tex11基因在鱼类性别控制育种中的应用

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了tex11基因在鱼类性别控制育种中的应用，申请人发现敲除鱼类的tex11基因，即可获得全部发育为可育的雄性的鱼。该方法易行，具有操作简单、不使用激素、环境友好等优点。利用基因突变的方法获得全雄的鱼品系，解决了传统的性控育种中超雄亲本制种困难及需要采用激素处理转性生产影响环境等问题，不需要进行大量繁琐的激素诱导性反转的操作就可以获得全部发育为雄性的鱼，具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及tex11基因在鱼类性别控制育种中的应用，以本发明提供的基因为靶序列，利用本领域的常规方案使其失去原始功能，即可获得全部发育为可育的雄性的鱼。

背景技术

鱼类摄入的营养物质和能量在性成熟前主要用于躯体生长，许多鱼类的性成熟年龄存在性别差异，其生长特性具有明显的性别二态性。有的鱼如鲤鱼和半滑舌鳎等因卵巢成熟晚，因此其雌性个体比雄性个体大；有的鱼如黄颡鱼、斑鳢和乌鳢等则是雄性具有明显的生长优势。因此，建立性控育种技术，培育全雄或全雌的养殖鱼类新品种具有重要应用价值。

目前采用的鱼类性控育种技术主要是添加外源激素对受体鱼进行人工诱导性反转，获得遗传性别与生理性别不一致的鱼，然后再通过杂交获得全雄或全雌单性鱼群体。鱼类作为最低等的脊椎动物，其性腺分化具有很强的可塑性，在性腺分化早期，性类固醇激素处理能诱导鱼类性反转，导致鱼类的生理性别与其遗传性别不一致，进而建立起性控育种技术。目前主要通过两种途径进行鱼类的人工诱导性反转。一是在饲料中直接添加性激素，改变鱼体内的激素水平，进而使其性别发生反转；二是通过在饲料中添加外源性药物，干扰鱼体内激素与相应的受体结合，导致体内激素无法有效发挥作用，进而促使鱼的生理性别反转。如分别通过甲基睾丸酮、雌二醇和来曲唑等处理，分别获得伪雄鲤鱼(XX)和超雄黄颡鱼(YY)，从而建立了鲤鱼和黄颡鱼的性控育种技术，并培育出养殖新品种。将伪雄鲤鱼(XX)与对照雌鲤(XX)杂交，获得了全雌鲤(吴清江,叶玉珍,陈荣德,等.雌核发育系红鲤8305的产生及其生物学特性.海洋与湖沼,1991,22:295–300.)；将超雄黄颡鱼(YY)与对照黄颡鱼(XX)杂交，获得了全雄黄颡鱼[Liu H,Guan B,Xu J,et al.Genetic manipulation of sexratio for the large-scale breeding of YY super-male and XY all-male yellowcatfish(Pelteobagrusfulvidraco(Richardson)).Mar Biotechnol(NY),2013,15:321–328.]。此外，在罗非鱼等少数鱼中还将种间杂交与性反转技术相结合建立性控育种新技术，进而培育全雄的养殖新品种。利用性反转技术获得YY超雄尼罗罗非鱼(性别决定类型为XX/XY)，通过尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼(性别决定类型为ZZ/ZW)的种间杂交获得WY雌鱼，通过WY雌鱼与YY超雄尼罗罗非鱼杂交获得YY超雄维持系，再将YY超雄尼罗罗非鱼与对照雌性尼罗罗非鱼杂交，进而培育全雄罗非鱼“粤闽1号”新品种[刘志刚,卢迈新,曹建萌,高风英.罗非鱼“粤闽1号”及其繁育群体的遗传多样性和遗传关系分析.渔业科学进展,2018,39(06):31-41.]。

利用上述性控育种技术虽然培育出了鱼类新品种，但是，这些技术在育种过程中都需要使用激素处理受体鱼诱导其性反转，存在激素诱导的性反转效率低下及可能对环境影响等问题。此外，在撤去外源激素后，有些性反转的鱼又可能回复其自然的性别，导致无法获得稳定的性控育种亲本。因此，亟需建立精准、高效、绿色安全的性控育种新技术。

作为一种重要的模式生物，斑马鱼被广泛应用于脊椎动物的生长、发育、生殖、性别、生理、毒理和疾病等研究。现有研究认为，长期驯化的斑马鱼已失去了性别决定基因(Wilson CA,High SK,McCluskey BM,et al.Wild sex in zebrafish:loss of thenatural sex deter minant in domesticated strains.Genetics,2014,198:1291-1308.)，实验室饲养的斑马鱼性别受到多遗传因子调控和环境因素影响[Hosseini S,HaNT,Simianer H,et al.Genetic mechanism underlying sexual plasticity and itsassociation with colour patterning in zebrafish(Danio rerio).BMC Genomics,2019,20:341]。如dmrt1、amh和gsdf等雄性相关因子以及cyp19a1a和foxl2等雌性相关因子在斑马鱼的性别分化中扮演了角色。此外，斑马鱼的性别分化还与早期原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)的数量有关，敲低或敲除在PGCs的迁移和存活中具有重要作用的dead end(dnd)基因，剔除了PGC的斑马鱼则全部发育为不育的雄性[Slanchev K,Stebler J,de la Cueva-Mendez G,et al.Development without germ cells:the roleof the germ line in zebrafish sex differentiation.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,2005,102(11):4074-4079.Tzung K W,GotoR,Jolly M,et al.Early Depletion of primordial germ cellsin zebrafish promotes testis formation.Stem Cell Reports,2015,4,61–73.]。

Testis-expressed gene 11(Tex11)最初在小鼠精原细胞特异性转录物中被鉴定处理，是X连锁的生殖细胞特异表达基因[Wang P J,McCarrey J R,Yang F,et al.Anabundance of x-linked genes expressed in spermatogonia.Nature Genetics,2001,27(4):422-426.]。斑马鱼tex11基因全长19,158bp，其mRNA全长为3,128bp，编码913个氨基酸。通过结构域预测发现，Tex11蛋白可能有2个介导蛋白与蛋白相互作用的tetratricopeptide repeat motif(TPR)。目前，tex11基因在鱼类中的功能还未见任何报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了tex11基因在鱼类性别控制育种中的应用，所述的tex11基因的NCBI号为：Gene Bank Accession Number：NC_007125，以该基因为目的基因，进行基因突变或缺失，使其失去原始功能，可以快速获得雄性可育的鱼。

为了达到上述目的，本发明采取了以下措施：

tex11基因在鱼类性别控制育种中的应用，可以利用本领域的常规方式以鱼类的tex11基因为目的基因进行缺失或突变，使其失去原始功能，可获得全部发育为雄性的鱼类品系；

以上所述的应用中，优选的，所述的鱼类为斑马鱼、黄颡鱼或鳜鱼；

以上所述的应用中，优选的，采取TALENs的方式，进行基因编辑；

以上所述的应用中，优选的，当鱼类为斑马鱼时，是以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列为靶位点进行基因编辑；

以上所述的应用中，优选的，获得的斑马鱼中，包含编码SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7所示蛋白的基因序列；

以上所述的应用中，获得的tex11突变的亲本，通过F0突变体与野生型斑马鱼杂交产生F1代胚胎，筛选出的幼鱼继续培养，F1代突变体自交，筛选出tex11纯合突变，tex11纯合突变体全部发育为稳定遗传的雄性斑马鱼。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的方法可用于精准研制全雄鱼品系，该方法易行，具有操作简单，不使用激素，环境友好等优点。利用基因突变的方法获得全雄的鱼品系，解决了传统的性控育种中超雄亲本制种困难及需要采用激素处理转性生产影响环境等问题，不需要进行大量繁琐的激素诱导性反转的操作就可以获得全部发育为雄性的鱼，具有重要的应用价值。该方法不仅为培育养殖鱼类性控新品种提供了具有重要育种价值的靶基因和精准高效的性控育种新技术，而且建立的可育的全雄鱼模型还可以用于鱼类生殖细胞与体细胞相互作用的机理、性别决定与分化的调控机制等基础研究。

附图说明

图1为斑马鱼tex11基因的突变设计和F0靶位点的序列分析示意图；

确定靶位获得了序列的突变。

图2野生斑马鱼雌鱼、野生斑马鱼雄鱼和tex11纯合突变斑马鱼的外观和性腺发育特征；其中，A为野生斑马鱼雌鱼(WT♀)；B为野生斑马鱼雄鱼(WT♂)；C为使用TALENs对tex11基因在靶序列突变后获得的可稳定遗传的雄性斑马鱼突变体成鱼。SG：精原细胞；SC：精母细胞；ST：精子细胞；I:I期卵母细胞；II：II期卵母细胞；

图3野生斑马鱼雄鱼和tex11纯合突变斑马鱼雄鱼的性腺指数及其与野生雌鱼杂交的受精率。

具体实施方法

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

本发明以斑马鱼的tex11基因编辑为例，进行鱼类性别控制实验。根据斑马鱼tex11基因序列，申请人同时扩增了黄颡鱼，鳜鱼的tex11基因，同时进行了基因敲除，也可获得可育的雄性后代。

实施例1：

tex11基因在鱼类性别控制育种中的应用：

本发明通过敲除斑马鱼的tex11基因获得全雄可育斑马鱼品系，所述的斑马鱼的tex11基因的ORF框为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

1.1实验材料

本发明所用的斑马鱼为AB品系，养殖在中国科学院水生生物研究所28℃的恒温循环水中，每天14h光照/10h黑暗处理。显微注射所用的胚胎由斑马鱼自然产卵获得。

1.2实验方法

确定斑马鱼tex11基因的TALENs靶位点，左侧为5’-GTCAGAGAAACTCCTCCA-3’，右侧为5’-ACTTGGATGAAGTGATTG-3’，中间的间隔序列为5’-CAGACAGAGCCATTCAG-3’。

1.2.1构建tex11基因敲除质粒

使用Golden Gate方法构建tex11基因敲除质粒tex11-TALEN-Left和tex11-TALEN-Right，构建过程参考已发表的文献[Liu Y,Luo D,Lei Y,Hu W,Zhao H,Cheng CH.(2014)A highly effective TALEN-mediated approach for targeted gene disruptionin Xenopus tropicalis and zebrafish.Methods.69(1):58-66]。

具体的步骤如下：

(1)用BsaI内切酶(NEB,R0535S)对识别tex11-TALEN-Left和tex11-TALEN-Right前10个碱基的单模块化质粒以及pFUS_A进行线性化，用T4连接酶(NEB,M0202T)连接，得到tex11-Left-pFUS_A和tex11-right-pFUS_A；用BsaI内切酶对识别tex11-TALEN-Left和tex11-TALEN-Right11-17位共7个碱基的单模块化质粒以及pFUS_B进行线性化，用T4连接酶连接，得到tex11-Left-pFUS_B和tex11-Right-pFUS_B。

(2)将测序正确的tex11-Left-pFUS_A、tex11-Left-pFUS_B、识别第18个碱基的单模块化质粒以及pCS2-TALEN-ELD用Esp3 I内切酶(Fermentas,ER0451)进行线性化，用T4连接酶连接，得到tex11-TALEN-Left；

将测序正确的tex11-Right-pFUS_A、tex11-Right-pFUS_B、识别第18个碱基的单模块化质粒以及pCS2-TALEN-KKR用Esp3 I内切酶进行线性化，用T4连接酶连接，得到tex11-TALEN-Right。

1.2.2体外转录tex11-TALEN-Left和tex11-TALEN-Right mRNA

用Not I内切酶(NEB，R0189S)tex11-TALEN-Left和tex11-TALEN-Right线性化，用体外转录mMESSAGE mMACHINE

1.2.3显微注射

注射前一天将雌、雄斑马鱼在产卵缸中用隔板隔开。注射前抽调隔板，自然产卵受精，每隔15分钟收集一次受精卵。注射前将tex11-TALEN-Left和tex11-TALEN-Right的mRNA1:1混合，二者终浓度均为300ng/μL，并加入少量酚红作为指示剂。利用氮气加压的定量显微注射系统(Warner，美国)在受精卵进入2胞期前将实验样品注射到动物极中，注射后的受精卵置于28℃培养。

1.2.4筛选tex11纯合突变体

收集注射后的24hpf胚胎进行基因型检测。提取DNA后，利用PCR检测靶位点的突变情况。

检测引物为F1:5’-GAAGTAAAAGGTACGTTTGCGGTAA-3’和R1:5’-GACTAATACAAGGACAGACCTTTGG-3’。

PCR体系为：2×Taq MasterMix(CWBIO，江苏)10μL，上下游引物各1μL，基因组DNA模板1μL，无菌水7μL。反应条件为：94℃预变性3min，30个循环(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s)，72℃再延伸5min。PCR产物直接送测序后，将靶位点附近出现套峰的胚胎群体养至性成熟，称为P0代。

P0代群体中逐条斑马鱼与WT测交获得F1代。待F1代性成熟之后，剪尾鳍，同上进行检测，鉴定出阳性突变体；在本实施例中，鉴定得到两种阳性突变体(-18，+1)bp杂合突变体(突变后的tex11基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.6所示)和-10bp杂合突变体(突变后的tex11基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.7所示)，具体的突变情况如图1所示。

分别将(-18，+1)bp杂合突变体自交和-10bp杂合突变体自交获得F2代。待F2代性成熟之后，剪尾鳍，同上进行检测，鉴定得到(-18，+1)bp纯合突变体，和-10bp纯合突变体。

得到的(-18，+1)bp tex11纯合突变体和-10bp纯合突变体全部发育为可育的雄性，图2显示野生斑马鱼雌鱼、野生斑马鱼雄鱼和tex11纯合突变斑马鱼的外观和性腺发育特征，图3显示野生斑马鱼雄鱼和tex11纯合突变斑马鱼雄鱼的性腺指数及其与野生雌鱼杂交的受精率。

实施例2：

tex11转基因可以拯救tex11纯合突变体全雄的表型

采用常规方法，构建了β-actin启动子驱动tex11表达的过表达斑马鱼品系，构建时用In-fusion的方法将斑马鱼β-actin启动子序列、tex11 CDs和自剪切序列P2A连入到PSKD-RFP骨架质粒中,得到tex11转基因质粒Tol2-β-actin Promoter-tex11 CDS-P2A-RFP-Tol2。通过显微注射法将tex11转基因质粒注射到实施例1制备的纯合突变体斑马鱼1胞期受精卵中，研制tex11过表达的转基因鱼，按常规的转基因鱼家系建立方法，培育出tex11过表达的转基因斑马鱼家系。将过表达品系与tex11敲除品系杂交之后再自交，获得Tg(β-actin:tex11)；tex11

通过统计各个基因型中的雌、雄个数，我们在本位敲除异位过表达的品系Tg(β-actin:te x11)；tex11