六六六标准物质及其制备方法和应用和大米六六六标准物质

摘要

本发明涉及农药残留六六六检测领域，具体涉及一种六六六标准物质及其制备方法和应用和大米中农药残留六六六标准物质。该方法包括：将四种不同六六六异构体标准溶液喷洒至谷物中，然后依次对谷物进行干燥、粉碎和混匀，得到所述农药残留六六六基体标准物质。本发明制备的六六六标准物质具有较好的均匀性和长期稳定性，能够在6个月保质期内良好保证样品中六六六检测量值的准确。

说明书

技术领域

本发明涉及六六六检测领域，具体涉及一种六六六标准物质及其制备方法和应用和大米六六六标准物质。

背景技术

粮油食品作为我国粮食安全、食品安全关注的重点，由多部门联合管理。但由于我国幅员辽阔、气象条件复杂多变，生产经营模式地区性差异大，因此粮油食品同样也是食品安全中的重风险食品品类。并且粮油食品易于受到真菌毒素的污染、农药滥用导致的农药残留超标、环境污染导致的重金属超标以及其他因素造成的质量劣变和价值降低，结果往往导致其粮油食品无法进入流通领域，进而导致粮食浪费，影响国家粮食安全和食品安全战略。

持久性有机污染物因为其具有致癌性以及可诱导有机体突变的性质已经成为全球普遍关注的焦点。有机氯类农药是持久性有机污染物中的一个重要分支，在过去的几十年中，有机氯类农药被广泛的应用于农业生产中，并且其施用计量较大，严重污染了水体和土壤。虽然许多国家在20世纪70-80年代已经明确禁止施用有机氯类农药，但是由于其化学结构非常稳定、不易降解，所以其至今还存在于自然环境中，尤其是土壤和淤泥。

我国政府高度重视具有持久性作用的有机氯化合物的消减工作，在1983年停止六六六和滴滴涕的生产后，也逐步加强了有机氯农药的残留监测力度。但由于我国国情比较复杂，所以在一些地区还有滥施滥用的情况存在，所以我国自然界的有机氯农药的残留量还是相对较高的。

有机氯农药中的六氯环己烷(六六六)，是环己烷每个碳原子上的一个氢原子被氯原子取代形成的饱和化合物。其分子式为C

稻谷作为广泛种植的粮食作物，易于受到环境污染影响，造成食品安全风险。准确检测谷物中持久性有机污染物农药残留六六六一直是食品安全、食品质量管理的重点。食品基体标准物质是保障检测数据准确性的重要计量溯源量具，既可以用来校准检测方法、快检仪器，也可以作为实验室质量控制样品，建立内外部质量控制评价系统。

现有市场上食品基体标准物质种类数量稀缺，最重要的原因是食品基体本身保质期短、污染物稳定性差，很难保证特性量值的均匀性、稳定性，以达到国家标准物质的要求。为了实现粮食基体中农药残留六六六的准确测定，需要有均匀、稳定的标准物质，而目前国内外未见相应的标准物质。因此，制备农药残留粮食基体标准物质对仪器状态的监测、检测实验室的质量控制以及检测方法的开发等具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种六六六标准物质和应用及其制备方法和大米六六六标准物质。本发明制备的六六六标准物质具有较好的均匀性和长期稳定性，能够在6个月保质期内良好保证样品中六六六检测量值的准确。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种六六六标准物质的制备方法，该方法包括：将六六六溶液喷洒至谷物中，然后依次对谷物进行干燥、粉碎和混匀，得到所述六六六标准物质。

本发明第二方面提供如上所述的方法制备得到的六六六标准物质。

本发明第三方面提供一种大米六六六标准物质，该标准物质中六六六的含量为30-100μg/kg。

本发明第四方面提供一种如上所述的方法在校准仪器或评价检测方法准确性中的应用。

本发明制备的六六六标准物质具有较好的均匀性和长期稳定性，能够在6个月保质期内良好保证样品中六六六检测量值的准确，因此可以准确应用于仪器状态的监测、实验室质量控制以及检测方法的日常开发分析检测中。

附图说明

图1是α-666标准物质的长期稳定趋势分析图；

图2是β-666标准物质的长期稳定趋势分析图；

图3是γ-666标准物质的长期稳定趋势分析图；

图4是ξ-666标准物质的长期稳定趋势分析图；

图5是α-666标准物质的短期稳定趋势分析图；

图6是β-666标准物质的短期稳定趋势分析图；

图7是γ-666标准物质的短期稳定趋势分析图；

图8是ξ-666标准物质的短期稳定趋势分析图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种六六六标准物质的制备方法，该方法包括：将六六六溶液喷洒至谷物中，然后依次对谷物进行干燥、粉碎和混匀，得到所述六六六标准物质。

根据本发明，能够理解的是，所述六六六为六氯环己烷。本领域的技术人员公知的是，所述六六六包括8种同分异构体，其中四种为α-666、β-666、γ-666和ξ-666。

根据本发明，优选的，所述六六六溶液中的溶剂为甲醇。

根据本发明，优选的，所述六六六溶液的用量使得所述六六六标准物质中六六六的含量为30-100μg/kg(例如，可以为30μg/kg，40μg/kg，50μg/kg，60μg/kg，70μg/kg，80μg/kg，90μg/kg，100μg/kg)。

本发明的发明人在研究中发现，相比于其他六六六，本发明特别适用于α-666、β-666、γ-666和ξ-666标准物质的制备，当所述六六六为α-666、β-666、γ-666和ξ-666时，所制备的六六六标准物质具有更好的量值稳定性和均匀性。

本发明的发明人在研究中发现，相比于其他谷物样品，本发明特别适用于大米中六六六标准物质的制备，当所述谷物为大米时，所制备的六六六标准物质具有更好的量值稳定性和均匀性。

根据本发明，为了进一步提高所制备的六六六标准物质的量值稳定性和均匀性，优选的，所述喷洒的条件还包括：喷雾液滴不大于70μm，边喷洒边对谷物进行搅拌；进一步优选的，所述喷洒在通风条件下进行。

根据本发明，为了进一步提高所制备的六六六标准物质的量值稳定性和均匀性，优选的，所述干燥的条件包括：采用50-70℃(例如，可以为50℃，53℃，55℃，58℃，60℃，63℃，65℃，68℃，70℃)，更优选55-65℃的热风进行吹干，时间为0.5-2h(例如，可以为0.5h，0.8h，1h，1.2h，1.5h，1.8h，2h)，更优选为0.8-1.2h。

根据本发明，优选的，干燥后将物料进行冷却。

根据本发明，为了进一步提高所制备的六六六标准物质的量值稳定性和均匀性，优选的，所述粉碎后所得谷物粉的粒径不大于50μm；进一步优选的，该方法还包括将粉碎后的物料进行过300目的筛子，以确保获得粒径不大于50μm的谷物粉。

其中，所述粉碎可以在常规的粉碎设备中进行。根据本发明一种优选的实施方式，所述粉碎在超细研磨机中进行。

其中，需要说明的是，所述“粉碎后所得谷物粉的粒径不大于50μm”是指大部分的颗粒的粒径不大于50μm，例如，至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。

根据本发明，所述混匀的方法不受特别的限制，为了进一步提高所制备的标准物质的量值稳定性和均匀性，优选的，所述混匀的方法包括：在50-200rpm，优选100-140rpm的条件下连续搅拌0.5-2h，优选为0.8-1.2h。

其中，所述混匀可以在常规的各种设备中进行，优选在卧式搅拌机中进行。

根据本发明，为了进一步提高所制备的标准物质的长期稳定性，优选的，该方法还包括：将混匀后的谷物粉在氩气气氛下进行包装，并避免且密闭保存。例如，在氩气气氛的手套箱中，将所述标准物质包装到棕色玻璃瓶中，并用锡纸塑封瓶口，得到独立包装样品，进行密闭保存，规格可以为50g/瓶。

根据本发明，为了确保所制备的标准物质的均匀性，优选的，该方法还包括：混匀后检测样品的均匀性。

均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。在标准物质的研制(生产)过程中对其进行均匀性评估，可以证明其是否具有良好的均匀性，从而判断其作为标准物质的可靠性。优选的，根据《一级标准物质技术规范》(JJF 1006-1994)和《标准物质定值的通用原则及统计学原理的要求》(JJF 1343-2012)，对标准物质进行均匀性检验。

根据本发明，优选的，该方法还包括：对所述六六六标准物质进行定值。

优选的，所述定值的方法可以采用常规的定值方法。根据JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，针对标准物质定值可采用两种不同原理的方法同时定值，或者采用一种方法多家实验室联合定值的方式。然而，对于基质相对复杂的谷物基质，例如大米粉基质，标准物质难以采用两种不同原理方法同时定值，通常都采用一种准确的测量方法、多家实验室联合定值的方式。因此，优选的，本发明的定值方法为采用一种检测方法并联合多方检测。

优选的，所述检测方法包括：

(1)将所述六六六标准物质加入丙酮-水溶液，经第一振荡后加入氯化钠，混匀，然后加入石油醚并进行第二振荡，静置分层后取有机相；

其中，相对于1g所述六六六标准物质，丙酮-水溶液的用量为2-4ml，更优选为2.5-3.5mL，所述氯化钠的用量为0.1-0.5g，更优选为0.2-0.4g，所述石油醚的用量为0.3-0.9ml，更优选为0.5-0.7ml；

和/或，丙酮-水溶液中丙酮的含量为60-80体积％，更优选为65-75体积％；

优选的，所述石油醚的馏程为30-60℃；

其中，所述第一振荡和第二振荡的时间不受特别的限制，优选的，所述第一振荡和第二振荡的时间各自独立的为20-40min。

(2)取所述有机相，采用干燥剂进行干燥，并采用凝胶渗透色谱或固相萃取进行净化，得到含有六六六的净化液；

其中，所述凝胶渗透色谱的条件包括：洗脱液泵流速为3-7mL/min，更优选为4-6mL/min，洗脱溶液为乙酸乙酯-环己烷溶液，更优选为乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:0.8-1.2的乙酸乙酯-环己烷溶液；

优选的，所述干燥剂选自无水硫酸钠和无水硫酸铜，更优选为无水硫酸钠。

其中，所述固相萃取的条件包括：洗脱溶液为乙腈；

优选的，所述凝胶渗透色谱的条件还包括：取试样溶液3-6mL注入凝胶渗透色谱柱，弃去0-7.5min的流分，收集7.5-15min的流分，在15-20min冲洗凝胶渗透色谱柱，将收集的流分旋蒸浓缩，然后用氮气吹至近干，然后用正己烷定容。

优选的，所述固相萃取的条件还包括：取固相萃取C18 SPE柱用18-22mL乙腈预淋洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即将该柱放至固定架上，下接鸡心瓶，移入2-3mL样品萃取液，并用18-22mL乙腈洗脱C18 SPE柱，收集萃取液及洗脱液，在旋转蒸发器上浓缩至近干，然后用正己烷定容。

(3)采用气相色谱法测定所述净化液中六六六的含量；

其中，所述气相色谱法的条件可以包括：

a)柱温：90℃(1min)

b)进样口温度：280℃；不分流进样，进样量为1μL；

c)检测器为电子捕获检测器，温度为300℃；

d)载气为氮气，流速为1mL/min；尾吹流速为25mL/min；

e)柱前压为0.5MPa。

根据本发明，优选的，采用外标法进行定值，例如，以正己烷为溶剂，分别配制α-666、β-666、γ-666和ξ-666的标准工作溶液，以如上的气相色谱法进行检测(例如，配制的标准工作溶液浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L，由低到高浓度依次进样检测)，然后以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。

根据本发明，可以通过如下的公式进行六六六含量计算。

式中，

X——试样中六六六的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

m

V

f——稀释因子；

V

1000——换算系数；

m——试样的称样量，单位为克(g)。

根据本发明一种特别优选的实施方式，在通风条件下，采用喷雾液滴不大于70μm的高压喷雾器，将六六六溶液喷洒至大米中，边喷洒边搅拌大米，然后采用58-62℃的热风对大米进行吹干，时间为0.9-1.1h。然后将样品进行冷却。冷却后，在超细研磨机中，将大米粉碎至粒径不大于50μm，并过筛。将过筛后的大米粉采用卧式搅拌机在110-130rpm下连续搅拌0.9-1.1h。然后在氩气气氛的手套箱中，将所述大米粉包装到棕色玻璃瓶中，并用锡纸塑封瓶口，进行密闭保存。

第二方面，本发明提供了如上所述的方法制备得到的六六六标准物质。

第三方面，本发明提供了一种大米六六六标准物质，该标准物质中六六六的含量为30-100μg/kg。

第四方面，本发明提供了一种如上所述的方法在校准仪器或评价检测方法准确性中的应用。

能够理解的是，如上所述的方法可以制备出具有较好的稳定性和均匀性的六六六标准物质，因此其中六六六的含量是已知的。因此，采用如上所述的方法制备六六六标准物质，并采用待校准的仪器或待评价准确性的检测方法测定六六六标准物质中的六六六的含量，可以对比测定得到的值和真实值，来判断待校准的仪器是否需要校准，或待评价准确性的检测方法的准确性高低，从而校准仪器或评价检测方法的准确性。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，

超细粉研磨机购自Romer Series II研磨机；

卧式搅拌机购自郑州顺鑫机械有限公司350翻斗摩擦型。

实施例1

用于说明本发明提供的六六六标准物质的制备

六六六标准物质的制备

在通风条件下，采用喷雾液滴不大于70μm的高压喷雾器，将α-666溶液喷洒至大米中，边喷洒边搅拌大米，其中所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量约为60μg/kg；然后采用60℃的热风对大米进行吹干，时间为1h。然后将样品冷却。冷却后，在超细研磨机中，将大米粉碎至粒径不大于50μm，并过300目的筛子。将过筛后的大米粉采用卧式搅拌机在120rpm下连续搅拌1h。然后在氩气气氛的手套箱中，将所述大米粉包装到棕色玻璃瓶中，并用锡纸塑封瓶口，进行密闭保存。

按照同样的方法分别制备β-666、γ-666和ξ-666的标准物质。不同的是，当制备β-666标准物质时，所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量约为40μg/kg；当制备γ-666标准物质时，所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量约为60μg/kg；当制备ξ-666标准物质时，所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量约为50μg/kg。

1、均匀性检验：

在不同位置随机抽取α-666标准物质，获得25个样品，依据JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》均匀性检验要求，依据GB/T 5009.19-2008食品中有机氯农药多组分残留量的测定方法，每个随机抽取的样品再平行取3个子样测定。依据JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》4.3对测试结果进行统计。按照同样的方法对β-666、γ-666和ξ-666进行均匀性检验。数据统计结果见表1。

其中各检测项目均匀性检验的统计量F值均小于F临界值，表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。

表1大米标准物质均匀性检验数据汇总(单位：μg/kg)

α-666正态检验：依据夏皮罗-威尔克法检验数据正态性W＝0.9462W(25，0.95)＝0.918，接受该组数据为正态分布。

α-666可疑数据取舍：

依据Dixon准则

f(0.05,25)＝0.443

数据由小到大排列，r1＝0.1941；rn＝0.2830。较大者为：0.2464

因为：0.2464<0.443，无可疑值。

依据Grubbs准则

λ(0.05,25)＝2.822；均值为：56.94；标准偏差为：1.597，无异常值。

α-666均匀性数据计算：

平均值＝56.94

组间SS＝183.70 组间自由度df＝24 组间MS＝7.654

组内SS＝325.64 组内自由度df＝50 组内MS＝6.613

F0.05(24，50)＝1.74 经计算F＝1.175，因此F值小于临界值表明组间与组内无明显差异，样品均匀。

组间标准偏差sbb＝0.6168 重复性标准偏差sr＝2.552

sbb

β-666正态检验：依据夏皮罗-威尔克法检验数据正态性 W＝0.9842 W(25,0.95)＝0.918，接受该组数据为正态分布。

β-666可疑数据取舍：

依据Dixon准则

f(0.05，25)＝0.443

数据由小到大排列，r1＝0.2022；rn＝0.2830。较大者为：0.2450

因为：0.2450<0.443，无可疑值。

依据Grubbs准则

λ(0.05,25)＝2.822；均值为：38.13；标准偏差为：1.609，无异常值。

β-666均匀性数据计算：

平均值＝38.13

组间SS＝186.46 组间自由度df＝24 组间MS＝7.769

组内SS＝307.31 组内自由度df＝50 组内MS＝6.146

F0.05(24，50)＝1.74 经计算F＝1.264，因此F值小于临界值表明组间与组内无明显差异，样品均匀。

组间标准偏差sbb＝0.7355重复性标准偏差sr＝2.479

sbb

γ-666正态检验：依据夏皮罗-威尔克法检验数据正态性 W＝0.9874 W(25,0.95)＝0.918，接受该组数据为正态分布。

γ-666可疑数据取舍：

依据Dixon准则

f(0.05，25)＝0.443

数据由小到大排列，r1＝0.2864；rn＝0.1269。较大者为：0.2864

因为：0.2864<0.443，无可疑值。

依据Grubbs准则

λ(0.05，25)＝2.822；均值为：56.97；标准偏差为：1.880，无异常值。

γ-666均匀性数据计算：

平均值＝56.97

组间SS＝254.55 组间自由度df＝24 组间MS＝10.606

组内SS＝370.71 组内自由度df＝50 组内MS＝7.414

F0.05(24，50)＝1.74 经计算F＝1.431，因此F值小于临界值表明组间与组内无明显差异，样品均匀。

组间标准偏差sbb＝1.0315重复性标准偏差sr＝2.723

sbb

ξ-666正态检验：依据夏皮罗-威尔克法检验数据正态性W＝0.9577 W(25，0.95)＝0.918，接受该组数据为正态分布。

ξ-666可疑数据取舍：

依据Dixon准则

f(0.05，25)＝0.443

数据由小到大排列，r1＝0.3986；rn＝0.2564。较大者为：0.3984

因为：0.3984<0.443，无可疑值。

依据Grubbs准则

λ(0.05，25)＝2.822；均值为：50.84；标准偏差为：2.1087，无异常值。

ξ-666均匀性数据计算：

平均值＝50.84

组间SS＝320.16 组间自由度df＝24 组间MS＝13.34

组内SS＝559.87 组内自由度df＝50 组内MS＝11.20

F0.05(24，50)＝1.74 经计算F＝1.191，因此F值小于临界值表明组间与组内无明显差异，样品均匀。

组间标准偏差sbb＝0.8451 重复性标准偏差sr＝3.3462

sbb

2、稳定性检验

2.1长期稳定性

根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF1343-2012)的要求，长期稳定性考察按先密后疏原则进行。因此，分别在第0、1、2、4、6个月开展长期稳定性监测研究。每次随机取3个包装单元，每个单元取两个子样测定，测量方法与定值、均匀性检验采用的方法相同。

按照如上方法分别对α-666、β-666、γ-666和ξ-666标准物质进行检验。结果如表2所示。α-666、β-666、γ-666和ξ-666标准物质的长期稳定趋势分析图分别如图1-4所示。

表2大米标准物质长期稳定性数据汇总(单位：μg/kg)

α-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b

截距b

s＝4.084

斜率的标准偏差s(b1)＝0.3461

t分布临界值＝2.05

t*s(b1)＝0.7096

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.3461486*6＝2.077

β-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b

截距b

s＝2.263

斜率的标准偏差s(b1)＝0.1918

t分布临界值＝2.05

t*s(b1)＝0.3933

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.191847*6＝1.151

γ-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b1＝-0.08631

截距b0＝56.62

s＝3.199

斜率的标准偏差s(b1)＝0.2712

t分布临界值＝2.05

t*s(b1)＝0.5559

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.2712*6＝1.627

ξ-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b1＝0.1574

截距b0＝49.94

s＝4.537

斜率的标准偏差s(b1)＝0.3846

t分布临界值＝2.05

t*s(b1)＝0.7884

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.384569*6＝2.307

经以上检验，可以证明α-666、β-666、γ-666和ξ-666标准物质在6个月保质期内具有长期稳定性。

2.2短期稳定性

根据JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》和JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，标准物质短期稳定性评价标准物质在运输过程中特性值受环境温度变化而产生的影响。随机抽取两个包装单元置于60℃温度环境下保存，分别在第0、1、3、5、7天进行稳定性监测，测定方法与长期稳定性监测一致，每个单元平行测定两次，采用趋势分析对监测数据进行统计分析。

按照如上方法分别对α-666、β-666、γ-666和ξ-666标准物质进行检验。结果如表3所示。α-666、β-666、γ-666和ξ-666标准物质的短期稳定趋势分析图分别如图5-8所示。

表3大米标准物质短期稳定性数据汇总(单位：μg/kg)

α-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b

截距b0＝57.47

s＝1.318

斜率的标准偏差s(b1)＝0.1627

t分布临界值＝2.3

t*s(b1)＝0.3742

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.1627019*7＝1.139

β-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b1＝0.3399

截距b0＝36.35

s＝1.314

斜率的标准偏差s(b1)＝0.1622

t分布临界值＝2.3

t*s(b1)＝0.3731

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.1622196*7＝1.136

γ-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b1＝-0.3875

截距b0＝56.65

s＝1.861

斜率的标准偏差s(b1)＝0.2298

t分布临界值＝2.3

t*s(b1)＝0.5285

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.2298028*7＝1.609

ξ-666经计算结果如下：

经夏皮罗-威尔克法检验数据为正态分布

经Grubbs检验无异常值

稳定性检验：趋势分析线性拟合

斜率b1＝-0.006098

截距b0＝50.80

s＝1.879

斜率的标准偏差s(b1)＝0.2320

t分布临界值＝2.3

t*s(b1)＝0.5337

|b1|

不确定度u＝s(b1)*时间间隔＝0.2320375*7＝1.624

经以上检验，可以证明α-666、β-666、γ-666和ξ-666标准物质在运输环境60℃以下，7天内具有短期稳定性。

3标准物质定值

3.1定值方式确定

根据JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，针对标准物质定值可采用两种不同原理的方法同时定值，或者采用一种方法多家实验室联合定值的方式。然而，对于基质相对复杂的大米粉基体标准物质难以采用两种不同原理方法同时定值，通常都采用一种准确的测量方法、多家实验室联合定值的方式。本研究标准物质选择了采用一种准确测量方法8家实验室联合定值的方式。

3.2定值方法确认

定值方法的确定过程中调研文献并参考国际国内现行检测标准，AOAC OfficialMethod970.52Organochlorine and Organophosphorus Pesticide Residues GeneralMultiresidue Method，EPA Method 8081A Organochlorine Pesticides by GasChromatography与我国现行有效的食品安全国家标准GB 5009.19-2008均详细描述了准确测定4种六氯环己烷异构体的测定方法。从方法原理和分析步骤看，我国国家标准与AOAC标准方法基本一致。采用有机溶剂+水的萃取溶液萃取，并经过净化后采用气相色谱ECD检测器测定结果。因此本次研究基于此方法的参数条件进一步进行了实验确认及必要的条件优化，形成标准物质定值方法。

3.3定值方法描述

3.3.1方法原理

样品中的六氯环己烷经有机溶剂提取、凝胶色谱柱层析净化，用毛细管柱气相色谱分离，电子捕获检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。

3.3.2试剂材料

丙酮(CH

3.3.3仪器和设备

气相色谱仪(GC)：配有电子捕获检测器(ECD)；色谱柱：DB-17[30m*0.25mm*0.25μm]；旋转蒸发仪；全自动凝胶色谱净化系统；高速粉碎机；天平:感量0.00001g；涡旋混合器；离心机:转速≥6000r/min；氮吹仪。

3.3.4样品前处理

称取粉碎后的样品20g试样(精确至0.001g)于50mL离心管中,加入20mL水，加丙酮40mL，振荡30min，加氯化钠6g，摇匀。加石油醚30mL，再振荡30min，静置分层后，将有机相全部转移至三角瓶中经无水硫酸钠干燥，量取35mL，浓缩至1mL，凝胶渗透色谱净化，用正己烷定容至1mL，留待GC分析。

3.3.5色谱条件

a)柱温：90℃(1min)

b)进样口温度：280℃；不分流进样，进样量为1μL；

c)检测器为电子捕获检测器，温度为300℃；

d)载气为氮气，流速为1mL/min；尾吹流速为25mL/min；

e)柱前压为0.5MPa。

3.3.6样品测定

外标法配制以正己烷为溶剂的α-666GBW(E)060081，β-666GBW(E)060082，γ-666GBW(E)060083，ξ-666GBW(E)060084标准溶液含量分别s为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标作图，得到标准曲线回归方程。

待测样液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，测定待测溶液浓度。

3.3.7结果计算

试样中六氯环己烷含量计算公式如下：

式中，

X——试样中六六六的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

m

V

f——稀释因子；

V

1000——换算系数；

m——试样的称样量，单位为克(g)。

计算结果保留三位有效数字。

3.4定值方法的优化

3.4.1样品前处理参数的优化

1)样品提取液对提取效率的影响

前处理操作中使用提取液将样品中六氯环己烷萃取至溶液中，其中提取液的配比起到了非常重要的作用，因此本研究分别采用丙酮：水(体积比分别为：2：1；3：2；5：2)、乙酸乙酯：水(体积比分别为：2：1；3：2；5：2)和乙腈：水(体积比分别为：2：1；3：2；5：2)测试样品的回收率，其余条件均与“3.2”中相同。

固体样品粉碎，过20目筛，分别取九只三角瓶。准确称取样品于三角瓶中，加入20mL水振荡30min后，分别加入丙酮(30mL；40mL；50mL)，乙酸乙酯(30mL；40mL；50mL)和乙腈(30mL；40mL；50mL)至九个不同的三角瓶，振荡30min后经石油醚萃取、浓缩、净化后定容，由GC平行测定三次，确定最佳提取溶剂。结果如表4所示。

表4提取液组成优化数据汇总

由于同时检测的农药品种多，差异较大，而且有些农药在大米样品中能与脂类物质结合，不易分离，提取溶剂需渗入组织内部才能得到良好的提取效果，因而对样品的前处理要求较高。乙腈、丙酮和乙酸乙酯均是国内外大型实验室常用的分析农药的提取剂，但实验表明丙酮和乙酸乙酯提取的共萃物中油脂含量较高，采用乙酸乙酯作为提取溶剂，提取液较浑浊，呈微黄色，且颜色较深，不利于净化；采用丙酮和乙腈作为提取溶剂，提取液呈乳白色，颜色较浅，便于进一步净化并检测。经GC－ECD检测后，比较回收率，经计算，丙酮与水的体积比分别为：2：1；3：2；5：2的三种提取方式得到的农药回收率结果，经统计学分析，没有显著差异。综上所述，可以采用丙酮：水的体积比为3：2；2:1；5：2的丙酮-水溶液，以下方法中采用丙酮：水的体积比为2:1的丙酮-水溶液提取溶剂。

2)净化方式的确定

常见的净化方式有固相萃取技术、基质固相分散萃取技术、凝胶渗透色谱净化方式等，不同的净化方式直接影响测试测试回收率。本实验分别采用固相萃取法及凝胶渗透色谱法净化，重复实验三次确定最佳的净化方式。

固相萃取法：C18(Strata C18－E，55μm，70A，2g/12mL)SPE柱，SPE柱用20mL乙腈预淋洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即将该柱放至固定架上，下接鸡心瓶，移入2.5mL样品萃取液，并用20mL乙腈洗脱C18 SPE柱，收集萃取液及洗脱液，在旋转蒸发器上浓缩至近干正己烷溶解并定容至1mL后，装入自动进样小瓶中，待测。

凝胶渗透色谱法：取试样溶液5mL注入凝胶渗透色谱(GPC)柱，泵流速5.0mL/min，以乙酸乙酯-环己烷(体积比1：1)溶液洗脱，弃去0-7.5min流分，收集7.5-15min流分，15-20min冲洗GPC柱。将收集的流分旋蒸浓缩至约1mL，用氮气吹至近干。正己烷定容至1mL待测。其余条件均与“3.2”中相同。结果如表5所示。

表5净化方式优化数据汇总

对比不同净化方式同时考虑操作经济简便性，选择凝胶渗透色谱作为净化方法。

3.5定值方法的验证

3.5.1标准曲线线性、检出限、定量限

取空白大米样品，依据定值方法进行前处理，制备空白基质提取液。向空白基质提取液中加入适量的混合标准液配制标准工作液，按照前述检测方法中的条件进行测定。以目标物的质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制工作曲线。分别计算四种六氯环己烷同分异构体3倍信噪比和10倍信噪比响应时对应的质量浓度，确定方法对于各目标物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表6。从结果可以看出，各目标物在其对应的浓度范围内线性关系良好。相关系数均大于0.999，线性范围满足实际使用的需求。

表6标准曲线线性及检出限、定量限

3.5.2回收率及精密度

验证方法回收率及精密度。称取6个空白大米样品，分别向样品中添加高、中、低水平含量的四种不同六氯环己烷标准品，每个水平重复测定两次。回收率计算方法见下式。回收率结果见表7。

表7定值方法回收率

结果表明该实验回收率符合方法要求：方法线性范围内，回收率满足90％～110％。

精密度：对高、中、低水平加标的三种样品进行测定，每种样品分别进行6次重复实验。按步骤3.1处理样品，取6次含量结果进行精密度计算，结果见表8：

表8六六六定值方法精密度

结果表明该方法精密度符合测试要求：被测组分含量在10-50μg/kg时，RSD值满足＜10％。

3.6多家实验室联合定值

3.6.1多家实验室联合定值

本基体标准物质采用8家实验室联合定值。由标准物质研制单位“中粮营养健康研究院”统一组织与实施联合定值。联合定值单位的遴选基于我国具有相关检测资质的、专业的、权威的实验室，并对参加单位的定值能力充分调研与考查。参加联合定值实验室单位名称具体如下：

1.国家副食品质量监督检验中心

2.中国检验检疫科学研究院综合检测中心

3.国家粮食和物资储备局粮油质量检验测试中心

4.北京市理化分析测试中心

5.大连出入境检疫局检验检疫技术中心

6.吉林省产品质量监督检验院

7.上海市食品研究所

8.河北省食品检验研究院

参加联合定值的8家实验室，均是CNAS认可的全国食品检测权威实验室，常年承担市场监管总局国家食品安全抽检项目，其中五家检测机构具备国家市场监管总局、国家卫健委、农业农村部联合发布的食品复检机构资质。对本研究大米中六氯环己烷的定值检测提供了可靠保证。联合定值的实施方案主要包括：组织召开联合定值研讨会；由标准物质研制单位开展定值方法的研究，提供《定值作业指导书》、定值方法，统一分发定值所需要的标准物质样品。各参加实验室参照定值方法结合各自仪器型号进一步优化定值方法，并完成标准物质候选物样品定值，同时提供实验设备、仪器型号以及具体操作过程等文件材料。

3.6.2定值结果及分析

本研究的定值方式参照JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》，定值结果见表9-12。

表9大米粉中α-666标准物质定值统计结果

表10大米粉中β-666标准物质定值统计结果

表11大米粉中γ-666标准物质定值统计结果

表12大米粉中ξ-666标准物质定值统计结果

1)组内数据可疑值判定：对每一组独立测量结果，采用格拉布斯(Grubbs)法和狄克逊(Dixon)法检验是否存在可疑值：

Grubbs准则：计算残差

Dixon准则：计算r

8家单位定值数据计算结果均通过Grubbs检验及Dixon检验无异常值。

2)组间数据等精度检验：对各组数据的标准偏差采用科克伦(Cochran)法进行等精度检验：

计算

3)当各组数据处于等精度时，采用格拉布斯(Grubbs)法检验各组数据的平均值是否存在显著性差异。给定的显著性水平α＝0.05，8组数据的临界值λ(0.05,8)＝2.126。如平均值无显著性差异，求出总平均值，即为标准值。

总平均值

总平均值的标准不确定度，即不确定度A类分量uA用下式表示：

4)当各组数据不等精度时，采用不等精度加权方式处理。其权重用各自测量方法的不确定度计算，加权总平均值即为标准值。

加权总平均值

加权总平均值的标准不确定度，即不确定度A类分量u

其中：

3.7不确定度分析

3.7.1不确定度来源

标准物质定值结果的不确定度由三部分组成，分别为：标准物质的均匀性引入的不确定度；标准物质的稳定性引入的不确定度；标准物质的定值过程带来的不确定度。以下分别对不确定度评定过程进行详细说明。

3.7.2均匀性引入的不确定度

根据均匀性检验数据，样品不均匀引入的不确定度如表13。

表13

3.7.3稳定性引入的不确定度

根据长期稳定性检验数据，样品不稳定引入的不确定度如表14。

表14

3.7.4定值不确定度评定

定值结果不确定度由测量重复性引入的不确定度u

3.7.5A类不确定度

对于多个实验室合作定值，组间数据经等精度检验后，计算相应不确定度如表15。

表15

3.7.6B类标准不确定度

按照结果计算公式，B类不确定度主要由以下几个部分引入：①六氯环己烷四种异构体标准溶液浓度；②样品经提取后最终定容溶液；④样品称样量。

3.7.6.1六氯环己烷四种异构体标准溶液引入的不确定度

六氯环己烷四种异构体标准溶液是采用GBW(E)060081、GBW(E)060082、GBW(E)060083、GBW(E)060084浓度分别为(50.0μg/mL；50.0μg/mL；50.1μg/mL；50.0μg/mL，相对扩展不确定度均为1％)经过两次稀释后得到工作溶液，其不确定度分析过程如下：

六氯环己烷四种异构体标准溶液引入的相对标准不确定度为0.5％。

称量用电子天平检定证书中天平称量不确定度0.15mg，假定为矩形分布

储备液通过稀释得到工作校准溶液用于样品测定，所用天平为万分之一天平，如前所述，由天平称量引入的合成不确定度为0.09mg。

A、第一次稀释到500ng/kg引入的不确定度

①储备溶液约1g，相对标准不确定度：u

②称量溶剂约100g，相对标准不确定度：u

B、第二次稀释稀释到50ng/kg引入的不确定度

①称量上述溶液约0.1g，相对标准不确定度：u

②称量溶剂约1g，相对标准不确定度：u

合成工作校准溶液浓度相对不确定度

3.7.6.2试样提取液引入的不确定度

由万分之一天平称量引入的合成不确定度为0.09mg。称量溶剂约5g，相对标准不确定度：u

3.7.6.3样品称量引入的不确定度

样品称重引入的不确定度，样品称重量为2g，本实验所用万分之一天平，由样品称量引入的不确定度为：

同上，合成称量不确定度：u

相对标准不确定度：u

3.7.6.4合成B类不确定度

B类不确定度合成：

3.7.7合成标准物质定值不确定度

合成标准物质定值不确定度为：

计算结果见表16。

表16

3.8合成不确定度

合成不确定度等于定值过程中引入的不确定度、均匀性引入的不确定度和稳定性引入的不确定度的平方和的开方，即样品中六氯环己烷的合成不确定度为

相对扩展不确定度：U

扩展不确定度＝相对扩展不确定度×标准值。结果见表17。

表17

结果表达

本标准物质以通过国家标准验证程序，并经过定值实验室全面方法学验证的气相色谱ECD检测高准确度方法作为定值方法。标准物质研制技术路线、样品制备及定值方法的选择充分考虑了目前国内外相关限量要求和检测方法特点。均匀性和稳定性良好，标准值确定及不确定度评定合理，符合国家标准物质相关技术规范要求。本标准物质可用于大米粉中六氯环己烷四种异构体分析方法的评价、分析过程的质量控制及实验室能力考核。本标准物质定值结果及不确定度等相关信息见表18。

表18标准物质量值表

实施例2

用于说明本发明提供的α-666标准物质的制备

在通风条件下，采用喷雾液滴不大于70μm的高压喷雾器，将α-666溶液喷洒至大米中，边喷洒边搅拌大米，其中所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量约为40μg/kg；然后采用55℃的热风对大米进行吹干，时间为0.8h。然后将样品冷却。冷却后，在超细研磨机中，将大米粉碎至粒径不大于50μm，并过300目的筛子。将过筛后的大米粉采用卧式搅拌机在100rpm下连续搅拌0.8h。然后在氩气气氛的手套箱中，将所述大米粉包装到棕色玻璃瓶中，并用锡纸塑封瓶口，进行密闭保存。

按照实施例1的方法进行样品长期稳定性、短期稳定性的测试，以及六六六的定值，结果如表19所示。

实施例3

用于说明本发明提供的α-666标准物质的制备

在通风条件下，采用喷雾液滴不大于70μm的高压喷雾器，将α-666溶液喷洒至大米中，边喷洒边搅拌大米，其中所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量约为50μg/kg；然后采用65℃的热风对大米进行吹干，时间为1.2h。然后将样品冷却。冷却后，在超细研磨机中，将大米粉碎至粒径不大于50μm，并过300目的筛子。将过筛后的大米粉采用卧式搅拌机在140rpm下连续搅拌1.2h。然后在氩气气氛的手套箱中，将所述大米粉包装到棕色玻璃瓶中，并用锡纸塑封瓶口，进行密闭保存。

按照实施例1的方法进行样品长期稳定性、短期稳定性的测试，以及六六六的定值，结果如表19所示。

实施例4

用于说明本发明提供的α-666标准物质的制备

在通风条件下，采用喷雾液滴不大于70μm的高压喷雾器，将α-666溶液喷洒至大米中，边喷洒边搅拌大米，其中所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量为60μg/kg；然后采用50℃的热风对大米进行吹干，时间为0.5h。然后将样品冷却。冷却后，在超细研磨机中，将大米粉碎至粒径不大于50μm，不过筛。将大米粉采用卧式搅拌机在50rpm下连续搅拌0.5h。不充氩气直接将所述大米粉包装到棕色玻璃瓶中，并用锡纸塑封瓶口，进行密闭保存。

按照实施例1的方法进行样品长期稳定性、短期稳定性的测试，以及六六六的定值，结果如表19所示。

实施例5

用于说明本发明提供的α-666标准物质的制备

在通风条件下，采用喷雾液滴不大于70μm的高压喷雾器，将α-666溶液喷洒至大米中，边喷洒边搅拌大米，其中所述六六六溶液的用量可以使得所述六六六标准物质中六六六的含量为100μg/kg；然后采用70℃的热风对大米进行吹干，时间为2h。然后将样品冷却。冷却后，在超细研磨机中，将大米粉碎至粒径不大于50μm，不过筛。将大米粉采用卧式搅拌机在200rpm下连续搅拌1.2h。然后在氩气气氛的手套箱中，将所述大米粉包装到棕色玻璃瓶中，并用锡纸塑封瓶口，进行密闭保存。

按照实施例1的方法进行样品长期稳定性、短期稳定性的测试，以及六六六的定值，结果如表19所示。

实施例6

用于说明本发明提供的α-666标准物质的制备

按照实施例1的方法进行α-666标准物质的制备，不同的是，将大米替换为玉米。

按照实施例1的方法进行样品长期稳定性、短期稳定性的测试，以及六六六的定值，结果如表19所示。

对比例1

用于说明参比的α-666标准物质的制备

采用家用喷壶喷洒六六六标准溶液、经简单破碎(平均粒径200μm)后混匀，的方法进行α-666标准物质的制备。按照实施例1的方法进行样品长期稳定性、短期稳定性的测试，以及α-666的定值，结果如表19所示。

表19

其中，由于扩展不确定度与标准物质中六六六含量有关，因此对比不同六六六含量的标准样品时，需要参考相对扩展不确定度。并且相对扩展不确定度是稳定性和均匀性的综合情况的反映，因此对于实施例1-6和对比例1的六六六标准物质的均匀性和稳定性的反映，以相对扩展不确定度为准。

通过表19的数据可以看出，实施例1-6具有较好的效果，其中实施例1-3的效果更好。对比例1中F检验结果为不均匀，并且相对扩展不确定度过大。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。