GLP-1代谢物在制备减轻急性肾损伤药物中的用途

摘要

本发明公开了一种GLP‑1代谢物在制备减轻急性肾损伤药物中的用途，所述GLP‑1代谢物为GLP‑1(9‑37)和/或GLP‑1(28‑37)。本发明的GLP‑1代谢物GLP‑1(9‑37)和GLP‑1(28‑37)对急性肾损伤有很好的保护效果，不仅显著降低急性肾损伤小鼠的肌酐、尿素氮水平的升高，而且小鼠肾脏HE、MPO、c‑Caspase3染色结果说明GLP‑1(9‑37)和GLP‑1(28‑37)能明显减轻肾脏病理损伤，减少肾组织炎性细胞浸润和肾小管细胞坏死，且该保护作用是GLP‑1R非依赖的。

说明书

技术领域

本发明涉及减轻急性肾损伤药物的技术领域，具体涉及一种GLP-1代谢物在制备减轻急性肾损伤药物中的用途。

背景技术

急性肾损伤(简称AKI)是一种临床综合征，其特征是肾脏排泄功能迅速(几小时到几天)下降，并积聚氮类代谢产物，如肌酐和尿素氮以及其他临床上未测量到的代谢废物。其他常见的临床和实验室表现包括尿量减少、代谢酸累积以及钾和磷浓度增加。尽管肾脏替代疗法在技术上取得了很大的进步，但AKI后5年的死亡率仍然很高。AKI在住院患者中很常见，尤其是危重患者，且由于严重的急性肾损伤与高死亡率有关，必须采取预防措施来避免这种常见但通常被忽视的临床实体的沉重负担。

顺铂(简称Cis)是一种非常有效的化疗药物，用于治疗各种实体肿瘤，包括睾丸、卵巢、宫颈和非小细胞肺癌。然而，它却有严重的副作用，特别是肾毒性。尽管顺铂导致急性肾损伤的确切机制仍不完全清楚，但已有研究表明，顺铂在肾小管细胞中的蓄积会引起肾小管细胞凋亡和肾脏的炎症反应。虽然许多参与顺铂肾毒性的途径已被描述并建议作为肾脏保护的靶点，许多新的潜在保护剂已被报道。但目前用于接受顺铂治疗的患者的肾脏保护措施并不令人满意，故研究的重点是研究新的可能的保护策略。

胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)主要由肠道L细胞产生，属于肠促胰素。具有生物学活性的GLP-1主要有两种：GLP-1(7-36)a以及GLP-1(7-37)，前者主要存在于人而后者主要存在于其他物种。DPP-Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase IV)和NEP(NeutralEndopeptidase)是GLP-1在体内代谢的关键酶，DDP-IV能分解其氨基末端的两个氨基酸，由此产生的代谢物GLP-1(9-36)a或GLP-1(9-37)无法激动GLP-1受体(简称GLP-1R)。NEP也是GLP-1的代谢酶，可进一步将GLP-1(9-36)a或GLP-1(9-37)裂解为更小的肽段，其中就包括GLP-1(28-36)a或GLP-1(28-37)。近年来，有文献报道了GLP-1代谢物的作用。例如，GLP-1(28-36)a通过激活sAC(可溶性腺苷环化酶)，从而减少氧化应激，保护心脏免受再灌注损伤；代谢物GLP-1(9-36)a在神经变性细胞模型中具有神经保护和抗炎作用。GLP-1代谢物的一些心脏保护和血管扩张作用不依赖于GLP-1R。有文献报道，GLP-1(9-36)a介导的心肌细胞保护可被Exendin(9-39)阻断，但不需要已知的GLP-1R。

现有技术中，GLP-1(9-37)与GLP-1(28-37)对急性肾损伤是否有显著的保护作用未见报道。急性肾损伤在临床中十分常见，而现阶段临床上仍缺乏能有效治疗急性肾损伤的药物。因此，本领域迫切期待能够为临床提供对急性肾损伤具有保护作用的药物。

发明内容

本发明的目的在于克服上述背景技术的不足，研究GLP-1代谢物在制备减轻急性肾损伤药物中的用途。

为实现上述目的，本发明提供了一种GLP-1代谢物在制备减轻急性肾损伤药物中的用途。

进一步地，所述GLP-1代谢物为GLP-1(9-37)和/或GLP-1(28-37)。

进一步地，所述GLP-1(9-37)的氨基酸序列为：EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。

进一步地，所述GLP-1(28-37)的氨基酸序列为：FIAWLVKGRG。

进一步地，所述GLP-1代谢物用于抑制HMGB1的释放。

本发明还提供一种用于减轻急性肾损伤的药物组合物，其有效物质含有GLP-1代谢物。

再进一步地，所述GLP-1代谢物为GLP-1(9-37)和/或GLP-1(28-37)。

更进一步地，该药物组合物制成静脉滴注或皮下注射的药物剂型。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

其一，本发明的GLP-1代谢物GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)对急性肾损伤有很好的保护效果,不仅显著降低顺铂导致的小鼠肌酐、尿素氮水平的升高，而且小鼠肾脏HE、MPO、c-Caspase3染色等结果说明GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)能明显减轻AKI时的肾脏病理损伤，减少肾组织炎性细胞浸润和肾小管细胞坏死，且该保护作用是GLP-1R非依赖的。

其二，本发明的GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)在用药剂量不变时，将预防用药的次数从六次减为两次时仍然有效，从HMGB1组化、ELISA等结果来看，GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)明显抑制了HMGB1的释放，从而减轻急性肾损伤。对于顺铂导致的急性肾损伤的小鼠，GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)能通过抑制HMGB1的释放减轻其肾脏损伤，从而为临床上制备预防和治疗急性肾损伤药物提供了新的方向。

其三，本发明通过对GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)进行动物试验和细胞实验，探索其在急性肾损伤中的作用，发现一定剂量的GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)能够明显减轻小鼠急性肾损伤，且该过程通过抑制HMGB1释放来实现，这为临床预防或治疗急性肾损伤以及相关疾病提供了重要的技术支持。根据本发明的实验结果进行合理推论，GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)也适于在制备预防或治疗心脏、肝脏、肺等器官急性损伤药物中的应用。

附图说明

图1A至图1D显示了20-22克野生型C57小鼠预先给予或不给予溶剂或GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)预处理，然后分别腹腔注射顺铂或等剂量的生理盐水，分别于GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)或等剂量溶剂治疗用药24h、48h、72h、96h后收集小鼠血清及肾组织，行血生化结果检测图；其中：图1A为实验中的给药模式；图中，G表示GLP-1代谢物；Cis表示腹腔注射顺铂造模；sample collection表示收集标本；①预防用药六次，治疗用药96h后取标本；②预防用药六次，治疗用药72h后取标本；③预防用药六次，治疗用药48h后取标本；④预防用药六次，治疗用药24h后取标本；⑤治疗用药96h后取标本(治疗)；⑥预防用药两次，治疗用药96h后取标本(预2次+治疗)；图1B为造模24h、48h、72h、96h后各组小鼠血清肌酐水平柱状对比图；图1C为造模24h、48h、72h、96h后各组小鼠血清尿素氮水平柱状对比图；图1D为造模四天后各组小鼠血清肌酐和尿素氮水平柱状对比图；各图中，Sham组表示溶剂对照+假手术组；Cis组表示溶剂对照+顺铂造模组；GLP-1(9-37)组表示GLP-1(9-37)处理+顺铂造模组；GLP-1(28-37)组表示GLP-1(28-37)处理+顺铂造模组；预2+治疗表示造模前预防用药两次，造模后治疗用药96h；治疗表示造模后治疗用药96h；

图2A至图2H显示了20-22克野生型C57小鼠或GLP-1R-/-C57小鼠先给予溶剂或GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)预处理六次，然后分别腹腔注射顺铂或等剂量的生理盐水，GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)或等剂量溶剂治疗用药96h后收集小鼠血清及肾组织，行血生化结果检测、肾组织HE染色、MPO和c-Caspase3组化检测结果图。其中：图2A为使用GLP-1(9-37)处理的各组小鼠血清肌酐和尿素氮水平柱状对比图；图2B为使用GLP-1(28-37)处理的各组小鼠血清肌酐和尿素氮水平柱状对比图；图2C为各组肾组织的HE染色结果对比图；图2D为各组肾组织病理损伤评分柱状对比图；图2E为各组肾组织MPO免疫组化染色结果对比图；图2F为各组肾组织每200倍镜视野MPO阳性细胞数目柱状对比图；图2G为各组肾组织c-Caspase3免疫组化染色结果对比图；图2H为各组肾组织每200倍镜视野肾小管凋亡细胞数目柱状对比图；各图中，Sham组表示溶剂对照+假手术组；Cis组表示溶剂对照+顺铂造模组；GLP-1(9-37)组表示GLP-1(9-37)处理+顺铂造模组；GLP-1(28-37)组表示GLP-1(28-37)处理+顺铂造模组；WT表示野生型C57小鼠；GLP-1R-/-表示GLP-1R基因敲除小鼠；

图3A至图3F显示了20-22克野生型C57小鼠先给予溶剂或GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)预处理六次，然后分别腹腔注射顺铂或等剂量的生理盐水，分别于GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)或等剂量溶剂治疗用药24h、72h、96h后收集小鼠血清及肾组织，行肾组织HMGB1免疫组化、血清ELISA检测结果图；其中：图3A为造模24h后各组小鼠肾组织HMGB1免疫组化染色结果对比图；图3B为造模72h后各组小鼠肾组织HMGB1免疫组化染色结果对比图；图3C为造模96h后各组小鼠肾组织HMGB1免疫组化染色结果对比图；图3D为造模24h后各组小鼠血清HMGB1水平柱状对比图；图3E为造模72h后各组小鼠血清HMGB1水平柱状对比图；图3F为造模96h后各组小鼠血清HMGB1水平柱状对比图；各图中，Sham组表示溶剂对照+假手术组；Cis组表示溶剂对照+顺铂造模组；GLP-1(9-37)组表示GLP-1(9-37)处理+顺铂造模组；GLP-1(28-37)组表示GLP-1(28-37)处理+顺铂造模组；

图4A至图4G显示了20-22克野生型C57小鼠先给予溶剂或GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)预处理六次,然后分别腹腔注射顺铂或等剂量的生理盐水，再给GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)预处理小鼠腹腔注射rHMGB1，GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)或等剂量溶剂治疗用药96h后收集小鼠血清及肾组织，行血生化结果检测、肾组织HE染色、MPO和c-Caspase3组化检测结果图；其中：图4A为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组小鼠血清肌酐和尿素氮水平柱状对比图；图4B为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组小鼠HE染色结果对比图；图4C为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组小鼠肾脏病理损伤评分柱状对比图；图4D为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组小鼠肾组织MPO免疫组化染色结果对比图；图4E为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组小鼠肾组织每200倍镜视野MPO阳性细胞数目柱状对比图；图4F为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组小鼠肾组织c-Caspase3免疫组化染色结果对比图；图4G为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组小鼠肾组织每200倍镜视野肾小管凋亡细胞数目柱状对比图；各图中，Sham组表示溶剂对照+假手术组；Cis组表示溶剂对照+顺铂造模组；GLP-1(9-37)组表示GLP-1(9-37)处理+顺铂造模组；GLP-1(28-37)组表示GLP-1(28-37)处理+顺铂造模组；GLP-1(9-37)+rHMGB1表示GLP-1(9-37)+rHMGB1+顺铂造模组；GLP-1(28-37)+rHMGB1表示GLP-1(28-37)+rHMGB1+顺铂造模组；

图5A为人肾小管上皮细胞系HK-2细胞经不同浓度的GLP-1(9-37)或GLP-1(28-37)加顺铂(Cis)处理后24h细胞活性柱状对比图；图5B为流式细胞术检测细胞凋亡的对比图；图5C为各组细胞凋亡率柱状对比图；

图6A为人肾小管上皮细胞系HK-2细胞转染NC siRNA(siNC)或GLP-1R siRNA(siGLP-1R)后经顺铂或GLP-1(9-37)+顺铂(Cis)处理后24h流式细胞术检测细胞凋亡的对比图；图6B为各组细胞凋亡率柱状对比图；图6C为HK-2细胞转染NC siRNA(siNC)或GLP-1RsiRNA(siGLP-1R)后经顺铂或GLP-1(28-37)+顺铂(Cis)处理后24h流式细胞术检测细胞凋亡的对比图；图6D为各组细胞凋亡率柱状对比图；

图7A至图7E显示了人肾小管上皮细胞系HK-2细胞经顺铂或GLP-1(9-37)+顺铂(Cis)或GLP-1(28-37)+顺铂(Cis)处理后12h收集细胞，行HMGB1免疫荧光检测、细胞胞浆HMGB1的Western blot检测结果图；图7A为给予GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)的各组HK-2HMGB1免疫荧光的对比图；图7B为GLP-1(9-37)治疗的各组HK-2胞浆蛋白HMGB1和β-actin的Western blot对比图；图7C为GLP-1(9-37)治疗的各组HK-2胞浆蛋白HMGB1表达量柱状对比图；图7D为GLP-1(28-37)治疗的各组HK-2胞浆蛋白HMGB1和β-actin的Western blot对比图；图7E为GLP-1(28-37)治疗的各组HK-2胞浆蛋白HMGB1表达量柱状对比图。

具体实施方式

下面结合实施案例详细说明本发明的实施情况，但它们并不构成对本发明的限定，仅作举例而已。同时通过说明本发明的优点将变得更加清楚和容易理解。

实施例1：GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)对急性肾损伤小鼠的影响

实验步骤如下：

1、实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠购买于北京维通利华生物科技股份有限公司，饲养于华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心SPF级动物房，自由饮食，维持12h昼/夜周期。本实验所涉及的所有动物操作均符合华中科技大学实验动物伦理委员会的相关规定。GLP-1R基因敲除(GLP-1R-/-)小鼠(以C57BL/6J为背景)来自北京百奥赛图有限公司(北京，中国)。用快速基因分型试剂盒(D7283S，中国上海碧云天)按照制造商的方案对从尾部分离小鼠DNA进行基因分型，所用的引物如下：

野生型5’，5’-CCC ACC ACA CCA CTA GAA GTC AGGA-3’；

野生型3’，5’-GAC AAG TAG ACG ACA AGG CCC AGA G-3’；

GLP-1R-/-型5’，5’-TGC TGC ATG TAC ACC CAA ATA CCA GA-3’；

GLP-1R-/-型3’,5’-GAC AAG TAG ACG ACA AGG CCC AGA G-3’。

实验分组一：野生型C57小鼠分为溶剂处理+腹腔注射顺铂(Cis)组(n＝20)、GLP-1(9-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(9-37))组(n＝20)、GLP-1(28-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(28-37))组(n＝20)，分别于造模后24h，48h，72h和96h取标本，每个时间点各组均取5只。

实验分组二：野生型小鼠分为溶剂处理+假手术(Sham)组(n＝3)、溶剂处理+腹腔注射顺铂(Cis)组(n＝5)、GLP-1(9-37)预2加治疗+腹腔注射顺铂(GLP-1(9-37)预2+治疗)组(n＝5)、GLP-1(28-37)预2加治疗+腹腔注射顺铂(GLP-1(28-37)预2+治疗)组(n＝5)、GLP-1(9-37)治疗+腹腔注射顺铂(GLP-1(9-37)治疗)组(n＝5)、GLP-1(28-37)治疗+腹腔注射顺铂(GLP-1(28-37)治疗)组(n＝5)。

实验分组三：野生型小鼠分为溶剂处理+假手术(Sham)组(n＝3)、溶剂处理+腹腔注射顺铂(Cis)组(n＝7)、以及GLP-1(9-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(9-37))组(n＝6)、GLP-1(28-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(28-37))组(n＝6)。

GLP-1R-/-小鼠分为GLP-1(9-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(9-37))组(n＝5)、GLP-1(28-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(28-37))组(n＝6)。

实验分组四：野生型小鼠分为溶剂处理+假手术(Sham)组(n＝3)、溶剂处理+腹腔注射顺铂(Cis)组(n＝6)、以及GLP-1(9-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(9-37))组(n＝5)、GLP-1(9-37)+rHMGB1+腹腔注射顺铂(GLP-1(9-37)+rHMGB1)组(n＝6)、GLP-1(28-37)+腹腔注射顺铂(GLP-1(28-37))组(n＝5)、GLP-1(28-37)+rHMGB1+腹腔注射顺铂(GLP-1(28-37)+rHMGB1)组(n＝6)。

2、造模方式

顺铂注射液按15mg/kg的剂量腹腔注射一次。

3、药物干预及结果处置

GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)(腹腔注射，200ug/kg)造模前给药六次或两次或零次，两次给药间隔为12h，造模后每12h给药一次直至取标本。

用1％的戊巴比妥钠麻醉小鼠后，先收集各组小鼠血清，再处死小鼠，取左侧肾脏，剔除肾包膜，将肾脏纵切分为两半，取一半置于4％中性甲醛溶液中固定，随后针对各组样本分别给予HE、MPO、c-Caspase3以及HMGB1免疫组化染色。

图1A至图1D显示GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)对小鼠急性肾损伤的保护。图1B和图1C显示了在造模24h、48h、72h、96h后GLP-1(9-37)组和GLP-1(28-37)组小鼠的肌酐和尿素氮水平，从现有数据可以看出，造模后72h开始GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)显著降低了顺铂导致的小鼠肌酐和尿素氮水平的升高。图1D显示，在用药剂量不变的情况下，将预防用药的次数从六次减为两次，GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)仍具有肾保护作用，而在不进行预防用药，只进行造模后治疗用药时，GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)并未降低急性肾损伤小鼠的血清中肌酐和尿素氮水平的升高。

图2A至图2H显示GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)对小鼠急性肾损伤的保护是GLP-1R非依赖的。图2A和图2B显示了GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)对野生型小鼠和GLP-1R/-小鼠均具有肾保护作用，不管是野生型小鼠还是GLP-1R-/-小鼠，GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)均能显著降低急性肾损伤小鼠的肌酐和尿素氮的升高。图2C、图2D、图2E、图2F、图2G及图2H共同说明，不管是野生型还是GLP-1R-/-,GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)均能减轻小鼠肾脏病理损伤，减少炎性细胞浸润和肾小管细胞坏死。

图1A至图1C和图2A至图2H共同说明GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)能减轻小鼠急性肾损伤，且该保护作用是受体非依赖的的。同时我们的数据还说明，用药剂量均为200ug/kg时，将预防用药的次数从六次改为两次，GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)仍具有保护效果。

图3A至图3F显示GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)能减少HMGB1的释放。图3A为造模后24h各组肾脏HMGB1免疫组化染色结果对比图，与Sham组相比，顺铂造模组小鼠肾组织细胞中有大量HMGB1从胞核释放至胞浆，而GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)治疗能显著抑制HMGB1从胞核到胞浆的转移。图3B和图3C共同说明，造模72h以及96h后造模组小鼠肾组织细胞中的HMGB1已经大量释放到胞外，而与之相比GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)治疗明显抑制了小鼠肾组织细胞中HMGB1向胞外的释放。图3D、图3E、图3F共同说明，在造模24h、72h、96h后Cis组小鼠血清中HMGB1水平显著升高，且随着时间的推移越来越高，而与之相比GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)治疗组小鼠血清HMGB1水平均明显降低。

图4A至图4G显示了外源性使用rHMGB1会削弱GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)对急性肾损伤的保护，说明GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)通过抑制顺铂导致的HMGB1的释放减轻了急性肾损伤。图4A说明，与单纯使用GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)相比，外源性使用rHMGB1后，GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)组小鼠肌酐和尿素氮水平明显升高。图4B、图4C、图4D、图4E、图4F及图4G共同说明，与单纯使用GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)相比，外源性使用rHMGB1后，GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)组小鼠肾组织病理损伤明显加重，肾脏炎性细胞浸润程度加重，肾小管细胞坏死程度也加重。

实施例2：GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)对顺铂导致肾小管上皮细胞损伤的影响

细胞：人肾小管上皮细胞系HK-2细胞用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养于含5％CO2的37℃细胞培养箱中，细胞呈贴壁生长。

实验分组一：

Control组：无任何干预。

Cis组：给予顺铂(12uM)刺激24h。

GLP-1(9-37)组：GLP-1(9-37)(5uM,10uM,25uM，50uM)加顺铂(12uM)刺激24h。

GLP-1(28-37)组：GLP-1(28-37)(5uM,10uM,25uM，50uM)加顺铂(12uM)刺激24h。

上述处理结束后，CCK-8检测细胞活性(图5A)，收集细胞行流式细胞术检测细胞凋亡情况(图5B，图5C)，图5A、图5B及图5C共同说明GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)显著减轻顺铂导致的HK-2的凋亡。

实验分组二：

Control组：无任何干预。

Cis组：给予顺铂(12uM)刺激24h。

GLP-1(9-37)组：GLP-1(9-37)(25uM)加顺铂(12uM)刺激24h

GLP-1(9-37)+siNC组：NC siRNA细胞转染36h后GLP-1(9-37)(25uM)加顺铂(12uM)刺激24h。

GLP-1(9-37)+siGLP-1R组：GLP-1R siRNA细胞转染36h后GLP-1(9-37)(25uM)加顺铂(12uM)刺激24h。

GLP-1(28-37)组：GLP-1(28-37)(50uM)加顺铂(12uM)刺激24h。

GLP-1(28-37)+siNC组：NC siRNA细胞转染36h后GLP-1(28-37)(50uM)加顺铂(12uM)刺激24h。

GLP-1(28-37)+siGLP-1R组：GLP-1R siRNA细胞转染36h后GLP-1(28-37)(50uM)加顺铂(12uM)刺激24h。

上述处理细胞结束后，收集细胞行流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果如图6A至图6D所示。图6A、图6B、图6C及图6D共同说明GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)对顺铂导致的HK-2的保护是不依赖GLP-1R的。

实验分组三：

Control组：无任何干预。

Cis组：给予顺铂(12uM)刺激12h。

GLP-1(9-37)组：GLP-1(9-37)(25uM)加顺铂(12uM)刺激12h。

GLP-1(28-37)组：GLP-1(28-37)(50uM)加顺铂(12uM)刺激12h。

将细胞种于爬片上，上述处理结束后进行HMGB1免疫荧光染色，结果如图7A，与Normal组HK-2相比，Cis组HK-2细胞中HMGB1明显从胞核释放到胞浆，而GLP-1(9-37)和GLP-1(28-37)治疗能明显抑制HK-2中HMGB1从胞核到胞浆的转移。将细胞种于六孔板上，上述处理结束后，收集细胞提取胞浆蛋白进行HMGB1的Western Blot检测，结果如图7B、图7C、图7D及图7E所示，与Normal组相比，Cis组HK-2细胞胞浆HMGB1水平明显增高，而GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)治疗显著降低了HK-2胞浆蛋白中HMGB1水平的升高。

以上，仅为本发明的具体实施方式，应当指出，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，其余未详细说明的为现有技术。