一种跨膜蛋白176B重组载体和跨膜蛋白176B的分泌表达方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种跨膜蛋白176B重组载体和跨膜蛋白176B的分泌表达方法。跨膜蛋白176B重组载体包括表达载体和插入片段，插入片段包括按顺序依次连接的编码IgG信号肽的基因序列、编码跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列和编码mFC‑6His蛋白标签的基因序列。本发明通过选取跨膜蛋白176B的特定片段与IgG信号肽和mFC‑6His蛋白标签搭配，基于真核细胞表达系统，成功实现了跨膜蛋白176B的分泌表达，获取了高浓度跨膜蛋白176B重组蛋白，高浓度和高纯度跨膜蛋白176B的获取为深入研究跨膜蛋白176B的功能提供了可能，也为开发其功能性抗体提供了便利。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种跨膜蛋白176B重组载体和跨膜蛋白176B的分泌表达方法。

背景技术

跨膜蛋白(Transmembrane protein，TMEM)多与细胞间、细胞内的信号传到、免疫相关疾病以及肿瘤发生、发展等相关并参与多项生理过程，如构成质膜的离子通道、活化信号转到通路、介导细胞趋化、黏附、凋亡、自噬作用等。跨膜蛋白176B(TMEM176B)以前称为TORID(耐受相关和可诱导转录本)，最早在肺成纤维细胞中被发现，属于跨膜4A(Membrane-Spanning 4-Domains，subfamily A，MS4A)蛋白家族，定位在人第7号染色体(鼠源性定位第6号染色体)上，其在免疫细胞和某些癌症中差异表达。有研究表明，TMEM176B对树突细胞成熟有抑制作用，推测可能会抑制机体抗肿瘤免疫。TMEM176B在同种异体移植小鼠模型的抗原递呈细胞中表达上调，但关于其在细胞内过程中的作用仍有许多待了解。目前对跨膜蛋白家族成员尤其是TMEM176B功能报道的文献甚少，表明对其研究仍处于初级阶段，也为该领域研究提供了广泛空间。这是因为TMEM176B定位在细胞核膜，常规方法难以分离得到纯化蛋白。有研究人员通过构建一些过表达细胞系来实现TMEM176B基因的持续过表达，并通过抗体进行验证，以研究其性质，但该方法只能初步判断其功能，无法获得高质量的纯化蛋白进行深入研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种跨膜蛋白176B重组载体，并提供了基于该跨膜蛋白176B重组载体的分泌表达方法，以解决现有技术中难以获得高质量跨膜蛋白176B的技术问题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面提供了一种跨膜蛋白176B重组载体，所述跨膜蛋白176B重组载体包括表达载体和插入片段，所述插入片段包括按顺序依次连接的编码IgG信号肽的基因序列、编码跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列和编码mFC-6His蛋白标签的基因序列；其中，所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，编码所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步地，所述IgG信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码所述IgG信号肽的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步地，所述mFC-6His蛋白标签的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，编码所述mFC-6His蛋白标签的基因序列如SEQ ID NO：7所示。

进一步地，所述表达载体包括pCDNA3.4。

本发明的第二方面提供了一种包含如上所述的跨膜蛋白176B重组载体的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞包括HEK293F细胞。

本发明的第三方面提供了一种跨膜蛋白176B的分泌表达方法，包括以下步骤：

S1、利用如上所述的跨膜蛋白176B重组载体转染宿主细胞；

S2、培养转染后的宿主细胞，利用真核表达系统表达蛋白，收集培养上清液进行纯化，得到分泌形式的跨膜蛋白176B。

进一步地，步骤S1中，构建所述跨膜蛋白176B重组载体包括：将编码IgG信号肽的基因序列、编码跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列和编码mFC-6his蛋白标签的基因序列连接到表达载体pCDNA3.4上，之后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行阳性克隆筛选，并经测序验证，获得所述跨膜蛋白176B重组载体。

进一步地，步骤S1中，采用瞬时转染技术将所述跨膜蛋白176B重组载体转染进宿主细胞，所述宿主细胞包括HEK293F细胞。

本发明的第四方面提供了一种分泌蛋白，由上述所述的跨膜蛋白176B的分泌表达方法制备得到，所述分泌蛋白包括跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸和mFC-6his蛋白标签，所述mFC-6his蛋白标签紧接在所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的C端。

本发明的优点及积极效果为：

本发明通过选取跨膜蛋白176B的特定片段(142-196aa)与IgG信号肽和mFC-6His蛋白标签搭配，构建跨膜蛋白176B重组载体，将前述重组载体转入宿主细胞内，基于真核细胞表达系统，成功实现了跨膜蛋白176B的分泌表达，获取了高浓度TMEM176B重组蛋白，表达量约为110mg/1000mL Cells，高浓度和高纯度跨膜蛋白176B的获取为深入研究跨膜蛋白176B的功能提供了可能，也为开发跨膜蛋白176B功能性抗体提供了便利。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例的TMEM176B蛋白跨膜域结构分析图；

图2为本发明实施例的TMEM176B蛋白的三级结构分析图；

图3为本发明实施例构建质粒1-3时的目的基因扩增结果图；

图4为本发明实施例的质粒1-3转染真核细胞后的细胞培养浓度随时间变化图；

图5为本发明实施例的质粒1-3转染真核细胞后的细胞存活率(Vability)随时间变化图；

图6为本发明实施例的质粒1-3转染真核细胞后采用WB验证的蛋白表达图；

图7为本发明实施例的质粒3转染真核细胞后的蛋白纯化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种跨膜蛋白176B重组载体，所述跨膜蛋白176B重组载体包括表达载体和插入片段，所述插入片段包括按顺序依次连接的编码IgG信号肽的基因序列、编码跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列和编码mFC-6His蛋白标签的基因序列；其中，所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在本发明的上下文中，“信号肽”用于引导外源蛋白的分泌表达。“分泌”是指蛋白质或肽的分子在细胞内合成后被转运到细胞外。“mFC-6His蛋白标签”包括依次连接的mFC和6×His，命名为mFC-6His标签。

跨膜蛋白176B(以下简称TMEM176B蛋白)是一种四跨膜蛋白，属于跨膜4A(MS4A)蛋白家族，包含四个跨膜结构域及C端的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，其氨基酸序列见NCBI登录号：NM_001164207.1、核苷酸序列见NCBI登录号：NP_001157679.1。通过对蛋白结构和跨膜结构域分析(见图1-2)发现，该蛋白的N端与C端均为无规则的线性结构，与蛋白质功能无关，61-81aa、89-109aa、121-141aa、197-217aa为跨膜区域，图2为TMEM176B蛋白的三级结构分析，显示所选区域的可信度较高。在选择表达区域时应该避免跨膜的氨基酸区域，定位于核膜本身会导致蛋白质难以分泌，因此，本发明选择142-196区间的55个氨基酸为最终稳定形式，且142-196表达区域(氨基酸序列参见SEQ ID NO：4)能够覆盖异构体区域，能够代表蛋白功能。该区段表达出来的蛋白质可用于开发功能性抗体。

众所周知，同一个表达盒搭配不同物种的蛋白标签和信号肽对其分泌影响较大，在本发明中，通过选取TMEM176B蛋白的特定片段与特定的信号肽和蛋白标签搭配构建跨膜蛋白表达盒，具体而言，表达载体中的插入片段按5’端向3’端，依次连接信号肽基因序列、TMEM176B蛋白142-196aa基因序列和蛋白标签基因序列，得到的编码蛋白按N端向C端为依次连接的IgG信号肽、TMEM176B蛋白142-196aa和mFC-6His蛋白标签，将本发明的重组载体转入宿主细胞内，成功实现了TMEM176B蛋白的分泌表达，并经WB验证及亲和纯化获取了高浓度TMEM176B重组蛋白，表达量约为110mg/1000mL Cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。本发明的实施为其他跨膜蛋白分泌表达的信号肽和标签序列提供了参考依据。

可选地，编码所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列如SEQ ID NO：5所示，其用于编码TMEM176B蛋白第142位(含)至第196位(含)区间共61个氨基酸。

可选地，所述IgG信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码所述IgG信号肽的基因序列如SEQ ID NO：3所示。

可选地，所述mFC-6His蛋白标签的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，编码所述mFC-6His蛋白标签的基因序列如SEQ ID NO：7所示。

可选地，所述表达载体包括真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体为pCDNA3.4。

本发明另一实施例提供了一种包含如上所述的跨膜蛋白176B重组载体的宿主细胞。

通过本领域的常规方法培养上述的宿主细胞，可得到高纯度、高浓度的分泌形式的跨膜蛋白176B。所述包含如上所述的跨膜蛋白176B重组载体的宿主细胞相对于现有技术的优势与如上所述的跨膜蛋白176B重组载体相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

可选地，所述宿主细胞包括真核细胞，所述真核细胞包括HEK293F细胞。

本发明又一实施例提供了如上所述的跨膜蛋白176B重组载体或者包含如上所述的跨膜蛋白176B重组载体的宿主细胞在制备分泌蛋白领域的应用。具体而言，一种跨膜蛋白176B的分泌表达方法，包括以下步骤：

S1、利用如上所述的跨膜蛋白176B重组载体转染宿主细胞；

S2、培养转染后的宿主细胞，利用真核表达系统表达蛋白，收集培养上清液进行纯化，得到分泌形式的跨膜蛋白176B。

所述跨膜蛋白176B的分泌表达方法相对于现有技术的优势与如上所述的跨膜蛋白176B重组载体相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

需要注意的是，培养上清液中获得的分泌形式的跨膜蛋白176B仅包括TMEM176B蛋白142-196aa和mFC-6His蛋白标签，mFC-6His蛋白标签紧接在所述TMEM176B蛋白的C端，而IgG信号肽在其分泌过程中会锚定在细胞膜上，并被剪切掉，其不会参与蛋白质的功能，也不在分泌形式的蛋白结构中。

具体地，步骤S1中，通过将IgG信号肽的基因序列、TMEM176B蛋白142-196aa的基因序列与mFC-6his蛋白标签基因序列连接到表达载体pCDNA3.4上的多克隆位点，即可获得本发明的跨膜蛋白176B重组载体。为简化操作，通常可以采用带有信号肽和mFC-6his蛋白标签的表达载体作为初始载体，如此在构建本发明的重组载体时可以省略二者的构建过程。如将编码IgG信号肽的基因序列(如SEQ ID NO：3所示)和编码跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的基因序列(如SEQ ID NO：5所示)连接到带有IgG信号肽和mFC-6his蛋白标签的表达载体pCDNA3.4上，之后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行阳性克隆筛选，并经测序验证，获得所述跨膜蛋白176B重组载体。

具体地，步骤S1中，采用瞬时转染技术将所述跨膜蛋白176B重组载体转染进宿主细胞，所述宿主细胞包括HEK293F细胞。

具体地，步骤S2中，所述纯化方法为亲和纯化。

本发明再一实施例提供了一种分泌蛋白，由上述所述的跨膜蛋白176B的分泌表达方法制备得到，所述分泌蛋白包括跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸和mFC-6his蛋白标签，所述mFC-6his蛋白标签紧接在所述跨膜蛋白176B第142至第196氨基酸的C端。

所述分泌蛋白相对于现有技术的优势与如上所述的跨膜蛋白176B的分泌表达方法相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。

一、重组载体构建

TMEM176B蛋白全长263aa，其中61-81aa、89-109aa、121-141aa、197-217aa为跨膜区域，结合小鼠序列同源性分析，选择142-196aa为最终稳定形式，构建到哺乳动物表达载体，并使用Expi-293F哺乳动物细胞真核系统表达蛋白。信号肽和蛋白标签插入到表达载体pCDNA3.4中采用的技术为本领域常规技术，在此不再赘述。本部分仅描述跨膜蛋白176B的插入过程。本实施例构建如下重组载体：

以上所涉及的序列信息如下：

使用Primer 5进行引物设计，引物序列为：

以上述引物、采用RK20715试剂盒(购自ABclonal)进行PCR扩增，PCR体系为50μL，其中：Gloria Nova HS 2X HF Master Mix 25μL、ddH

PCR反应完成后，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证(见图3)，可以看到165bp的单一条带，说明得到了纯的目的基因，之后采用康为世纪琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：CW2302)回收目的条带，得到纯的目的基因。

将上述纯化的目的基因采用同源重组的方式与带有信号肽和蛋白标签的表达载体pCDNA3.4进行连接转化，连接体系为：目的基因2μL、pCDNA3.4载体3μL、2X MultiFSeamless Assembly Mix(购自ABclonal，货号：RM20523)5μL，目的基因与表达载体pCDNA3.4比例根据回收后的浓度决定，摩尔比范围3:1-10:1，在50℃连接30min。之后取连接产物10μL全部转入DH5α感受态细胞，经过冰浴、热激、复苏及过夜培养后采用通用引物进行菌落PCR鉴定，PCR体系为20uL，其中：菌液4μL、上游和下游通用测序引物1+1μL、热启动Taq 2X PCR预混液(含Dye，购自ABclonal，货号RK20605)10μL、ddH

取菌落PCR鉴定中的阳性克隆采用载体通用引物进行测序验证(测序公司：武汉金开瑞生物科技有限公司)，测序正确后的表达质粒用于后续的蛋白表达，所得质粒1浓度为1000ng/uL，所得质粒2浓度为1122ng/uL，所得质粒3浓度为1200ng/uL。

上述所述的通用引物的序列如下所示：

二、转染

真核细胞HEK293F分为瞬时转染和稳定转染，瞬时转染质粒DNA进入细胞后不被整合到染色体中，以游离状态表达外源基因；瞬时转染周期短，能够快速获得目的蛋白，能够应用于研发阶段的摸索和大规模高通量筛选蛋白。本实施例采用瞬时转染技术，将质粒1-3分别转染进真核细胞HEK293F，得到表达分泌蛋白的宿主细胞，具体包括以下步骤：

(1)在培养基中转染前一天以1.3E6细胞/mL分离真核细胞HEK293F，细胞体积27mL；

(2)在转染之前，将所有试剂置于室温下，并将细胞密度调节到2.6E6/mL；

(3)在无菌试管中用1.5mL Opti-MEM稀释30μg质粒DNA(质粒1或质粒2或质粒3)，另外将90μL PEI(1mg/mL，pH7.1)加入1.5mL Opti-MEM中，混匀静置5min；

(4)将PEI的混合溶液加入到质粒的混合溶液中，翻转或移液混合(混匀的过程要求缓慢进行)，之后在室温下孵育20分钟以下；

(5)将质粒/PEI混合物加入真核细胞培养液中，通过轻轻旋转将它们充分混合，混合后细胞总体积30mL；

(6)转染后16-20h第一次补料1.5mL，96h后测细胞存活率及细胞密度；以转染当天计为第0天，表达4天，每天检测活细胞数、细胞存活率，当细胞活率降至70％以下时，停止表达并收HEK293F细胞和细胞培养上清液，测定结果见图4-5；

(7)收集上清液添加10mM AEBSF进行亲和纯化。

三、表达与纯化

3.1、Western Blot(WB)验证表达

样品制备：取转染后HEK293F细胞100μL，3000r/min离心10min，收集离心后上清20μL加20μL的2×loading buffer制样，97℃加热10min，命名为上清(supernatant)；同时收集沉淀使用100μL PBS进行悬浮后，取20μL加20μL得2×loading buffer制样，97℃加热10min，命名为细胞(cell)；WB检测过程如下：

(1)取上述制得的样品上样5μL进行SDS-PAGE电泳，电泳采用恒压模式，5％浓缩胶80V，当marker开始分离大约25min，调至120V，溴酚蓝至分离胶底部终止电泳；

(2)转膜：组装顺序为：转膜夹黑色面(负极)－海绵垫－3层滤纸－胶－膜－3层滤纸－海绵垫－红色面(正极)；转膜时间：200mA、90-180min；

(3)封闭：转膜完成后标记并洗去转膜液(TBST、5min×2次)；清洗干净的膜放入盛有3％脱脂牛奶(TBST配制)的容器中，室温封闭60-90min；

(4)6His-tag一抗孵育：封闭完成后，倒掉封闭液。加入用3％脱脂牛奶(TBST配制)1:7000稀释的一抗溶液，摇床上平缓摇动，室温孵育2h或4℃孵育过夜(4℃孵育后需室温再孵育15-30min)。一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

(5)二抗孵育：一抗孵育完成前，将对应一抗种属的酶标二抗1：5000稀释到实验需要的量(TBST稀释)。将清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，摇床上缓慢摇动，于室温孵育60-80min。二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min；

(6)曝光：用镊子将膜从TBST中取出，适当控干，置于凝胶托盘。用ECL Solution I和Solution II等体积混合，均匀加至膜上，完全覆盖。底物与膜反应约30s，置于化学发光成像系统仪。设置的曝光时间为3s；10s；30s；60s；120s。

取收获后的细胞和上清进行WB检测，结果见图6。质粒1-3转染后的HEK293F细胞的中均检出目的条带，但只有质粒3转染后的HEK293F细胞的培养上清检出目的条带，TMEM176B蛋白142-196aa蛋白分泌表达在胞外，而质粒1和质粒2培养上清中没有目的条带，蛋白在细胞内表达。需要注意的是，质粒2因没有FC这类大的标签，仅计算插入蛋白质序列理论大小为8.74kD，其形成偏大的原因可能是非特异性条带，是在长时间且加强显色液的条件下曝光得到的，可以认为没有表达。根据WB检测结果，质粒3的蛋白分泌表达在胞外，因此可纯化上清。

3.2、His纯化

取WB验证的质粒3有分泌表达的细胞上清进行亲和纯化，纯化柱采用Polv-Prep@Chromatography Columns(购自BIO-RAD，货号：731-1550)和Ni Bestarose FF(购自上海博格隆)，操作流程如下：

(1)孵育：取出灭菌的10mL纯化柱管，用无内毒素水冲洗柱管1-2次。从4℃冰箱取出Ni-IDA亲和纯化基质，用移液器吸取0.5mL基质加入纯化柱管中，待乙醇流完后(商品化基质用20％乙醇保存)，用无内毒素水清洗6个柱体积。柱体积是指纯化柱中基质的体积，而非柱管的体积。用Binding Buffer平衡填料6个柱体积。将平衡好的基质加入上清管中，用封口膜封口，置于旋转培养器上，20rpm，4℃，4hr-过夜。

(2)流穿：孵育结束后，将离心管配平离心，600rpm，10min，4℃。将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿。同时留约5mL的上清用于悬浮基质，将基质转移至纯化柱管中，待流穿流完(此次流穿不用收集)。

(3)洗脱与洗杂：

a.向纯化柱管中加入3mL Washing Buffer洗柱，洗下基质中的杂蛋白。重力流，流出液用灭菌的5mL EP管收集，EP管需要插在冰上保持低温。流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续加入3mL WashingBuffer洗柱，直到G250不变蓝，结束Washing Buffer预洗脱。

b.加入0.5mL Elution Buffer 1洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 1预洗脱。

c.加入0.5mL Elution Buffer 2洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 2洗脱。

d.加入0.5mL Elution Buffer 3洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 3洗脱。

e.加入0.5mL Elution Buffer 4洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温。流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer 4洗脱。

f.将上面收集的流穿与洗脱液(Elution Buffer)制样，一般为6*制样，即20μL蛋白+5μL6*Loading Buffer，进行SDS-PAGE电泳。

上述提及的缓冲液(Binding Buffer)的配方具体如下：

根据质粒3所携带的mFC-6His标签，选择对收获上清分别进行His标签纯化，使用不同浓度的咪唑(Imidazole)进行梯度洗脱，将BSA、marker(MK)、上清(上)、纯化后的流穿液(FT)、纯化过程中的Wash Buffer(W)、不同梯度的Elution Buffer进行电泳，判断洗脱液中蛋白的量，结果见图7。

通过图7的电泳胶图可知质粒3分泌形式的TMEM176B蛋白集中在80mM和250mM咪唑浓度下被洗脱下来，40mM咪唑有少量蛋白被洗脱，收集80-1、80-2、80-3、250-1、250-2这几个梯度的洗脱液，测定蛋白浓度为110mg/1000mL Cells。

综上，本发明选取了TMEM176B蛋白的特定序列(142-196aa)，并为其设计了2个信号肽和2种标签的组合搭配，最终在信号肽2(小鼠IgG信号肽)和mFC-6His的共同存在的条件下实现了TMEM176B蛋白的分泌表达，经过WB验证及亲和纯化成功获取了TMEM176B重组蛋白，表达量约为110mg/1000mL Cells，后续可优化转染表达工艺从而实现更高的表达量。得到的高浓度和纯度的TMEM176B重组蛋白能够用于特异性抗体的研究，如开发抗TMEM176B蛋白的功能性抗体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。