依托考昔中2-氯-1,3-双（二甲氨基）三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的分析方法

摘要

本发明公开了一种依托考昔中2‑氯‑1,3‑双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的分析方法，采用HPLC分析方法，其中采用：仪器为：带紫外检测器的高效液相色谱仪；流动相：A：磷酸盐与离子对试剂缓冲液，B：甲醇；梯度洗脱；检测波长：310nm；柱温：30～40℃；进样量：10μl；溶剂为：流动相A：B＝30：70；供试品溶液：浓度为10mg/ml；对照品溶液：浓度为0.125μg/ml；测定过程：分别取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液依次进样分析；按外标法以峰面积计算含量。本发明的分析方法，在药物中的基因毒杂质限度较低的情况下，能够采用常规的液相色谱方法分析即测定准确，减少了检测成本。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析方法，尤其涉及一种依托考昔中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的分析方法。

背景技术

“基因毒性杂质”(又称遗传毒性杂质Genotoxic Impurity，GTI)，是指本身直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向的化合物。其主要来源为原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物，此外，药物在合成、储存或者制剂过程中也可能因为降解而产生基因毒性杂质，因其特点为毒性极强，在很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤的发生，对用药的安全性产生了强烈的威胁，因此，建立便捷、高效的分析方法是非常有必要的。

基因毒性杂质检测通常采用的方法有：高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱联用法(LC-MS/MS)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、气相色谱-质谱/质谱联用法(GC-MS/MS)等。

2-氯-1,3-双(二甲基氨基)三亚甲六氟磷酸盐用于制备依托考昔，是热冲击稳定且不吸湿的固体。对于依托考昔而言，将其中的2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的量精确地检出，对于药物安全性非常重要。但是因为依托考昔中的2-氯-1,3-双(二甲基氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质限度较低，不得过12.5ppm，对于如此低的检测限度的检测，大多数企业会选择使用灵敏度更高的GC-MS或LC-MS来进行检测，但GC-MS和LC-MS成本非常高，给企业也带来了不小的负担。为了节约成本，人们希望找到更好的成本低但精度高的检测办法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低、检测精度高的依托考昔中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的分析方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

依托考昔中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的分析方法，采用高效液相色谱HPLC分析方法，其中采用：

仪器为：带紫外检测器的高效液相色谱仪；

色谱柱：艾杰尔Venusil XBP C18(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A：磷酸盐与离子对试剂缓冲液(称取磷酸二氢钾2.72g，加辛烷磺酸钠2.16g，加水1000ml使溶解，用10％稀磷酸溶液调节pH至3.5)，B：甲醇；

梯度洗脱：

流速：1.0ml/min；

检测波长：310nm；该波长下，其他杂质的吸收强度较低，峰较小，而2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐有较强的吸收，峰面积较大，从而更好地与其他杂质进行区分；

柱温：20～40℃；

进样量：10μl；

溶剂为：流动相A：B＝30：70；

供试品溶液：精密称取依托考昔原料药100mg至10ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度10ml，以得到浓度为10mg/ml的供试品溶液；

对照品溶液：精密称取2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐对照品50mg至100ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度100ml，然后继续稀释至浓度为0.125μg/ml，摇匀，即得对照品溶液；

测定过程：分别取空白溶液即溶剂、对照品溶液和供试品溶液依次进样分析，进样量均为10μl，记录色谱图；

按外标法以峰面积计算供试品中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐的含量。

作为优选，按外标法以峰面积计算供试品中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐的含量的计算公式为：

式中A

A

C

C

作为优选，结果判断：供试品溶液的色谱图中如有2-氯-1,3-(双二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐(ET-SM2)峰，按外标法计算，应不得过12.5ppm。

之所以大多数企业在对限度较低的杂质进行检测时需要使用灵敏度更高的GC-MS或LC-MS来进行检测，是因为一来本身限度低，量少，就不容易检测出，二来，杂质之间还会相互影响，影响测定，故一般都需要使用灵敏度更高的GC-MS或LC-MS来进行检测才行，但GC-MS和LC-MS成本非常高，长期的检测会给企业带来不小的负担。为此，发明人一直致力于如何降低这项成本。

发明人在研究中发现，托考昔中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质与其他已知杂质间的分离度较差，易受其他杂质的干扰；而且该杂质限度较低，需要建立一个灵敏度较高的方法才能有效检测。于是采用了先探索最优的梯度洗脱的方式，将其他杂质与2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐很好地分离，同时选择最优的波长，最终采用了310nm这个波长，该波长下，其他杂质的吸收强度较低，峰较小，而2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐有较强的吸收，峰面积较大，从而更好地与其他杂质进行区分。在较好的分离度基础上，又采用了高浓度的供试品溶液，尽量提高供试品溶液中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐的物质的量，从而使更多的2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐进入色谱仪中，提高其检出能力，最终得出了如上的能够用常规液相色谱方法准确检测限度控制很低的基因毒杂质的技术方案。

本发明的有益效果是：

本发明的依托考昔中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的分析方法，步骤巧妙，通过首先提高分离度，然后提高检出能力，两者相配合的方法，达到了在药物中的基因毒杂质限度较低的情况下，能够采用常规通用的液相色谱HPLC方法分析即准确测定出依托考昔中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐杂质含量的优异效果，完美代替了大多数企业会选择使用的灵敏度更高的LCMS检测方法，大大减少了企业的检测成本，降低了企业负担。

附图说明

为了易于说明，本发明由下述的具体实施例及附图作以详细描述。

图1为本发明方法的确定波长的紫外扫描图，图中横坐标表示波长,单位为nm，纵坐标表示吸收值,单位为A；

图2为本发明方法的色谱条件的建立中方法一条件下的ET-SM2定位色谱图，图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示色谱信号值，单位为mAU；

图3为本发明方法的色谱条件的建立中方法一条件下的各杂质混合溶液色谱图，图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示色谱信号值，单位为mAU；

图4为本发明方法的色谱条件的建立中方法二条件下的ET-SM2定位色谱图，图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示色谱信号值，单位为mAU；

图5为本发明方法的色谱条件的建立中方法二条件下的各杂质混合溶液色谱图，图中横坐标表示时间，单位为min，纵坐标表示色谱信号值，单位为mAU；

图6为本发明方法的方法验证中项目三：c.线性和范围中的线性回归方程图，图中横坐标表示浓度，单位为ug/ml，纵坐标表示峰面积，单位为μV*sec。

具体实施方式

依托考昔中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐基因毒杂质的分析方法，采用高效液相色谱HPLC分析方法，其中采用：

仪器为：带紫外检测器的高效液相色谱仪；

色谱柱：艾杰尔Venusil XBP C18(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A：磷酸盐与离子对试剂缓冲液(称取磷酸二氢钾2.72g，加辛烷磺酸钠2.16g，加水1000ml使溶解，用10％稀磷酸溶液调节pH至3.5)，B：甲醇；

梯度洗脱：

流速：1.0ml/min；

检测波长：310nm；该波长下，其他杂质的吸收强度较低，峰较小，而2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐有较强的吸收，峰面积较大，从而更好地与其他杂质进行区分；

柱温：35℃；

进样量：10μl；

溶剂为：流动相A：B＝30：70；

供试品溶液：精密称取依托考昔原料药100mg至10ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度10ml，以得到浓度为10mg/ml的供试品溶液；

对照品溶液：精密称取2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐对照品50mg至100ml容量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度100ml，然后继续稀释至浓度为0.125μg/ml，摇匀，即得对照品溶液；

测定过程：分别取空白溶液即溶剂、对照品溶液和供试品溶液依次进样分析，进样量均为10μl，记录色谱图；

按外标法以峰面积计算供试品中2-氯-1,3-双(二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐的含量，计算公式为：

式中A

A

C

C

结果判断：供试品溶液的色谱图中如有2-氯-1,3-(双二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐峰，按外标法计算，应不得过12.5ppm。

为简化描述，本实施例中，2-氯-1,3-(双二甲氨基)三亚甲六氟磷酸盐均简称为ET-SM2。

其中，方法建立及优化过程中：

1.检测波长确定：

取ET-SM2加乙腈溶解并稀释制成每1ml含10μg的溶液，在200nm～400nm的波长范围内进行紫外扫描，扫描的ET-SM2紫外图如附图1所示，图中，ET-SM2在310nm波长均有较大吸收，故将检测波长定为310nm。

2.流动相的确定：

采用磷酸二氢钾缓冲液(pH3.5)进行实验，由于ET-SM2极性较强，出峰时间较早。通过加入离子对试剂，改善其在色谱柱上的保留行为。最终确定流动相水相为pH 3.5的磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾2.72g和辛烷磺酸钠2.16g，加1000ml水溶解，用10％磷酸调节pH为3.5)；有机相为甲醇。

3.色谱条件的建立及优化：

采用等度方法，主峰峰型较差，因此拟采用梯度洗脱方式进行检测，色谱条件及结果见下表：

方法建立及优化结果表(方法一)

方法建立及优化结果表(方法二)

4.供试品浓度的确定：

供试品浓度为1mg/mL，定量限为0.30ng，进样量为10μL，则该方法最低检出限度为30ppm。将供试品浓度提高到10mg/mL，定量限和进样量不变，则最低检出限度为3ppm，可以满足12.5ppm的限度要求。故确定供试品浓度为10mg/mL。

方法验证

根据2020版中国药典四部《分析方法验证指导原则》进行了分析方法验证，各项验证项目均符合药典要求。主要内容如下表1所示：

表1依托考昔中ET-SM2方法验证总结表

方法验证的具体内容如下：

项目一：专属性

a.空白溶剂干扰

考察空白溶剂对ET-SM2检查的干扰。

①空白溶剂：流动相A:B＝30：70；

②对照品溶液：取ET-SM2对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(1μg/mL)；

精密量取上述空白溶剂、对照品溶液各10μL，照本方法确定的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。

结论：ET-SM2在8.765min出峰，空白溶剂在ET-SM2出峰位置无色谱峰，不干扰ET-SM2的检查。

b.系统适用性

考察依托考昔及各杂质与ET-SM2的分离度，确定ET-SM2检查方法的适用性。

①杂质母液：取9种不同于ET-SM2的杂质各约10mg，分别置20mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质母液(0.5mg/mL)；

②ET-SM2储备液：取ET-SM2对照品约10mg，精密称定，置100mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5mL，置50mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为ET-SM2储备液(10μg/mL)；

③系统适用性溶液：取依托考昔约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加入ET-SM2储备液1mL，各杂质母液20μL，摇匀，作为系统适用性溶液；

④混合杂质溶液：取各杂质母液20μL，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合杂质溶液；

精密量取上述③、④溶液各10μL，注入液相色谱仪，并采用二极管阵列检测器(DAD)，对ET-SM2进行峰纯度检查，记录色谱图。结果见下表2。

表2方法验证系统适用性考察结果表

结论：系统适用性试验中，依托考昔及其它杂质在ET-SM2出峰位置无色谱峰，不干扰ET-SM2的检查；ET-SM2与相邻杂质分离度为5.4、4.4；ET-SM2主峰纯度均大于0.9999，未检出不纯物，说明本方法系统适用性好。

c.破坏试验

考察强碱、强酸、氧化、高温、光照条件下产生的降解产物对ET-SM2测定的影响，放样条件及制备过程如表3所示。

表3方法验证破坏试验放样列表

分别取上述样品溶液各10μL，照方法建立项下确定的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。

结论：各破坏样品及空白溶剂在ET-SM2出峰位置均无色谱峰，说明在剧烈条件下的破坏试验不干扰本品的检查。

项目二：a.b.定量限和检测限

考察方法的灵敏度，当ET-SM2峰与基线信噪比约为10:1时，为定量限，信噪比约为3:1时，为检测限。

取ET-SM2对照品适量，精密称定，经逐级稀释制成系列浓度的供试品溶液，精密量取适当浓度的供试品溶液10μL，照本发明方法确定的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。测定结果见表4～表6。

表4依托考昔本发明方法中ET-SM2方法验证定量限考察结果表

表5依托考昔本发明方法中ET-SM2方法验证定量限考察结果表

表6依托考昔本发明方法中ET-SM2方法验证检测限考察结果表

结论：ET-SM2的检测限浓度为0.00512μg/mL，相当于供试品浓度的0.00005％，信噪比均不低于3；定量限浓度为0.01280μg/mL，相当于供试品浓度的0.00013％，信噪比均不低于10；定量限同一溶液连续6针峰面积的RSD％为3.3％，连续6份溶液峰面积的RSD％为4.6％，符合要求。

项目三：c.线性和范围

通过ET-SM2的线性测试，得出ET-SM2的线性范围。

①对照品储备液：取ET-SM2对照品10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。再取上述溶液1mL至20mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。再取上述溶液1mL至100mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

②线性溶液1(400％)：取对照品储备液作为线性溶液1。

③线性溶液2(200％)：精密移取对照品储备液5mL至10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

④线性溶液3(100％)：精密移取对照品储备液5mL至20mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

⑤线性溶液4(20％)：精密移取对照品储备液1mL至20mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

⑥线性溶液5(定量限)：精密移取线性溶液4(20％)5mL至10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

精密量取上述②～⑥溶液各10μL，照确定的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果见表7，回归方程图见图6。

表7依托考昔本发明方法线性试验结果表

结论：ET-SM2在0.01275μg/mL～0.50998μg/mL的范围内，浓度与峰面积线性关系良好。

项目四：d.准确度和重复性

向供试品溶液中加入定量限浓度、50％、100％、150％限度浓度的ET-SM2，考察测定结果的准确性和重复性。

①对照品储备液：称取50mg ET-SM2，精密称定，置100mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密移取上述溶液5mL至20mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。再精密移取上述溶液1mL至200mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得作为对照品储备液；

②供试品溶液：称取依托考昔供试品100mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。同法配制两份。

③对照品溶液：精密移取对照品储备液2mL至10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

④对照品溶液2：称取50mg ET-SM2，精密称定，置100mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密移取上述溶液5mL至20mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。再精密移取上述溶液1mL至200mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。再精密移取上述溶液2mL至10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；

⑤准确度溶液1(定量限)：精密移取对照品储备液1mL至10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。取上述溶液2mL至10mL量瓶中，加入100mg依托考昔供试品，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制3份；

⑥准确度溶液2(50％)：精密移取对照品储备液1mL至10mL量瓶中，再加入100mg依托考昔供试品，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制3份；

⑦准确度溶液3(100％)：精密移取对照品储备液2mL至10mL量瓶中，再加入100mg依托考昔供试品，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制6份；

⑧准确度溶液4(150％)：精密移取对照品储备液3mL至10mL量瓶中，再加入100mg依托考昔供试品，加溶剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制3份；

精密量取上述②～⑧溶液各10μL，照确定的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表8～表9。

表8依托考昔本发明方法准确度试验结果表

表9依托考昔本发明方法重复性试验结果表

准确度结论：定量限水平下，3份溶液回收率均在95％～101％之间；其他浓度下测得回收率均在97％～107％之间，9份溶液回收率的RSD为3.2％，说明本方法准确度好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。