泵进行抽滤，速度较快。如溶液加入苯甲醇后出现乳白色浑浊，超声促进苯甲醇溶解，直至溶液澄清。

全自动氨基酸分析仪检测所用反应液的配制方法如表3所示。

表3反应液的配制方法

备注：使用高质量微孔滤膜抽滤反应液时，先使用0.45μm高质量微孔滤膜抽滤，再使用0.22μm高质量微孔滤膜抽滤，使用功率较大的真空泵进行抽滤，速度较快。配制R2时，如醋酸钠不易溶解，微热至约60℃，促进溶解。

2、实验结果

(1)外周血生殖激素含量与超数排卵回收总胚胎数的相关性

如图2所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中AMH的平均浓度为180.67ng/mL，范围在172.57ng/mL～190.41ng/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中AMH的浓度与最终回收的总胚胎数呈极显著正相关(回归方程为：y＝1.7355x-295.78；R＝0.820，P＜0.05)，其中AMH的浓度为176.0～190.82ng/mL可用于评定绵羊的超数排卵最终效果。

如图3所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中P4的平均浓度为44.94ng/mL，范围在36.72ng/mL～52.91ng/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中P4的浓度与最终回收的总胚胎数呈极显著负相关(回归方程为：y＝-1.7516x+96.48；R＝-0.878，P＜0.05)，其中P4的浓度为35.0～49.5ng/mL可用于评定绵羊的超数排卵最终效果。

如图4所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中E2的平均浓度为215.18pg/mL，范围在207.65pg/mL～227.68pg/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中E2的浓度与最终回收的总胚胎数无相关性(回归方程为：y＝0.4358x-76.015；R＝0.218，P＞0.05)。

如图5所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中FSH的平均浓度为17.10mIU/mL，范围在16.01mIU/mL～19.32mIU/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中FSH的浓度与最终回收的总胚胎数无相关性(回归方程为：y＝4.9228x-66.415；R＝0.395，P＞0.05)。

如图6所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中LH的平均浓度为40.93mIU/ml，范围在37.48mIU/ml～46.44mIU/ml，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中LH的浓度与最终回收的总胚胎数无相关性(回归方程为：y＝-1.7174x+88.07，R＝0.399，P＞0.05)。

综上所述，第一次外源激素处理前供体羊外周血中抗缪勒管激素与最终回收的总胚胎数呈显著正相关，孕酮与最终回收的总胚胎数呈显著负相关，雌二醇、促卵泡激素和黄体生成素与最终回收的总胚胎数无相关性。

(2)外周血氨基酸含量与超数排卵回收总胚胎数的相关性

如图7所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中精氨酸的平均浓度为48.59μg/mL，范围在15.33μg/mL～77.67μg/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中精氨酸的浓度与最终回收的总胚胎数呈极显著正相关(回归方程为：y＝0.3677x-2.3266；R＝0.816，P＜0.05)其中精氨酸的浓度为33.0～80.0μg/mL可用于评定绵羊的超数排卵最终效果。

如图8所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中赖氨酸的平均浓度为20.78μg/mL，范围在9.30μg/mL～33.33μg/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中赖氨酸的浓度与最终回收的总胚胎数无相关性(回归方程为：y＝0.0462x+14.578；R＝0.033，P＞0.05)。

如图9所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中胱氨酸的平均浓度为5.72μg/mL，范围在4.37μg/mL～6.60μg/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中胱氨酸的浓度与最终回收的总胚胎数无相关性(回归方程为：y＝-2.8494x+31.839；R＝-0.232，P＞0.05)。

如图10所示，第一次外源激素处理前测得供体羊外周血中苏氨酸的平均浓度为5.72μg/mL，范围在4.37μg/mL～6.60μg/mL，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中苏氨酸的浓度与最终回收的总胚胎数无相关性(回归方程为：y＝-3.9087x+28.287；R＝-0.215，P＞0.05)。

综上所述，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中精氨酸与最终回收的总胚胎数呈显著正相关，赖氨酸、胱氨酸和苏氨酸与最终回收的总胚胎数无相关性。

实施例3一种评定绵羊超数排卵产生的总胚胎数的系统

本发明提供一种评定绵羊的超数排卵供体的系统，包括数据采集模块、数据存储模块、分析判断模块和输出模块。

所述数据采集模块用于获取待测样本的特征参数，所述特征参数包括待测绵羊的外周血的AMH浓度、P4浓度和精氨酸浓度。

所述数据存储模块用于储存数据采集模块获得的特征参数和分析判断模块中的阈值；

所述分析判断模块用于根据特征参数和阈值判断待测样本超数排卵产生的总胚胎数，具体评判标准为：待测样本的抗缪勒管激素浓度为176.0～190.82ng/mL或孕酮浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL，则所述待测样本所属绵羊的超数排卵最终效果为：总胚胎数为10～37枚；待测样本的抗缪勒管激素浓度为179.0～190.82ng/mL或孕酮浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL，则所述超数排卵供体的总胚胎数为15～37枚。

所述输出模块用于输出待测样本超数排卵产生的总胚胎数。

实施例4一种选择绵羊超数排卵的供体的试剂盒

1、组成

试剂盒的主要成分包含抗缪勒管激素、孕酮和精氨酸的检测试剂。抗缪勒管激素和孕酮的检测试剂为ELISA试剂盒；精氨酸的检测试剂为全自动氨基酸分析仪的检测试剂，包含精氨酸标准品、甲醇、盐酸、缓冲液和反应液等。

2、使用方法

(1)待测样本的外周血采集

本试剂盒对绵羊的品种没有特殊限定，可以是东佛里生羊、戴瑞奶绵羊、萨福克羊、德克塞尔羊等。

本试剂盒对待测样本外周血的采集部位和采集方式没有特殊限定，外周血采集后分离得到血清。

(2)血清中抗缪勒管激素、孕酮和精氨酸的浓度测定

使用抗缪勒管激素、孕酮和精氨酸的检测试剂，按照实施例2的方法测定待测样本外周血血清中抗缪勒管激素、孕酮和精氨酸的浓度。

(3)供体羊的选定

根据上一步的检测结果，若血清的抗缪勒管激素浓度为176.0～190.82ng/mL或孕酮浓度为35.0～49.5ng/mL或精氨酸浓度为33.0～80.0μg/mL，则待测样本超数排卵产生的总胚胎数为10～37枚，可作为超数排卵的供体羊；若抗缪勒管激素浓度为179.0～190.82ng/mL或孕酮浓度为35.0～46.5ng/mL或精氨酸浓度为47.0～80.0μg/mL，则待测样本超数排卵产生的总胚胎数为15～37枚，可作为超数排卵的供体羊。

实施例5选择绵羊超数排卵的供体的试剂盒的应用

本实施例以东佛里生羊为例，使用实施例4所述的试剂盒进行实验。

1、实验方法

(1)随机挑选50只1～2周岁的经产东佛里生母羊作为供体羊，体重为67.5±2.5kg，按照实施例1的方法对供体羊进行超数排卵，统计各供体羊产生的胚胎数。

(2)使用实施例4所述的试剂盒从50只供体羊中筛选出适合超数排卵的供体，再按照实施例1的方法对筛选出的供体羊进行超数排卵，统计筛选出的供体羊产生的胚胎数。根据公式计算试剂盒的准确性，计算公式为：准确性(％)＝实际胚胎达标的筛选出的供体羊个体数/筛选出的供体羊个体数×100％。

(3)对比分析实施例4的试剂盒的效果，并比较使用和不使用实施例4所述的试剂盒筛对超数排卵的胚胎数量及成本的影响。

2、实验结果

(1)实施例4试剂盒的准确性

如图11所示，50只供体母羊外源激素处理前测得供体羊外周血中抗缪勒管激素浓度，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中抗缪勒管激素的浓度与最终回收的总胚胎数呈极显著正相关(R＝0.522，P＜0.05)。总胚胎数在10枚以下，抗缪勒管激素的预测准确率为53.13％(17只/32只)；总胚胎数10枚时，抗缪勒管激素浓度为176ng/mL预测准确率为77.78％(14只/18只)；总胚胎数15枚时，抗缪勒管激素浓度为179ng/mL预测准确率为80％(4只/5只)。

如图12所示，50只供体母羊外源激素处理前测得供体羊外周血中孕酮浓度，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中孕酮的浓度与最终回收的总胚胎数呈极显著负相关(R＝-0.374，P＜0.05)。总胚胎数在10枚以下，孕酮的预测准确率为62.5％(20只/32只)；总胚胎数10枚时，孕酮浓度为49.5ng/mL预测准确率为83.33％(15只/18只)；总胚胎数15枚时，孕酮浓度为46.5ng/mL预测准确率为80％(4只/5只)。

如图13所示，50只供体母羊外源激素处理前测得供体羊外周血中精氨酸浓度，通过线性回归分析得到第一次外源激素处理前供体羊外周血中精氨酸的浓度与最终回收的总胚胎数呈极显著正相关(R＝0.64，P＜0.05)。总胚胎数在10枚以下，精氨酸的预测准确率为65.63％(21只/32只)；总胚胎数10枚时，精氨酸浓度为33μg/mL预测准确率为88.89％(16只/18只)；总胚胎数15枚时，精氨酸浓度为47μg/mL预测准确率为100％(5只/5只)。

综上，实施例4的试剂盒预测绵羊超数排卵产生的胚胎数的准确性好。

(2)超数排卵及实施例4试剂盒的成本核算

超数排卵所用药品和实施例4试剂盒检测的价格如表4所示。

表4超数排卵所用药品和试剂盒检测的价格

使用实施例4的试剂盒筛选供体母羊和不使用实施例4的试剂盒筛选供体羊，超数排卵后产生胚胎的情况如表5所示。

表5超数排卵产生胚胎的情况

不使用实施例4的试剂盒筛选供体羊的情况下，50只全部供体羊最终回收胚胎数377枚，用药总成本为：38100元，平均每枚胚胎的成本为101.06元。

使用实施例4的试剂盒筛选供体羊的情况下，抗缪勒管激素筛选50只供体羊所需成本为1823元，筛选出31只供体羊，最终回收胚胎数309枚，平均每枚胚胎的成本为82.35元；孕酮筛选50只供体羊所需成本为1458.5元，筛选出35只供体羊，最终回收胚胎328枚，平均每枚胚胎的成本为85.76元；精氨酸筛选50只供体羊所需成本为5000元，筛选出37只供体，最终回收胚胎数345枚，平均每枚胚胎的成本为96.21元。

综上，实施例4的试剂盒筛选超数排卵的供体羊，可以提高供体羊的平均胚胎数，提高超数排卵-胚胎移植的效率，降低成本。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。