基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及植株的倍性鉴定

摘要

本发明提供了一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，包括如下步骤：取杂交一代辣椒品种，在盛花期选取单核靠边期的花蕾，装入自封袋中；花蕾消毒；将花蕾置于无菌滤纸上，吸干表面水分后剥开花蕾，取花药；将花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6个花粉粒；放入32～35℃培养箱中暗培养2～5d后，置于25℃、光照强度2000～2500lx、光照时间16h/d的培养室培养；转入生根培养基；待根部发育完全，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。本发明设计了一种经胚状体途径诱导产生单倍体植株的方法，其步骤简单、实用，用时短，效率高，全程需要12周时间，大大提高了获得单倍体材料的进程。

说明书

技术领域

本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及再生植株的倍性鉴定方法。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L)在我国广泛种植，是我国的第二大蔬菜栽培作物，在我国农业生产中占有重要地位。辣椒的营养价值很高，其果皮中含有丰富的蛋白质、维生素C、胡萝卜素以及钙、铁维等物质，其中维生素C的含量位居蔬菜之首，并且其食用烹任的方式多种多样，深受人们的喜爱。

辣椒属异花授粉作物，天然杂交率高，通过自交分离选育纯系一般需进行4～6代选择才能获得，不仅时间长，而且基因之间存在显隐性关系，因此很难选育出综合性状优良、具有突出优点且配合力强、适宜作为强优势亲本的品系。

单倍体育种作为一种新的育种途径，通过培育单倍体，然后对单倍体材料进行加倍，在较短时间内便可以选育出适宜作为强优势亲本的纯系，同时由于不存在基因间的显隐性作用，因此一些由隐性基因决定的性状便可以得到充分利用，这样既能大大缩短了育种年限，又能丰富所选优良品系的遗传基础，这样的品系易于实现亲本的选配。花药培养属于种质资源创制的重要辅助育种技术，不仅能缩短常规杂交育种所需的年限，提高选种效率，还能充分表现各种配子组合的基因型类型，在育种和机理研究中均具有很大潜力。应用花药培养技术可迅速得到纯合的双单倍体，大大加速育种进程；从开始培养到获得完全纯合DH系一般只需1～2年时间。

尽管花药培养在辣椒上开始较早，但其技术还不够成熟和完善。辣椒花药培养一般采用脱分化、再分化等愈伤组织诱导途径及生根壮苗等培养程序，步骤烦琐，诱导率低，再生成苗率低。经胚状体途径诱导产生单倍体植株的研究少有报道，并且从胚状体诱导产生单倍体植株的频率也并不乐观。因为许多胚状体不能正常的生长发育，或只产生根而不分化芽，成苗率低。

据此，目前迫切需要对影响辣椒花药培养胚状体诱导成苗因素进行系统性研究，旨在建立简单、高效的辣椒花药培养体系，为单倍体育种实践打下坚实的基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及再生植株的倍性鉴定方法，该方法能够快速、稳定地获得大量单倍体植株。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，包括如下步骤：

(1)选取杂交一代辣椒品种，在盛花期选取处于单核靠边期的花蕾，装入自封袋中置于4℃环境中24～48h；

(2)取出花蕾，经流水冲洗后，置于超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗；

(3)在超净工作台上，将消毒后的花蕾置于无菌滤纸上，待吸干其表面水分后剥开花蕾，取出花药；

(4)将取出的花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6个花粉粒，将三角瓶封口；

(5)接种后随即放入32～35℃的恒温培养箱中暗培养2～5d后，置于温度25℃、光照强度2000～2500lx、光照时间16h/d的培养室进行40～60d培养；

(6)待出苗后转入生根培养基中进行生根处理；待根部发育完全后，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，取蕾时间和选择标准：每天上午8：00以前或下午5：00以后从田间摘取生长健壮无病虫害的植株花蕾，花蕾的形态以“花瓣与花萼等长”或“花瓣露出花萼不超过2mm”为标准；每次从3～5株植株上取蕾，避免植株间差异；每隔3～4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，应用滂酰紫6R染色法鉴定辣椒小孢子发育时期，从中筛选出处于单核靠边期的花蕾。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，将花蕾进行消毒，流水冲洗20min后，在超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗3次，每次5min。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，用灭菌后的镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药；并且过程中，注意避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，诱导培养基的配方为：MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.01～0.08mg/L BR+1～3mg/L TDZ+1～2mg/L AGP，pH5.8。

作为本发明的优选方式之一，所述诱导培养基的制备方法为：首先，在MS培养基中添加3％蔗糖、0.8％琼脂，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至60～70℃；冷却后，将0.01～0.08mg/L的BR、1～3mg/L的TDZ以及1～2mg/L的AGP采用过滤灭菌的方法加入上述冷却后的培养基中；最后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入30～40mL的培养基。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，生根培养基的配方为：1/2MS+30g/蔗糖+8g/L琼脂+2mg/LNAA，pH5.8。

一种辣椒再生植株的倍性鉴定方法，采用该方法对上述获得的辣椒单倍体再生植株进行倍性鉴定，具体方法为：

(1)植物形态学鉴定：

以“叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实”这些外观表型特征为选择标准，对培养的各辣椒再生植株进行初步筛选，获得初步筛选疑似单倍体辣椒；

(2)流式细胞术鉴定：

称量出筛选的初步筛选疑似单倍体辣椒叶片，放置在已经提前预冷的培养皿中；加入解离液，使整个叶片全部浸没在解离液中，使细胞核能充分解离；接着，用单面刀片切成长条状，切碎后吸取培养皿中的解离液，以使叶片中的细胞核进入解离液，再加入解离液进行稀释；最后，将稀释液移置流式细胞试管中，上机测定。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，疑似单倍体辣椒的外观表型特征“叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实”，均相对于二倍体植株的表型而言。

诱导培养基中外源添加物的功效原理：

油菜素内酯(brassinolide，简称BR)是以甾醇类为基本结构的具有生物活性的天然化合物，是一种新型的植物激素，同其他的五大类植物激素(生长素、赤霉素、乙烯、脱落酸和细胞分裂素)一样能够对植物的生长发育起重要的调节控制作用，被誉为“第六大激素”；

塞苯隆TDZ是一种新型的植物生长调节剂，它具有很强的细胞分裂素活性(CTK)，并且它的CTK活性要比一般的CTK高出几十倍甚至是几百倍，打破种子的休眠期，促进种子萌发；促进植物的嫩芽的再生和繁殖，促进愈伤组织的生长，延缓植物的衰老速度等；

阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-proteins，AGPs)是一类含有丰富羟脯氣酸或脯氨酸的结构复杂的糖蛋白，其广泛分布在细胞壁、原生质体和质膜上。在植物的根部、花粉管、花粉以及柱头、花柱等组织中均有表达，AGPs在被子植物营养生长和生殖发育均起着非常重要的作用，阿拉伯半乳聚糖蛋白作为营养培养物可以用来代替子房共培养，以增强配子细胞培养中的胚胎发生；

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)本发明对辣椒花药培养进行了优化，设计了一种经胚状体途径诱导产生单倍体植株的方法，其步骤简单、实用，用时短，效率高，特别适用于辣椒育种工作，所采用的是两种培养基转移一次成苗法，并采用32～35℃高温热激处理2～5d，可以促使花药内离体小孢子完成从活体内配子体发育转向离体下的孢子体发育，然后置于25℃、光照强度2000～2500lx光照时间16h/d的培植株的获得，全程需要12周时间，大大提高了获得单倍体材料的进程；

(2)本发明诱导培养基配方为：MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.01～0.08mg/L BR+1～3mg/L TDZ+1～2mg/L AGP，pH5.8；其中，BR、TDZ和AGP这三类外源物添加物的加入，能进一步提高胚状体诱导率，利于辣椒花药培养胚状体诱导成苗；

(3)在选取处于单核靠边期的花蕾时，本发明通过滂酰紫6R染色来确定辣椒小孢子发育时期；其中，滂酰紫6R是一种非常有效而快速的细胞核染料，其对植物细胞的核仁和染色体以及花粉管染色效果相当好，可以快速辨别辣椒小孢子发育时期。

附图说明

图1为实施例3中小孢子不同发育时期的花蕾形态与花药颜色对比图(图中，a图为不同时期的花蕾，b图为不同时期的花药)；

图2为实施例3中胚状体发育成苗图(图中，a图为薄皮椒苗，b图为牛角椒苗)；

图3为实施例3中辣椒成苗生根过程图(图中，a、b、c图为牛角椒的顺序生根过程)；

图4为实施例3中辣椒单倍体植株图(图中，具体为牛角椒植株)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，包括如下步骤：

(1)确定试材：

取具有综合优良性状的杂交一代薄皮椒与牛角椒作为试验材料。

(2)选取花蕾：

在薄皮椒、牛角椒开花盛期，每天上午8：00以前从田间摘取生长健壮无病虫害的花蕾，花蕾的形态以“花瓣与花萼等长”为标准；每次从3株植株上取蕾，避免植株间差异；每隔3d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态；

应用滂酰紫染色法快速鉴定单核靠边早期花蕾，并选取处于单核靠边期的花蕾作为后续操作对象。

(3)花蕾预处理：

将步骤(2)所选取的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理24h。

(4)花蕾消毒处理：

将花蕾进行消毒，流水冲洗20min后，在超净工作台中用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞杀菌10min，最后用灭菌的超纯水冲洗3次，每次5min。

(5)制备培养基：

诱导培养基：首先，在MS培养基中添加3％蔗糖、0.8％琼脂，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至60℃；冷却后，将0.01mg/L的BR、2mg/L的TDZ以及1mg/L的AGP采用过滤灭菌的方法加入上述冷却后的培养基中；最后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入30mL的培养基。

生根培养基：在1/2MS培养基中添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2mg/LNAA，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min；冷却后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入30mL的培养基。

(6)剥蕾：

在超净工作台上，将消毒后的花蕾置于无菌滤纸上，待吸干其表面水分后用灭菌后的镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药；并且过程中，注意避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。

(7)接种：

将取出的花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种5个花粉粒，将三角瓶封口。

(8)胚状体诱导培养：

接种后随即放入32℃的恒温培养箱中暗培养5d后，置于温度25℃、光照强度2000lx、光照时间16h/d的培养室进行60d诱导培养。

(9)生根培养

待出苗后转入生根培养基中进行生根处理；待根部发育完全后，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。

实施例2

本实施例的一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，包括如下步骤：

(1)确定试材：

取具有综合优良性状的杂交一代薄皮椒与牛角椒作为试验材料。

(2)选取花蕾：

在薄皮椒、牛角椒开花盛期，每天下午5：00以后从田间摘取生长健壮无病虫害的花蕾，花蕾的形态以“花瓣露出花萼不超过2mm”为标准；每次从5株植株上取蕾，避免植株间差异；每隔4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态；

应用滂酰紫染色法快速鉴定单核靠边早期花蕾，并选取处于单核靠边期的花蕾作为后续操作对象。

(3)花蕾预处理：

将步骤(2)所选取的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理48h。

(4)花蕾消毒处理：

将花蕾进行消毒，流水冲洗20min后，在超净工作台中用75％酒精消毒35s，再用0.1％升汞杀菌15min，最后用灭菌的超纯水冲洗3次，每次5min。

(5)制备培养基：

诱导培养基：首先，在MS培养基中添加3％蔗糖、0.8％琼脂，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至70℃；冷却后，将0.08mg/L的BR、3mg/L的TDZ以及1.5mg/L的AGP采用过滤灭菌的方法加入上述冷却后的培养基中；最后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入40mL的培养基。

生根培养基：在1/2MS培养基中添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2mg/LNAA，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min；冷却后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入40mL的培养基。

(6)剥蕾：

在超净工作台上，将消毒后的花蕾置于无菌滤纸上，待吸干其表面水分后用灭菌后的镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药；并且过程中，注意避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。

(7)接种：

将取出的花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种6个花粉粒，将三角瓶封口。

(8)胚状体诱导培养：

接种后随即放入35℃的恒温培养箱中暗培养2d后，置于温度25℃、光照强度2500lx、光照时间16h/d的培养室进行40d诱导培养。

(9)生根培养

待出苗后转入生根培养基中进行生根处理；待根部发育完全后，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。

实施例3

本实施例的一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，包括如下步骤：

(1)确定试材：

取具有综合优良性状的杂交一代薄皮椒与牛角椒作为试验材料。

(2)选取花蕾：

在薄皮椒、牛角椒开花盛期，每天上午8：00以前从田间摘取生长健壮无病虫害的花蕾，花蕾的形态以“花瓣与花萼等长”为标准；每次从4株植株上取蕾，避免植株间差异；每隔3d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态；

应用滂酰紫染色法快速鉴定单核靠边早期花蕾，并选取处于单核靠边期的花蕾作为后续操作对象。不同发育时期的花蕾形态与花药颜色如图1所示。

(3)花蕾预处理：

将步骤(2)所选取的花蕾用自封塑料袋盛装后置于4℃低温冰箱处理36h。

(4)花蕾消毒处理：

将花蕾进行消毒，流水冲洗20min后，在超净工作台中用75％酒精消毒33s，再用0.1％升汞杀菌13min，最后用灭菌的超纯水冲洗3次，每次5min。

(5)制备培养基：

诱导培养基：首先，在MS培养基中添加3％蔗糖、0.8％琼脂，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至65℃；冷却后，将0.04mg/L的BR、1mg/L的TDZ以及2mg/L的AGP采用过滤灭菌的方法加入上述冷却后的培养基中；最后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入35mL的培养基。

生根培养基：在1/2MS培养基中添加30g/L蔗糖、8g/L琼脂、2mg/LNAA，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min；冷却后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入35mL的培养基。

(6)剥蕾：

在超净工作台上，将消毒后的花蕾置于无菌滤纸上，待吸干其表面水分后用灭菌后的镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药；并且过程中，注意避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。

(7)接种：

将取出的花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种6个花粉粒，将三角瓶封口。

(8)胚状体诱导培养：

接种后随即放入33℃的恒温培养箱中暗培养2.5d后，置于温度25℃、光照强度2200lx、光照时间16h/d的培养室进行50d诱导培养，如图2所示。

(9)生根培养

待出苗后转入生根培养基中进行生根处理，如图3所示；待根部发育完全后，开盖练苗，清洗根部培养基，并移入营养钵，得到辣椒单倍体植株，如图4所示。

此外，需要说明的是，上述实施例选取杂交一代辣椒品种薄皮椒、牛角椒作为试验材料，但并不局限于该材料，该方法对于其他优良性状的杂交一代辣椒品种可实现本发明的目的。

上述实施例培养基中所用到的MS培养基与1/2MS培养基的组成成分分别如表1、表2所示。

表1、MS培养基组成成分一览表(g/L)

表2、1/2MS培养基组成成分一览表(g/L)

上述实施例“选取花蕾”步骤对单核靠边早期花蕾进行鉴定的滂酰紫染色法，是一种非常有效而快速的细胞核染色方法，具体操作方法为：

摘取新鲜辣椒花蕾放置卡诺固定液固定24h，固定后，取出需要观察的花蕾样本，将剩余样本洗净放入75％的乙醇中，在4℃下保存备用。

用清水洗净待观测样本，置于滤纸上，用镊子轻轻拨开花蕾，取出1～2个花药放在载玻片上，用移液枪吸取一滴滂酰紫6R染液滴在花药上，再用镊子将花药捣碎，夹出多余的组织，最后盖上盖玻片。再用吸水纸吸取盖玻片周围染液染色10～15min后放置体质显微镜观察。

本发明在两种培养基上完成花药膨大、不同时期胚状体的发育以及再生植株的获得，全程需要12周时间，大大提高了获得单倍体材料的进程。

实施例4

本实施例的一种辣椒再生植株的倍性鉴定方法，采用该方法对上述实施例获得的辣椒单倍体再生植株进行倍性鉴定，具体方法为：

(1)植物形态学鉴定：

以“叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实”(相对于二倍体植株的表型)这些外观表型特征为选择标准，对培养的各辣椒再生植株进行初步筛选，获得初步筛选疑似单倍体辣椒；

(2)流式细胞术鉴定：

称量出筛选的初步筛选疑似单倍体辣椒叶片0.2g，放置在已经提前预冷的培养皿中；加入2mL解离液(20mmol·L

本实施例中，再生植株经细胞学和形态学鉴定确定为小孢子发育的植株，为单倍体植株，通过根尖压片法，此单倍体植株染色体数目为n＝12。单倍体与二倍体相比，表现为叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实。

实施例5

本实施例用以验证不同AGP、BR和TDZ添加浓度对不同品种辣椒胚状体诱导结果的影响：

试验方法：以杂交一代辣椒品种薄皮椒、牛角椒、灯笼椒作为试验材料，参照实施例3方法，设置对照组和实验组。对照组(CK)的诱导培养基配方为“MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0mg/L BR+0mg/L TDZ+0mg/L AGP”；实验组的诱导培养基配方为“MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+不同浓度BR+不同浓度TDZ+不同浓度AGP”；其中，不同浓度BR取0.01、0.04、0.08mg/L；不同浓度TDZ取1、2、3mg/L，不同浓度AGP取1、1.5、2mg/L。分别统计并计算对照组与不同实验组的胚状体诱导率。

试验结果：结果如表3所示。

表3、不同AGP、BR和TDZ浓度下的不同品种辣椒胚状体诱导结果

注：表3实为正交结果。

由表3结果可知，在诱导培养基中添加一定浓度的AGP、BR和TDZ，对不同品种辣椒胚状体诱导率均产生促进作用，且当AGP、BR和TDZ添加浓度分别为2、0.04、1mg/L时，胚状体诱导结果最好，高达7.67％。据此，本发明设计配置的诱导培养基，能进一步提高胚状体诱导率，帮助胚状体途径诱导产生辣椒单倍体植株辣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。