一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法，属于猪弓形虫病毒检测技术领域，包括盒体，所述盒体内装有检测板和底板，所述检测板的顶部开设有观察窗，所述观察窗的内部设有第一检测线，所述观察窗的内部靠近第一检测线的一侧设有第二检测线，所述观察窗的内部靠近第二检测线的一侧设有质控线，所述检测板顶端的一侧开设有加样孔，所述加样孔内插入有采样吸管，本发明提供的一种猪弓形虫病检测板，利用免疫层析技术，对样本实现快速检测，具有灵敏度高和耗时短的优点，同时利用间接免疫荧光检验的方法来进行辅助检测，比直接法敏感度提高5‑10倍，且一种荧光二抗可检测多种抗原抗体系统，制备方法简单，成本低廉，易于进行商业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于猪弓形虫病毒检测技术领域，具体涉及一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法。

背景技术

猪弓形虫病是由刚第弓形虫引起的一种原虫病。弓形虫病是一种人畜共患病，宿主的种类十分广泛，人和动物的感染率都很高。猪暴发弓形虫病时可使整个猪场的猪只发病，死亡率高达60％以上。我国弓形虫感染和弓形虫病的分布十分广泛。经全国各地的调查，证实我国各地均有人和家畜弓形虫病，由于弓形虫的宿主范围广泛，弓形虫病在全世界内是影响畜牧业生产的重要问题，尤其妨碍猪、羊等经济动物的生产，并且人类可能会通过摄入生的或未煮熟的肉类从而引发弓形虫的感染，而猪肉是弓形虫感染的主要肉类来源之一，此外，弓形虫病主要会造成母猪流产、产死胎等，同时也会导致患病的仔猪出现高热、消瘦、死亡等，对于育肥猪、公猪等感染弓形虫可能会与其他疾病混合感染。

现有的胶体金免疫层析检测试剂盒灵敏度较低，稳定性也不够，而且耗时长，其次现有的检测方法步骤杂乱容易出现假阳性的结果，造成后续不适当的治疗，同时所需的检查设备成本较高，不适用与小型研究所或者小型医院，所以需要一种新型的并且较为全面的检测方法来解决此问题。

发明内容

为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于一种检测猪弓形虫病的引物、试剂盒及方法，可以实现对猪粪便或呕吐物样本中的猪弓形虫病毒快速检测，检测灵敏度高，稳定性好，不容易出现假阳性。

本发明的目的之二在于提供一种猪弓形虫病检测试剂盒，对猪弓形虫病毒检测特异性高，不容易出现假阳性。

本发明的目的之三在于提供一种猪弓形虫病检测试剂盒的制备方法。

本发明的目的之四在于提供一种猪弓形虫病检测试剂盒的使用方法，可以在仅需一次取样条件下，完成猪弓形虫病毒的检测，极大地方便了动物检疫人员，且特异性及灵敏度较好。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种检测猪弓形虫病的引物

上游引物：PDCoV-F：5’-TCGGATCCCCCTCTTGTTGC-3’

下游引物：PDCoV-F：5’-AGCCGATTTTGCTGACCCTG-3’

所述扩增的猪弓形虫病毒基因目的片段为359bq。

进一步地，包括盒体，所述盒体内装有检测板和底板，所述检测板的顶部开设有观察窗，所述观察窗的内部设有第一检测线，所述观察窗的内部靠近第一检测线的一侧设有第二检测线，所述观察窗的内部靠近第二检测线的一侧设有质控线，所述检测板顶端的一侧开设有加样孔，所述加样孔内插入有采样吸管

进一步地，所述底板的顶部设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜顶部的结构和观察窗内的结构相同，所述硝酸纤维素膜的一侧设有吸水纸，所述硝酸纤维素膜的另一侧设有金标垫，所述金标垫的一侧设有样品垫。

进一步地，所述具体使用步骤如下：

S1、采用胶体金标记猪弓虫病单克隆抗体，得到所述胶体金标记的猪弓虫病抗体；将胶体金标记的猪弓虫病抗体，喷涂在所述金标垫12上；

S2、将胶体金标记的猪弓虫病抗体包被在硝酸纤维素膜上，形成第一检测线5，将羊抗鼠IgG包被在位于所述第一检测线5另一侧的硝酸纤维素膜13上，形成质控线7，且进行干燥处理；

S3、在底板3上分别顺次搭接对应的样品垫10、金标垫12、硝酸纤维素膜 13和吸水纸11，组成对应的板后，切成猪弓虫病检测试纸条；

S4、将制得的猪弓虫病检测试纸条装进塑料盒体1中，调整猪弓虫病检测试纸条的位置，使加样孔9在样品垫10上方，观察窗4在第一检测线5、第二检测线6以及质控线7上方，即得猪弓虫病检测板2；

S5、将S4中制备的猪弓虫病检测板2和样本稀释液置于盒体1中，得到猪弓虫病检测试剂盒。

进一步地，所述所需的仪器设备如下：

低温冰箱、制冰设备、水平摇床、离心机、振荡器、灭菌器、干燥箱、凝胶成像设备、核酸电泳仪、荧光显微镜。

进一步地，所述所需材料如下：

氨苄青霉素、DMEM、彩色预染蛋白Marker、Trypsin-EDTA、卡那霉素(Kan)、蛋白酶抑制剂、单片段同源重组酶、DNA Marker、PVDF膜、核酸染料以及无水乙醇、氯化钠、氯化钾、甲醇。

进一步地，所述试剂的配制方法如下：

S1、称量2gNaCl，2gTryptone，1gYeastExtract，先用量筒量取150mL，去离子水，完全溶解后定容至200mL，温度要保证在121℃，灭菌15min，称量 2gNaCl，2gTryptone，1gYeast Extract，3gAgar powder,先用量筒量取150mL 去离子水，完全溶解后定容至200mL，同样温度保证121℃，灭菌15min。灭菌结束后使其降温至50℃倒板，将固体板放于4℃冰箱保存；

S2、分别称取NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4置于烧杯中，量取去离子水 900mL，将称取得药品和去离子水混合，放置于磁力搅拌器，进行搅拌使试剂充分溶解，将pH调至7.4，然后将溶液定容至1L，倒入洁净的试剂瓶中，进行高压灭菌后备用，称量Tris、Glycine、SDS三种试剂，加入约800mL的去离子水，搅拌使试剂完全溶解，最后加去离子水将溶液定容至1L，室温保存备用，在 4.196mL灭菌后的蒸馏水中加入1g IPTG搅拌溶解，用0.22μm的滤膜除菌，分装到2mLEP管中，终浓度为1M，且储存于-20℃冰箱备用；

S3.称量242g Tris，37.2g Na2EDTA.2H20倒入1L体积烧杯中，完全溶解后,加入57.1mL HAC定容至1L，室温保存,称量0.3g琼脂糖粉末倒入锥形瓶中，加入1mL 50×TAEBuffer，量取29mL去离子水加入锥形瓶中，至于微波炉中加热至胶完全溶解,放凉至加入5μL核酸染色剂，摇匀后倒入插好梳子的胶托内，室温凝固30min后使用,称量1g考马斯亮蓝R-250倒入300mL去离子水中，分别量取100mL冰醋酸，250mL甘油倒入烧杯中，完全溶解后，定容至1L，利用滤纸过滤,后室温保存；

S4.用量筒量取500mL甲醇倒入1L体积烧杯中，加入100mL冰醋酸，定容至1L，室温保存，称量8.8g NaCl倒入1L体积烧杯中，量取20mL 1M pH＝8.0的TrisHCl，吸取0.5mLTween-20，分别加入烧杯中，完全溶解后，定容至1L，室温保存，称量0.5g脱脂奶粉倒入15mL离心管内，吸取10mL TBST Buffer于离心管使其溶解，现用现配，称量0.22g NaCl倒入15mL离心管内，吸取10μL PMSF加入离心管内，先加入8mL 1×PBS使其完全溶解，定容至10mL，称量0.22g NaCl倒入15mL离心管内，吸取10μL PMSF加入离心管内，先加入8mL 1×PBS使其完全溶解，定容至10mL，称量0.61464g谷胱甘肽(还原型)倒入15mL离心管内，吸取10μLPMSF加入离心管内，先加入8mL 1×PBS使其完全溶解，定容至10mL，现用现配。

S5.用量筒量取22.2mL硫酸溶液倒入177.8mL体积的去离子水中，室温保存,称量2.93g NaHCO

本发明的检测原理：

检测阳性样本时，样品中含有的猪弓形虫病毒，可与金标垫12上胶体金标记的猪弓形虫病毒单克隆抗体结合形成复合物，该复合物在第一检测线5处和猪弓形虫病毒多克隆抗体汇合被第一检测线5捕获，从而相应凝集显色；金标垫12上未结合的胶体金标记的猪弓形虫病毒单克隆抗体与质控线7处包被的羊抗鼠IgG结合而凝集显色。检测阴性样本时，样本中猪弓形虫病毒，不能形成免疫复合物，则只能在质控线处显色，因此，无论猪弓形虫病毒是否存在于临床样本中，一条红色条带都会出现在质控线7处。

利用间接免疫荧光检验的方法检测时是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原-抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原或抗体。

与现有技术相，本发明具有的有益效果如下：

(1)本发明提供的一种猪弓形虫病检测板，利用免疫层析技术，对样本实现快速检测，具有灵敏度高和耗时短的优点，对标记物垫用NaCl溶液进行前处理，能有效消除免疫层析试纸的假阳性，可以提高检测结果的稳定性，和猪血清白蛋白组合可以改善样本的离子环境，有良好稳定胶体金溶液的效果，不需要过多的精密仪器，很多小型研究所和小型医院也可以使用。

(2)本发明提供了一种间接免疫荧光检验的方法来进行检测，比直接法敏感度提高5-10倍，且一种荧光二抗可检测多种抗原抗体系统，制备方法简单，成本低廉，易于进行商业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是用本申请实施例2提供的检测板的俯视结构示意图；

图2是用本申请实施例2提供的底板结构图；

图3是本申请实施例2盒体整体结构图；

图4是本申请实施例1提供的引物加样体系图。

图中：1、盒体；2、检测板；3、底板；4、观察窗；5、第一检测线；6、第二检测线；7、质控线；8、采样吸管；9、加样孔；10、样品垫；11、吸水纸； 12、金标垫；13、硝酸纤维素膜。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种检测猪弓形虫病的引物，请参阅附图4，包括病原体，提取弓形虫的cDNA为模板，SAGL-F、SAGL-R为上下游引物，对SAGL基因进行PCR 扩增；

上游引物：PDCoV-F：5’-TCGGATCCCCCTCTTGTTGC-3’

下游引物：PDCoV-F：5’-AGCCGATTTTGCTGACCCTG-3’

扩增的猪弓形虫病毒基因目的片段为359bq，提取弓形虫的cDNA为模板， SAG1-F、SAG1-R为上下游引物，对SAG1基因进行PCR扩增，加样结束后，瞬离5s以确保样品完全沉于管底，离心后放入PCR仪内进行扩增，在4℃的温度下可进行短时间保存，时间久会对仪器造成损耗，反应结束后应尽快拿出反应产物，扩增时间因酶的不同、基因长度的不同而长短不一，需要说明的有引物的扩增是制备抗体最重要的一个步骤，如果需要对扩增产物进行检测，可以取扩增产物5μL,通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在应用凝胶成像系统下观察结果。

实施例2

本实施例提供一种检测猪弓虫病的试剂盒，请参阅附图1-3，包括盒体1，其特征在于，盒体1内装有检测板2和底板3，检测板2的顶部开设有观察窗4，观察窗4的内部设有第一检测线5，观察窗4的内部靠近第一检测线5的一侧设有第二检测线6，观察窗4的内部靠近第二检测线6的一侧设有质控线7，检测板2顶端的一侧开设有加样孔9，加样孔9内插入有采样吸管8，底板3的顶部设有硝酸纤维素膜13，硝酸纤维素膜13顶部的结构和观察窗4内的结构相同，硝酸纤维素膜13的一侧设有吸水纸11，硝酸纤维素膜13的另一侧设有金标垫12，金标垫12的一侧设有样品垫10，选取样本时可以从仔柱、育肥猪、母猪、以及母乳期母猪中挑选，可以选用呕吐物、粪便以及内脏血清，具体用试剂盒检测的步骤如下：用棉签采集排泄的粪便或呕吐物或者直接从直肠取得的样本，然后将立即将棉签插入装有样本稀释液的样品管中，取出棉签后用力摇晃使之充分混匀，得到待测样本溶液，静置数分钟后待测、放置好检测板2，使之水平放置于操作平台上，用采样吸管8吸取待测样本溶液3～4滴(约100μ L)滴加到加样孔9中，5～10分钟内观察并判读结果，超过15分钟的结果无效，原理主要是通过观察样本的颜色变化来判定，其中第二检测线6和第一检测线5 的作用是相同的，是备用的，防止某个检测线在待检测时出现掉色的情况。

实施例3

本实施例提供一种检测猪弓形虫病的方法，除了利用试剂盒也可以通过荧光抗体对比的方法，将洁净的盖玻片置于100％酒精和去离子水中冲洗，晾干备用，纯化虫株，PBS洗涤2次后重悬，吸取适量的速殖子滴于干净的盖玻片上涂抹均匀后，静置3min，吸弃表面的液体，在铺有速殖子的玻片上缓慢滴加 4％多聚甲醛数滴，室温静置30min，再用用PBS溶液进行玻片的清洗，每次5 min，洗3次，用PBS配制0.25％ Tritonx-100溶液，滴于玻片上，室温作用 20min，PBS清洗1次，每次5min，用PBS配制3％ BSA溶液，滴于玻片上，室温作用30min，用抗体稀释液(3％ BSA溶液)将猪的血清稀释(1:150)，滴于玻片表面与速殖子孵育，放置37℃恒温箱，1h，孵育结束后，用PBS清洗3次，每次5min用抗体稀释液将FITC(绿光)标记的抗猪二抗抗体稀释， (1:100)后滴于玻片表面进行孵育，放置37℃恒温箱，1h，孵育结束后，用PBS 清洗3次，每次5min在干净的载玻片上滴加适量的荧光淬灭剂，将载玻片倒置于载玻片，避免产生气泡，用封片剂将盖玻片边缘密封，此步骤要避光操作，每个载玻片上做好对应的标记，放置在切片盒内，避光4℃保存，在荧光显微镜下观察，以猪的阳性、阴性血清样本作为参考指标，判断待检猪血清样本的阴性、阳性，记录数据并拍照保存，通过这种检测方法可以对试剂盒检测的样本重新抽样检验，减小可能存在的失误，也就是用于辅助试剂盒。