SWEET糖转运蛋白磷酸化增强植物光合产物的转运和抗逆性

摘要

本发明涉及SWEET糖转运蛋白磷酸化增强植物光合产物的转运和抗逆性，具体地，本发明提供一种磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂的用途，用于增强植物光合产物的转运和抗逆性。本发明首次发现，同时促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平，可显著提高植物光合产物的转运和抗逆性。

说明书

技术领域

本发明涉及农学领域，具体地，本发明涉及SWEET糖转运蛋白磷酸化增强植物光合产物的转运和抗逆性。

背景技术

作为固着生物，植物进化出复杂的根系以便从土壤中获取水分和养分。根系具有很强的弹性，并受周围环境的调节，尤其是水分。为了更好地适应缺水，植物通过改变根的生长方向，改变侧根分布，增加根的生长和减少地上部分的生长以调整根冠比等策略来优化根系结构。这些对水分亏缺的根系反应在很大程度上与植物激素信号通路有关。植物激素细胞分裂素通过调节根分生组织区中的不对称细胞分裂来促进向水性，而生长素和ABA共同作用来控制向重性、向水性和侧根生长。然而，干旱胁迫下根冠比的调节机制还不清楚。

作为地下部分的主要营养器官，植物根系依靠从地上部分转运而来的光合同化物维持生长。蔗糖是主要的光合同化物，它通过韧皮部从源组织(如叶片)运输到库组织(如根)。然而目前植物在干旱条件下调控蔗糖运输的潜在机制却知之甚少。

因此，本领域迫切需要开发一种可增强植物抗逆性的新方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可增强植物光合产物转运和抗逆性的新方法。

本发明的第一方面提供了一种磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂的用途，可用于(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量，或制备一组合物或制剂，所述制剂或组合物用于(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量，其中所述磷酸化的SWEET蛋白包括SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化。

在另一优选例中，所述光合产物包括糖类物质。

在另一优选例中，所述糖类物质包括蔗糖。

在另一优选例中，所述SWEET蛋白包括SWEET11、SWEET12蛋白。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于选自下组的一种或多种用途：

(c)促进糖源库转运；

(d)促进根的生长；

(e)在不影响植物生长基础上提高抗旱性。

在另一优选例中，所述抗逆性选自下组：抗旱性、抗寒、抗盐碱、或其组合。

在另一优选例中，所述SWEET蛋白来自选自下组的一种或多种农作物：十字花科、禾本科、豆科。

在另一优选例中，所述的SWEET蛋白来自选自下组的一种或多种农作物：拟南芥、水稻、玉米、大豆、或其组合。

在另一优选例中，所述SWEET蛋白来自拟南芥或其变体。

在另一优选例中，所述SWEET蛋白(蛋白登录号UniProtKB ID)来源于拟南芥(SWEET11：Q9SMM5-1；SWEET12：O82587-1)；水稻(OsSWEET11:Q6YZF3；OsSWEET12:Q10LI8；OsSWEET13:QOINE1；OsSWEET14:Q2R3P9；OsSWEET15:Q6K602)；玉米(ZmSWEET13a:A0A3L6FQZ0；ZmSWEET13b:A0A3L6GDW7；ZmSWEET13c：A0A3L6GDF8)；大豆(GmSWEET10a:I1MDS5；GmSWEET10b:C6T950；GmSWEET15a:K7KPT8；GmSWEET15b:I1KR79)。

在另一优选例中，所述SWEET蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:1-13中任一所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:1－13中任一所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量活性的、由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1－13中任一所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，具有所述SWEET活性的多肽。

在另一优选例中，所述237和248位点位于对应于拟南芥SWEET蛋白(比如，SWEET11/12)的C端的第237位和248位。

在另一优选例中，所述237和248位点位于对应于水稻SWEET蛋白(比如SWEET11/15蛋白)的C端的第225位、226和227位。

在另一优选例中，所述237和248位点位于对应于玉米SWEET13a和SWEET13b蛋白的C端的第248、255和256位。

在另一优选例中，所述237和248位点位于对应于大豆SWEET蛋白：SWEET15a和SWEET15b蛋白C端的第220、227、247位。

在另一优选例中，所述237和248位点位于对应于大豆SWEET蛋白：SWEET10a和SWEET10b蛋白C端的第218位。

在另一优选例中，所述促进剂用于促进SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平。

在另一优选例中，所述促进剂包括促进SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平的物质。

在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。

在另一优选例中，所述促进剂包括ABA。

在另一优选例中，所述组合物包含(a)磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂；和(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的组合物为农用组合物。

在另一优选例中，所述组合物包含(a)磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂；和(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括十字花科、禾本科、豆科。

在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、水稻、玉米、大豆。

本发明第二方面提供了一种组合物，包括：

(a1)磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂；

(a2)其他(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量的物质；和

(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的组分(a1)或(a2)，以所述组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。

在另一优选例中，所述促进剂包括ABA。

本发明第三方面提供了一种本发明第二方面所述的组合物的用途，用于(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量。

本发明第四方面提供了一种(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量的方法，包括步骤：

给所述植物施用磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂或本发明第二方面所述的组合物；或促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平；

其中所述磷酸化的SWEET蛋白包括SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化。

在另一优选例中，所述方法包括给予植物(a)磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂；或(b)本发明第二方面所述的组合物。

在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入促进SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平的物质。

在另一优选例中，所述方法包括促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化。

在另一优选例中，所述施用选自下组：喷洒或灌溉。

在另一优选例中，所述施用的剂量为2-100g/公顷，较佳地，4-80g/公顷，更佳地，6-60g/公顷。

在另一优选例中，所述施用的剂量为1-5000微克/株，较佳地，10-2500微克/株，更佳地，20-1000微克/株。

本发明第五方面提供了一种制备基因工程的植物组织或植物细胞的方法，包括步骤：

促进植物组织或植物细胞中的SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞。

在另一优选例中，所述的基因工程包括转基因。

在另一优选例中，所述方法还包括向植物组织或植物细胞中导入促进SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平的物质。

本发明第六方面提供了一种制备性状改良的植物的方法，包括步骤：

将本发明第五方面所述的方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得性状改良的植物。

在另一优选例中，所述的性状包括(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量。

本发明第七方面提供了一种基因工程植株，所述植株中导入促进SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平的物质；或给所述植物施用磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂或本发明第二方面所述的组合物；或所述的植株是用本发明第六方面所述的方法制备的；其中所述磷酸化的SWEET蛋白包括SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化。

在另一优选例中，所述促进SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平的物质包括ABA。

本发明第八方面提供了一种SWEET蛋白的磷酸化位点，所述的位点包括：

对应于(i)来源于拟南芥的野生型SWEET蛋白的第237位和248位氨基酸；或(ii)来源于水稻的野生型SWEET蛋白的第225位、226和227位氨基酸；或(iii)来源于玉米的野生型SWEET蛋白的第248、255和256位氨基酸；或(iv)来源于大豆的野生型SWEET蛋白的第220，227，247位氨基酸或第218位氨基酸。

在另一优选例中，所述对应于(i)来源于拟南芥的野生型SWEET蛋白的第237位和248位氨基酸；或(ii)来源于水稻的野生型SWEET蛋白的第225位、226和227位氨基酸；或(iii)来源于玉米的野生型SWEET蛋白的第248、255和256位氨基酸；或(iv)来源于大豆的野生型SWEET蛋白的第220，227，247位氨基酸或第218位氨基酸被磷酸化时，所述SWEET蛋白可(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了渗透胁迫下ABA和蔗糖转运调节根系生长。

其中，(a)在水分充足或干旱的土壤中，Col-0野生型、pyl duodecuple(pyl)、snrk2.2/3/6(snrk2)和sweet11/12突变体以及SWEETpro::SWEET-HA转基因植物的根系。红线:从图像上描摹出的根。(b-c)Col-0野生型、pyl duodecuple(pyl)、snrk2.2/3/6(snrk2)和sweet11/12突变体以及SWEETpro::SWEET-HA转基因植物，在对照、甘露醇、聚乙二醇或ABA处理下的干重根冠比(b)和蔗糖含量根冠比(c)。数值为平均数±SEM(n≥10)(b),平均数±SEM(n≥5)(c)。(d)在对照和ABA处理下，野生Col-0和sweet11/12突变体韧皮部分泌物中的蔗糖水平。(e)在对照或ABA处理下，转化35S:SWEET11或35S:SWEET12的sweet11/12原生质体中的蔗糖水平。(f)在对照或ABA处理下，转化35S:SWEET11或35S:SWEET12的Col-0或snrk2.2/3/6(snrk2)原生质体中的蔗糖水平。数值为平均数±SEM(n＝3)(d-f)。

图2显示了SnRK2.2/3/6和SWEET11/12间的相互作用。

其中，(a)酵母双杂交实验中的SWEET-SnRK2相互作用。SnRK2-NubG与Cub融合的组合和NubG与SWEET-Cub的组合用作阴性对照，而NubI与SWEET-Cub的组合用作为阳性对照。(b-c)利用基于YFP(b)和荧光素酶(c)的生物分子荧光互补分析研究SWEET-SnRK2的相互作用。(d)酵母双杂交分析中SnRK2s和SWEETs C末端的相互作用。AD-SnRK2与BD的组合和AD与BD-SWET的组合用作阴性对照。

图3显示了渗透胁迫下SnRK2s磷酸化SWEET11/12。

其中，(a)基于ATPγS的体外磷酸化实验证明重组Sumo-6xHis-SnRK2.2/3磷酸化SWEET11和12的碳末端。(b)基于ATPγS的体外磷酸化实验证明重组MBP-SnRK2.6磷酸化SWEET11和12C末端的Ser237和Ser248。Anti-Thiophosphate ester抗体用来检测磷酸化蛋白。GST抗体用于检测GST-SWEET。(c)基于放射性同位素的体外磷酸化实验证明重组MBP-SnRK2.6磷酸化SWEET11和12C末端的两个位点：Ser237和Ser248。放射自显影(上图)和考马斯氏染色(下图)分别显示了GST-SWEETs的磷酸化和蛋白上样量。(d)SWEET11和SWEET12Ser248特异的磷酸化抗体分别用于检测SWEET11和12的体内磷酸化。

图4显示了SWEET磷酸化促进了渗透胁迫下蔗糖的转运。

其中，(a)在对照或ABA处理条件下，在sweet11/12原生质体中转化野生型(WT)、模拟磷酸化(S2D/E)和模拟非磷酸化(S2A)SWEET11或SWEET12,在经过外源蔗糖孵育后，检测原生质体中的蔗糖水平。数值为平均数±SEM(n＝3)。(b)在对照或甘露醇处理下，Col-0野生型、snrk2.2/3/6(snrk2)突变体和sweet11/12突变体以及SWEET12pro::SWEET12-HA转基因植物韧皮部分泌物中的蔗糖水平。数值为平均数±SEM(n＝3)。(c)在对照、ABA或甘露醇处理下，Col-0野生型、sweet11/12突变体和SWEETpro::SWEET-HA转基因植物的蔗糖含量的根冠比，数值为平均数±SEM(n≥5)。

图5显示了SWEET磷酸化促进干旱下根的生长并提高植物的抗旱性。

其中，(a)在水分充足或干旱的土壤中，Col-0野生型、sweet11/12突变体以及SWEET12pro::SWEET12-HA转基因植物的代表性根系。红线:从图像上描摹出的根。(b-c)在对照、甘露醇、聚乙二醇或脱落酸处理下，Col-0野生型、sweet11/12突变体和SWEET12pro::SWEET12-HA转基因植物根(b)和地上部分(c)的干重统计。数值为平均数±SEM(n≥10)。(d)在水分充足或干旱条件下，Col-0野生型、sweet11/12突变体和SWEET12pro::SWEET12-HA转基因植物的生长情况。(e)在水分充足或干旱条件下，Col-0野生型、sweet11/12突变体和SWEET12pro::SWEET12-HA转基因植物地上部分的鲜重统计。数值为平均数±SEM(n＝3)。“a”、“b”和“c”表示通过方差分析后的ANOVA检验进行显著性分析(p<0.05)。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的植物性状位点的研究和筛选，首次发现，同时促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平，可显著(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量，此外发明人还意外发现，同时促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平，还可促进糖转运、促进根的生长。在此基础上，发明人完成了本发明。

SWEET蛋白

如本文所用，术语“本发明多肽”、“SWEET蛋白”可以互换使用，都是指来源于植物(比如，拟南芥、水稻、玉米)的SWEET蛋白。其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。

在一优选实施方式中，所述SWEET蛋白包括SWEET11、SWEET12。SWEET11/12是拟南芥中的同源蛋白。

在一优选实施方式中，所述SWEET蛋白来源于拟南芥，氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

SWEET11氨基酸序列：

MSLFNTENTWAFVFGLLGNLISFAVFLSPVPTFYRIWKKKTTEGFQSIPYVVALFSATLWLYYATQKKDVFLLVTINAFGCFIETIYISMFLAYAPKPARMLTVKMLLLMNFGGFCAILLLCQFLVKGATRAKIIGGICVGFSVCVFAAPLSIIRTVIKTRSVEYMPFSLSLTLTISAVIWLLYGLALKDIYVAFPNVLGFALGALQMILYVVYKYCKTSPHLGEKEVEAAKLPEVSLDMLKLGTVSSPEPISVVRQANKCTCGNDRRAEIEDGQTPKHGKQSSSAAAT(SEQ IDNO.1)

SWEET12氨基酸序列：

MALFDTHNTWAFVFGLLGNLISFAVFLSPVPTFYRICKKKTTEGFQSIPYVVALFSAMLWLYYATQKKDVFLLVTINSFGCFIETIYISIFVAFASKKARMLTVKLLLLMNFGGFCLILLLCQFLAKGTTRAKIIGGICVGFSVCVFAAPLSIIRTVIKTKSVEYMPFSLSLTLTISAVIWLLYGLALKDIYVAFPNVIGFVLGALQMILYVVYKYCKTPSDLVEKELEAAKLPEVSIDMVKLGTLTSPEPVAITVVRSVNTCNCNDRNAEIENGQGVRNSAATT(SEQ IDNO.2)

在一优选实施方式中，所述SWEET蛋白来源于水稻，氨基酸序列如SEQ ID NO.:3－6中任一所示。

水稻OsSWEET11:

MAGGFLSMANPAVTLSGVAGNIISFLVFLAPVATFLQVYKKKSTGGYSSVPYVVALFSSVLWIFYALVKTNSRPLLTINAFGCGVEAAYIVLYLVYAPRRARLRTLAFFLLLDVAAFALIVVTTLYLVPKPHQVKFLGSVCLAFSMAVFVAPLSIIFKVIKTKSVEFMPIGLSVCLTLSAVAWFCYGLFTKDPYVMYPNVGGFFFSCVQMGLYFWYRKPRNTAVLPTTSDSMSPISAAAAATQRVIELPAGTHAFTILSVSPIPILGVHKVEVVAAEQAADGVAAAAAADKELLQNKPEVIEITAAV(SEQ ID NO.3)

OsSWEET13:

MAGLSLQHPWAFAFGLLGNLISFTTYLAPIPTFYRIYKSKSTEGFQSVPYVVALFSAMLWIFYALIKSNEALLITINAAGCVIETIYIVMYLAYAPKKAKVFTTKILLLLNVGVFGVILLLTLLLSHGEQRVVSLGWVCVAFSVSVFVAPLSIIKRVIQSRSVEYMPFSLSLTLTLSAVVWFLYGLLIKDKYVALPNILGFTFGVVQMGLYVFYMNATPVAGEGKEGKGKLAAAEELPVVVNVGKLAAATPDRSTGAVHVHPVPRSCAAEAAAAEPEVLVDIPPPPPPRAVEVAAV(SEQ ID NO.4)

OsSWEET14:

MAGLSLQHPWAFAFGLLGNLISFTTYLAPIPTFYRIYKSKSTEGFQSVPYVVALFSAMLWIFYALIKSNEALLITINAAGCVIETIYIVMYLAYAPKKAKVFTTKILLLLNVGVFGVILLLTLLLSHGEQRVVSLGWVCVAFSVSVFVAPLSIIKRVIQSRSVEYMPFSLSLTLTLSAVVWFLYGLLIKDKYVALPNILGFTFGVVQMGLYVFYMNATPVAGEGKEGKGKLAAAEELPVVVNVGKLAAATPDRSTGAVHVHPVPRSCAAEAAAAEPEVLVDIPPPPPPRAVEVAAV(SEQ ID NO.5)

OsSWEET15:

MAFMSMERSTWAFTFGILGNLISLMVFLSPLPTFYRVYRKKSTEGFQSTPYVVTLFSCMLWMYYAFVKSGAELLVTINGVGCVIETVYLAMYLAYAPKSARMLTAKMLLGLNIGLFGVIALVTLLLSRGELRVHVLGWICVAVSLSVFAAPLSIIRLVIRTKSVEFMPFSLSFFLVLSAVIWFLYGLLKKDVFVALPNVLGFVFGVAQMALYMAYRSKKPLVASSSSAVVAAGLEIKLPEHVKEVQAVAKGAVAAAPEGRISCGAEVHPIDDVMPSEVVEVKVDDEETNRTDEMAGDGDHAMVRTEQIIKPDMAIVVEV(SEQ ID NO.6)

在一优选实施方式中，所述SWEET蛋白来源于玉米，氨基酸序列如SEQ ID NO.:7－9中任一所示。

ZmSWEET13a:

MAGMSLQHPWAFAFGLLGNVISFMTFLAPIPTFYRIYKSKSTEGFQSVPYVVALFSAMLWIFYALIKSNETFLITINAAGCVIETIYVVMYFVYAPKKAKLFTAKIMVLLNGGVFGVILLLTLLLFKGSKRVVLLGWICVGFSVSVFVAPLSIMRRVIQTKSVEYMPFSLSLSLTLSAVVWFLYGLLIKDKYVALPNILGFTFGVVQMVLYVLYMNKTPVAATAEGKDAGKLSSAADEHVLVNIAKLSPALPERSSGVHPVTQMAGVPVRSCAAEATAPAMLPNRDVVDVFVSRHSPAVHVA(SEQ ID NO.:7)

ZmSWEET13b:

MAGLSLEHPWAFAFGLLGNVISFMTFLAPIPTFYRIYKSKSTEGFQSVPYVVALFSAMLWIFYALIKSNETFLITINAAGCVIETIYIVMYFVYAPKKAKLFTAKIMALLNGGVFGVILLLTLLLFKGSKRVVLLGWICVGFSVSVFVAPLSIMRRVIQTKSVEYMPFSLSLSLTLSAVVWFLYGLLIKDKYVALPNVLGFIFGVVQMVLYVFYMNKTPVAAAVGKDAGKLPSAADEHVLVNIAKLNPALPERTSGMHPVTQMAAVPARSCAAEAIAPAMLPNRDVVDVFVSRHSPAVHVV(SEQ ID NO.:8)

ZmSWEET13c:

MAGLSLQHPWAFTFGLLGNVISFMTFLAPIPTFYRIYKSKSTEGFQSVPYVVALFSAMLWIFYALIKSNETFLITINAAGCVIETVYVVMYFVYATKKGRMFTAKIMLLLNVGAFGAILLLTLLLFKGDKRVVMLGWICVGFSVSVFVAPLSIMRRVIQTKSVEYMPFSLSLSLTLSAVVWFLYGLLIKDKYVALPNILGFTFGVVQMVLYVVYMNKTPLPVADGKAAGKLPSAADEHVVVNVTKLSPGRLPPVTQMAAVPTKSCATEAAAPATLPSRDVVDVLVNRHSPAVHVT(SEQ ID NO.:9)

在一优选实施方式中，所述SWEET蛋白来源于玉米，氨基酸序列如SEQ ID NO.:10-13中任一所示。

GmSWEET10a:

MPTHHASAAIFGIIGNMISVMVYLAPVPTFYQIYKKKCTDGFHSLPYLLSLMSSMLWLYYAFLKIHDGVVPLITINSIGCVIELIYILTYIKYAHKDARNLTYTLFAAMNIAFLTLVLSSHFALHGSHRVKVIGWICDAVSLSVFASPLSIMAKVIRTKSVQFMPFYLSFFLTLNAITWFVYGLSIQDKCIYVPNVGGFGLGLVQMVLYGIYRNGGESEKEQALAEGAINIVVVNPLGPAEVFNRRGSG(SEQ ID NO.:10)

GmSWEET10b:

MGSHNALAATFGILGNIISVMVYLAPVPTFYRIYKKKCTDGFHSLPYLLSLMSSMLWLYYAFLKIHDGVVPLITINSIGCVIELIYILTYIKYAHKDARNLTYTLFAAMNIGFLALVLSSRFALNGSHRVKVIGWICDAVSLSVFASPLSIMAKVIRTKSVQFMPFYLSFFLTLNAITWFVYGLSMQDKCIYIPNVGGFALGLVQMVLYGIYRKGSESEKEQGLGEGVINIVVVNPLGPAEVFPIAVDDNKVKDLVVVDDVTVSQQEKEKNVEAKDDCPV(SEQ ID NO.:11)

GmSWEET15a:

MAIFNGHNHLALGFGMLGNVISFMVYLAPLPTFYRIYKKKSTEGFQSLPYLVALFSSMLWLYYASLKPADATLLITINSLGCVIEIVYIIMFTIYATKDARNLTVKLFMVMNVGSFALIFLVTYFAMHGSLRVQVVGWVCVSIAVGVFAAPLSIVAQVIRTKNVEFMPFNLSLFLTISAVMWFFYGLLLKDICIAIPNILGFTLGLLQMLLYAIYRNGKTNNKEVVTKEEHALEAMKNVVVVNPLGTCEVYPVIGKEINNNGQGIEGAEEKEKGVELGKECPV(SEQ ID NO.:12)

GmSWEET15b:

MALNSHNHLALAFGMLGNVISFMVYLAPLPTFYRIYKKKSTEGFQSLPYLVALFSSMLWLYYASLKPADATLLITINSLGCVIEIVYIVMFTIYATKDARNLTVKLFMVMNVGSFALIFLVTYFAIHGSLRVQVVGWVCVSIAVGVFAAPLSIVAQVIRTKNVEFMPFNLSLFLTLSAVMWFFYGLLLKDICIAIPNILGFTLGLLQMLLYAIYRNGKTNNKEVATKEEKALEAIMKNVVVVNPLGTCEVYPVINKENNNGQGIEGAKEKECPV(SEQ ID NO.:13)

在本发明中，同时促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平，可显著(a)增强植物光合产物的转运和抗逆性；和/或(b)提高产量。

表达载体

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产本发明所述的蛋白或其变异体。一般来说有以下步骤：

(1).用编码本发明蛋白或其变异体的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

在本发明中，编码蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如水稻细胞)。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明所述的蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

增强植物光合产物的转运

在本发明中，还提供了一种增强植物光合产物的转运的方法，具体地，给所述植物施用磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂或本发明第二方面所述的组合物；或促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平；其中所述磷酸化的SWEET蛋白包括SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化，从而增强植物光合产物的转运。在本发明中，光合产物主要包括糖类物质，比如，蔗糖、葡萄糖等。由于糖类是光合作用的主要产物，其中蔗糖是光合产物运输的主要运输形式，因此本发明以蔗糖为例，进行详细说明。

增强植物抗逆性

在本发明中，还提供了一种增强植物抗逆性的方法，具体地，给所述植物施用磷酸化的SWEET蛋白或其促进剂或本发明第二方面所述的组合物；或促进植物中SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化水平；其中所述磷酸化的SWEET蛋白包括SWEET蛋白的237和248位点的磷酸化，从而增强植物抗逆性，如抗旱性、抗寒和抗盐碱等。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，同时促进植物中SWEET蛋白的S237和S248位点的磷酸化水平，可显著提高植物的抗逆性。

(2)本发明首次发现，同时促进植物中SWEET蛋白的S237和S248位点的磷酸化水平，还可促进糖转运、促进根的生长。

(3)本发明首次在SWEET11/12中鉴定了两个保守的丝氨酸残基，它们在干旱胁迫下被SnRK2s磷酸化。SWEET11/12的磷酸化增强了蔗糖转运并改善了根的生长。表达模拟磷酸化SWEET11或SWEET12的转基因植物在水分充足或干旱的土壤中均表现出更宽广和更庞大的根系，并增强了植物抗旱性而没有造成植物生长的补偿性损失。

(4)本发明首次证明了在干旱胁迫下，ABA激活的SnRK2s磷酸化蔗糖转运蛋白SWEET11和12的两个位点：Ser237和Ser248，增强了SWEET的蔗糖转运活性，从而增强了蔗糖由地上部分向根的长距离转运，这对于在干旱胁迫下建立强大的根系至关重要。在表达模拟SWEETs磷酸化的转基因植物中，模拟了磷酸化组成性促进了蔗糖向根的转运，从而增强了的根生长而没有损害地上部分植物的生长。我们的研究为在作物中通过强根性状和调控源库转运，以提高抗逆性而不影响生长的遗传操作提供了理论基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

通用方法

实验材料：

拟南芥野生型Col-0、sweet11/12突变体(Salk_073269和Salk_031696T-DNA插入突变体)、snrk2.2/3/6突变体和pyl十二重突变体。构建SWEETpro::SWEETs(WT/S2A/S2D/S2E)-HA转基因植株：将AtSWEET11(一个3137bp的启动子和整个无终止密码子1847bp编码区)，以及AtSWEET12(启动子长度2345bp，无终止密码子编码区长度1858bp)的基因组序列克隆到Gateway供体载体pENTR(Invitrogen)中，经测序确认后，利用Gateway LR Clonase(Invitrogen)转入目的载体pGWB513。结果经测序确认，并用农杆菌介导的转化方法转化sweet11/12突变体。对转基因苗进行潮霉素抗性筛选，然后用抗HA抗体(Abcam)进行western blot检测。

植物生长条件：

植物被种在长日照温室下(16小时光照,22℃/8小时黑暗,20℃)。对用于测糖的植物，5-day-old幼苗从培养皿上转移到水培体系中，短日照条件下(8h光照/16h黑暗)生长两周,然后，从光照期开始，用100μM ABA、200mM甘露醇或5％PEG处理8h。或用20μM ABA、100mM甘露醇和2.5％PEG处理7天，测定其干重。

拟南芥可溶性糖的提取：

收集样品，在液氮中快速磨碎，与1.4mL 100％甲醇混合，70℃加热10分钟，14000g离心3分钟。上清与1mL氯仿和1.4mL ddH

拟南芥韧皮部分泌物的提取：

韧皮部分泌物中蔗糖含量测定采用EDTA促进渗出法收集韧皮部分泌物。对于ABA处理，在光周期开始时，对4周龄的植株叶片喷施100μM ABA，处理8小时后在指定的时间点采集样品。对于甘露醇处理，20日龄的水培植株在光周期开始时在根系上施加200mM甘露醇处理，处理8h后采集样品。

拟南芥原生质体蔗糖转运活性实验：

用10μg所示质粒转染原生质体15分钟。转染后，原生质体在1ml W5溶液(0.2M甘露醇，20mM MES,20mM KCl,0.2M CaCl

酵母双杂交实验：

将SnRK2s的ORF克隆到pGADT7载体上，将SWEET11和SWEET12的C端克隆到pGBKT7载体上。采用LiAc/PEG法将载体化为Y2H Gold菌株。在缺乏亮氨酸和色氨酸(-L-W)的SD培养基上筛选酵母菌菌落，然后转入缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸(-L-W-H)并含1mM 3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)和5mM X-α-Gal的SD培养基。在28℃孵育3天。使用NMY51酵母株(DUALsystems Biotech)分析全长SWEETs和SnRK2s之间的相互作用。将全长的SWEETs和SnRK2s分别克隆到pBT3-SUC和pPR3-N上。酵母转化,在缺乏Leu和Trp(-L-W)的SD培养基上筛酵母菌菌落，在缺乏Leu、Trp、His和Ade(-L-W-H-A)的SD培养基上进行分析。在28℃孵育2天后拍照。

生物分子荧光互补实验：

利用pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit(TransGene)和pEarlygate-n/cLUC技术，扩增了SWEETs和SnRK2s的编码序列，并将其克隆到植物表达载体pHBT95(BamHI和PstI酶切)中。Split-LUC互补试验通过拟南芥原生质体的瞬时表达或农杆菌介导转化在烟草叶片中进行。转化2天后，用CCD相机(Tanon)检测荧光素酶活性。在BiFC检测中，将这些SWEETs和SnRK2s全长编码序列克隆到pCAMBIA1300S-YC和pCAMBIA1300S-YN中，构建cYFP-SWEETs和nYFP-SnRK2s载体，并转化到烟草叶片中。将转化后的植物置于黑暗中培养48h，用FV1000共聚焦激光扫描显微镜(OLYMPUS)观察BiFC荧光信号。

体外磷酸化实验：

将重组MBP-SnRK2.6和GST-tag的SWEET11/12在20μL kinase buffer(50mM Tris-HCl,pH 7.0,20mM MgCl

磷酸化抗体的制备和检测：

SWEET磷酸化抗体是由ABclonal克隆技术公司(中国)生产的。以高效液相色谱法纯化的修饰肽C-KLGTVS(S-p)PE和C-MVKLGTLT(S-p)PE为抗原，分别制备了SWEET11和12中Ser248的多克隆磷酸化抗体。磷酸化位点特异性抗体用非特异性抗体吸收的非修饰肽C-KLGTVSSPE和C-MVKLGTLTSPE纯化。总蛋白提取和western blot结果如下:蛋白质的提取液为20mM Tris-HCl,pH 7.6,150mM NaCl,5mM MgCl

干旱实验：

所有种子在4℃条件下暗处理2天后直接播种在土壤中。幼苗出土5天后，每个花盆移植4株大小一致的幼苗。10日龄幼苗暂停浇水21-25天。每天更换花盆的位置以减少生长室内环境变化的影响。

干旱下根构型实验：

为了评估土壤中的根系构型(RSA)，我们先将盆土壤65℃加热7天，直至每个盆中土壤的含水量(％g水/g土壤)相等。所有种子在4℃条件下暗处理2天后直接播种在土壤中。出苗一周后，将单个小苗移栽到一个准备好的大盆中(20厘米见方，17厘米高)，在21℃、8小时光照/20小时光照、16小时黑暗条件下，在土壤中生长30天。在植株生长过程中，每个盆栽的含水量由80％下降到20％。对于水分充足的对照，重复相同的试验，但含水量保持在80％。转移后30天，整个盆用电热锯切成两半。逐步去除切片处的土壤，用尼康D5600相机采集图像。使用Photoshop，将图像上的根标记出来。

实施例1 ABA促进渗透胁迫下根中蔗糖的积累和干旱下根的生长

干旱胁迫是渗透胁迫的一种，受ABA依赖性和非依赖性信号转导的调节。ABA被PYL受体家族感受，然后主要通过三种激酶SnRK2.2/3/6激活下游胁迫应答反应。我们发现干旱胁迫促进了土壤中根系的膨大生长，并造成Col-0野生型植物根冠比的增加，但这种变化在ABA信号突变体，如pyl112458 379101112突变体(pyl)和snrk2.2/3/6突变体(snrk2)中丧失(图1a)。甘露醇(模拟渗透胁迫)、聚乙二醇(模拟干旱胁迫)或ABA处理导致野生型植物生物量的根冠比的增加，但ABA信号突变体的根冠比没有增加(图1b)。综上所述，这些结果表明ABA在干旱胁迫下根系生长中起着至关重要的作用。由于植物根的生长依赖于从地上部分转移过来的光合同化物，因此我们测定了地上部分和根的糖含量。结果表明，在甘露醇、聚乙二醇和ABA处理下，野生型根中的蔗糖水平显著升高，地上部分蔗糖水平显著下降，而ABA信号突变体的蔗糖含量根冠比没有明显变化(图1c)，这表明渗透胁迫和ABA促进了蔗糖从地上部分向根的运输。

实施例2渗透胁迫下蔗糖转运蛋白促进蔗糖向根的转运

在植物体内，SWEET11和SWEET12是控制蔗糖韧皮部转运的第一个关键步骤的重要的转运蛋白。为了确定渗透胁迫下根的生长是否与蔗糖向根的转运有关，我们观察了干旱下sweet11/12双突变体的根生长。sweet11/12双突变体表现出与干旱条件下ABA信号突变体相似的根生长缺陷(图1a)。而且，sweet11/12双突变体在渗透胁迫或ABA处理下，蔗糖和干重的根冠比没有明显增加(图1b-c)。而在干旱条件下，表达野生型SWEET11或SWEET12的转基因植物部分回补了sweet11/12双突变体的根生长缺陷(图1a)。在渗透胁迫或ABA处理下，转基因植物蔗糖和干重的根冠比增加(图1b-c)。而且，ABA处理后，在野生型莲座叶的韧皮部分泌物中检测到明显更高水平的蔗糖，但在sweet11/12双突变体中没有检测到(图1d)。综上所述，这些结果表明SWEET11和SWEET12参与渗透胁迫下蔗糖转运和根系生长。由于ABA信号突变体和蔗糖转运蛋白的突变体在渗透胁迫下有相似的表型，我们检测了ABA是否调控蔗糖转运活性。我们在拟南芥原生质体中分析了SWEET的蔗糖转运活性。结果表明，在过表达SWEET11或12的原生质体中蔗糖积累增加，而ABA处理进一步增加了原生质体中的蔗糖积累(图1e)，这表明ABA促进蔗糖转运。此外，在ABA信号突变体snrk2.2/3/6的原生质体中，ABA促进蔗糖转运减少(图1f)，这表明ABA以SnRK2依赖的方式增强了SWEET11和SWEET12的转运活性。

实施例3 SWEET 11和SWEET 12被ABA依赖的SnRK2s磷酸化

为了检验SWEET11/12是否被SnRK2s直接调控，我们首先检测了它们之间的相互作用。我们利用酵母双杂交、分子荧光互补(BiFC)等实验证实了SWEET11/12和SnRK2.2/3/6之间的相互作用(图2a-c)。酵母双杂交(Y2H)分析也证实了SWEET11和SWEET12的C末端与SnRK2s相互作用(图2d)。因此，我们认为，SWEET11和SWEET12至少通过其C末端胞质区域与SnRK2.2、2.3和2.6发生相互作用。ABA激活的SnRK2.2/3/6通过磷酸化多种底物来控制下游反应。我们预测SWEET11和12可能是SnRK2s的直接底物。体外激酶实验显示，SnRK2.2/3/6可以磷酸化SWEET C末端，并且SnRK2.6在两个位点磷酸化SWEET11和SWEET12的C末端胞质片段:Ser237和Ser248(图3a-c)。Ser237和Ser248的双突变消除了SnRK2.6介导的SWEETs磷酸化。为了在体内检测SnRK2s对SWEETs的磷酸化，我们制备了识别SWEET11和SWEET12 Ser248磷酸化的特异抗体。在野生型中，ABA、甘露醇和干旱处理诱导Ser248在SWEET11和12上的磷酸化，而在snrk2.2/3/6或pyl突变体中没有检测到磷酸化(图3d)。Ser248的磷酸化在用λ-蛋白磷酸酶(λ-PPase)处理后下降(图3d)。总之，这些结果证明SnRK2s在渗透胁迫下磷酸化SWEET蔗糖转运蛋白。

实施例4 SWEEET磷酸化增强了渗透胁迫下蔗糖转运

我们猜测SWEET11和SWEET12的磷酸化可能与其蔗糖转运活性有关。为了验证这一假设，我们在sweet11/12突变体的原生质体中检测表达模拟磷酸化和模拟非磷酸化突变的SWEET蛋白的蔗糖转运活性(图4a)。在没有ABA的情况下，表达模拟磷酸化SWEET的原生质体中的蔗糖水平显著增加。相反，无论有无ABA，模拟非磷酸化SWEET的表达都会降低蔗糖转运。因此，ABA增强的蔗糖转运受SWEET11和12的磷酸化调控。为了研究在渗透胁迫下SWEET磷酸化是否影响植物体内的糖转运，我们在sweet11/12背景下构建了表达野生型SWEET、S2A或S2D/E的转基因植物并检测了它们叶片韧皮部分泌物以及地上部分和根中的蔗糖水平(图4b-c)。在野生型转基因植物中，渗透胁迫和ABA强烈诱导韧皮部分泌物和根中蔗糖水平的升高，但在S2A转基因植物中没有诱导。而且，韧皮部分泌物和根中的蔗糖水平在S2D/E转基因植物中持续升高。这些结果表明，在渗透胁迫下，SWEET磷酸化在很大程度上促进了蔗糖从地上部分向根的转运。

实施例5 SWEET磷酸化促进了干旱下根的生长并提高了植物抗旱性

我们接着检测了转基因植物的根系大小和结构。表达野生型或模拟磷酸化突变SWEET的转基因植物部分回补了sweet11/12的根生长缺陷。相反，模拟非磷酸化突变体的表达不能恢复sweet11/12的根生长缺陷(图5a)。此外，在水分充足的条件下，模拟磷酸化突变SWEET的转基因植物表现出更宽广的根系(图5a)。这些结果表明在渗透胁迫下SWEET的磷酸化控制了根的生长。此外我们也在水培条件下证实了在渗透胁迫下SWEET磷酸化对根生长的贡献(图5b)。在模拟磷酸化突变SWEET的转基因植物中，根干重组成型地升高，而模拟非磷酸化突变体的表达不能回补sweet11/12突变体的根生长缺陷。引人注目的是，模拟磷酸化突变SWEET的转基因植物中，根生长的改善并没有损害地上部分的生长(图5c)。这种特性可能保证植物生殖组织的生长，并使产量损失最小化，甚至可能在胁迫条件下导致产量的增加。当植物在干旱胁迫时，sweet11/12与野生型相比表现出低的抗旱性(图5d-e)，这可能是sweet11/12突变体的根生长缺陷的结果。而模拟磷酸化突变SWEET的转基因植物表现出对干旱胁迫增强的抗性(图5d-e)。综上所述，这些结果表明SnRK2介导的SWEET磷酸化对于干旱下根的生长和抗旱性是必需的。

结论

我们证明了在干旱胁迫下，ABA激活的SnRK2s磷酸化蔗糖转运蛋白SWEET11和12的两个位点：Ser237和Ser248，增强了SWEET的蔗糖转运活性，从而增强了蔗糖由地上部分向根的长距离转运，这对于在干旱胁迫下建立强大的根系至关重要。在表达模拟SWEETs磷酸化的转基因植物中，模拟了磷酸化组成性促进了蔗糖向根的转运，从而增强了的根生长而没有损害地上部分植物的生长。我们的研究为在作物中通过强根性状和调控源库转运，以提高抗逆性而不影响生长的遗传操作提供了理论基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> SWEET糖转运蛋白磷酸化增强植物光合产物的转运和抗逆性

<130> P2021-1626

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 289

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

Phe Tyr Arg Ile Trp Lys Lys Lys Thr Thr Glu Gly Phe Gln Ser Ile

35 40 45

Pro Tyr Val Val Ala Leu Phe Ser Ala Thr Leu Trp Leu Tyr Tyr Ala

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Gly Gly Phe Cys Ala Ile Leu Leu Leu Cys Gln Phe Leu Val Lys Gly

115 120 125

Ala Thr Arg Ala Lys Ile Ile Gly Gly Ile Cys Val Gly Phe Ser Val

130 135 140

Cys Val Phe Ala Ala Pro Leu Ser Ile Ile Arg Thr Val Ile Lys Thr

145 150 155 160

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165 170 175

Ser Ala Val Ile Trp Leu Leu Tyr Gly Leu Ala Leu Lys Asp Ile Tyr

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Val Ala Phe Pro Asn Val Leu Gly Phe Ala Leu Gly Ala Leu Gln Met

195 200 205

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210 215 220

Glu Lys Glu Val Glu Ala Ala Lys Leu Pro Glu Val Ser Leu Asp Met

225 230 235 240

Leu Lys Leu Gly Thr Val Ser Ser Pro Glu Pro Ile Ser Val Val Arg

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Thr

<210> 2

<211> 285

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

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<210> 3

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<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

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<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

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<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

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Pro Tyr Val Val Ala Leu Phe Ser Ala Met Leu Trp Ile Phe Tyr Ala

50 55 60

Leu Ile Lys Ser Asn Glu Ala Leu Leu Ile Thr Ile Asn Ala Ala Gly

65 70 75 80

Cys Val Ile Glu Thr Ile Tyr Ile Val Met Tyr Leu Ala Tyr Ala Pro

85 90 95

Lys Lys Ala Lys Val Phe Thr Thr Lys Ile Leu Leu Leu Leu Asn Val

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Gly Val Phe Gly Val Ile Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ser His Gly

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Glu Gln Arg Val Val Ser Leu Gly Trp Val Cys Val Ala Phe Ser Val

130 135 140

Ser Val Phe Val Ala Pro Leu Ser Ile Ile Lys Arg Val Ile Gln Ser

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Arg Ser Val Glu Tyr Met Pro Phe Ser Leu Ser Leu Thr Leu Thr Leu

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Ser Ala Val Val Trp Phe Leu Tyr Gly Leu Leu Ile Lys Asp Lys Tyr

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210 215 220

Lys Glu Gly Lys Gly Lys Leu Ala Ala Ala Glu Glu Leu Pro Val Val

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Val Asn Val Gly Lys Leu Ala Ala Ala Thr Pro Asp Arg Ser Thr Gly

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Ala Val His Val His Pro Val Pro Arg Ser Cys Ala Ala Glu Ala Ala

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<213> 水稻(Oryza sativa)

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35 40 45

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115 120 125

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130 135 140

Leu Ser Val Phe Ala Ala Pro Leu Ser Ile Ile Arg Leu Val Ile Arg

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Leu Ser Ala Val Ile Trp Phe Leu Tyr Gly Leu Leu Lys Lys Asp Val

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210 215 220

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275 280 285

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<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

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<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 8

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Gly Val Phe Gly Val Ile Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu Phe Lys Gly

115 120 125

Ser Lys Arg Val Val Leu Leu Gly Trp Ile Cys Val Gly Phe Ser Val

130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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<211> 295

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 9

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Leu Gly Asn Val Ile Ser Phe Met Thr Phe Leu Ala Pro Ile Pro Thr

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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180 185 190

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195 200 205

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Gly Lys Ala Ala Gly Lys Leu Pro Ser Ala Ala Asp Glu His Val Val

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

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100 105 110

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 11

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<210> 12

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<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

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180 185 190

Cys Ile Ala Ile Pro Asn Ile Leu Gly Phe Thr Leu Gly Leu Leu Gln

195 200 205

Met Leu Leu Tyr Ala Ile Tyr Arg Asn Gly Lys Thr Asn Asn Lys Glu

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225 230 235 240

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245 250 255

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Lys Gly Val Glu Leu Gly Lys Glu Cys Pro Val

275 280

<210> 13

<211> 274

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 13

Met Ala Leu Asn Ser His Asn His Leu Ala Leu Ala Phe Gly Met Leu

1 5 10 15

Gly Asn Val Ile Ser Phe Met Val Tyr Leu Ala Pro Leu Pro Thr Phe

20 25 30

Tyr Arg Ile Tyr Lys Lys Lys Ser Thr Glu Gly Phe Gln Ser Leu Pro

35 40 45

Tyr Leu Val Ala Leu Phe Ser Ser Met Leu Trp Leu Tyr Tyr Ala Ser

50 55 60

Leu Lys Pro Ala Asp Ala Thr Leu Leu Ile Thr Ile Asn Ser Leu Gly

65 70 75 80

Cys Val Ile Glu Ile Val Tyr Ile Val Met Phe Thr Ile Tyr Ala Thr

85 90 95

Lys Asp Ala Arg Asn Leu Thr Val Lys Leu Phe Met Val Met Asn Val

100 105 110

Gly Ser Phe Ala Leu Ile Phe Leu Val Thr Tyr Phe Ala Ile His Gly

115 120 125

Ser Leu Arg Val Gln Val Val Gly Trp Val Cys Val Ser Ile Ala Val

130 135 140

Gly Val Phe Ala Ala Pro Leu Ser Ile Val Ala Gln Val Ile Arg Thr

145 150 155 160

Lys Asn Val Glu Phe Met Pro Phe Asn Leu Ser Leu Phe Leu Thr Leu

165 170 175

Ser Ala Val Met Trp Phe Phe Tyr Gly Leu Leu Leu Lys Asp Ile Cys

180 185 190

Ile Ala Ile Pro Asn Ile Leu Gly Phe Thr Leu Gly Leu Leu Gln Met

195 200 205

Leu Leu Tyr Ala Ile Tyr Arg Asn Gly Lys Thr Asn Asn Lys Glu Val

210 215 220

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225 230 235 240

Val Val Asn Pro Leu Gly Thr Cys Glu Val Tyr Pro Val Ile Asn Lys

245 250 255

Glu Asn Asn Asn Gly Gln Gly Ile Glu Gly Ala Lys Glu Lys Glu Cys

260 265 270

Pro Val