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法律状态
2022-09-16
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N21/65 专利申请号:202210528784X 申请日:20220516
实质审查的生效
技术领域
本发明涉及分析测试领域,具体涉及一种能量摄入量的SERS快速分析方法。
背景技术
人类的衰老机制一直是研究热点。在过去的几十年里,衰老机制研究一直专注于能量摄入量的研究。过高的热量摄入量会在机体内产生活性氧物种,导致DNA,磷脂或蛋白的损伤,加速生物体的衰老。而持续性的低热量摄入,同时保持必要的营养摄入,对机体的健康及抗衰老将产生有益的影响。
目前对于能量摄入量的计算主要通过膳食回顾法来评估,食物中可提供能量的物质为碳水化合物、脂肪和蛋白质,每克碳水化合物、脂肪和蛋白质的生理能值分别为3.99千卡、9.01 千卡和3.99千卡,通过计算摄入饮食中的碳水化合物、脂肪和蛋白质的质量就可以大致评估个体的能量摄入量。膳食回顾法虽然可以对个体的能量摄入量进行一个大致的评估,但它操作繁琐耗时,亟需开发一种可以快速简便分析能量摄入量的方法。
SERS(表面增强拉曼光谱)是基于拉曼散射效应的一种分子振动与转动光谱,可以在无损的情况下提供样品分子的结构信息,并对样品进行组成和分子结构分析,从而实现对分子进行定性分析,拉曼光谱强度与散射分子数呈正相关,可实现对分子进行半定量-定量分析。溶胶法是表面增强拉曼光谱的测试方式之一,溶胶法测试过程一般是以一定比例混匀纳米粒子聚集剂、纳米增强粒子及待测物质三种成份,因此溶胶法测试需要备好纳米粒子聚集剂及纳米增强粒子以供现场使用,该过程操作繁琐且存在保存和运输过程中溶胶自发团聚的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷,提供一种能量摄入量的SERS快速分析方法,通过开发一套集储存、运输、测试功能于一体的SERS溶胶测试套件,用于采集不同能量摄入量的人员的尿液的SERS信号并进行主成分分析,发现能量摄入量不同,分析结果存在明显的差异,因此可以通过分析待测人员的尿液的SERS信号来评估能量摄入量。
为了实现以上目的,本发明的技术方案为:一种能量摄入量的SERS快速分析方法,具体包括如下步骤:
(1)装预装液:在溶胶测试小管中分别装入银纳米粒子溶胶和纳米粒子聚集剂;
(2)采集SERS信号:收集能量摄入量不同的人员的尿液,并将尿液与溶胶测试小管中的银纳米粒子溶胶混匀,再一起与溶胶测试小管中的纳米粒子聚集剂混匀,然后将溶胶小管置于拉曼仪器上,收集小管下层的SERS信号;
(3)建立尿液SERS数据库:利用主成分分析算法获得能量摄入量不同的人员的尿液的表面增强拉曼光谱对应的散点分布图,并进行能量摄入量的聚类分析,建立SERS数据库;
(4)基于尿液SERS数据库的主成分分析:包括如下步骤:
a.收集待测人员的尿液,并采集SERS光谱信号;
b.对采集的SERS光谱信号进行功率-时间归一化操作,并计算一阶导差分谱图;将该谱图与事先建立好的SERS数据库合并得到新的光谱数据集;
c.将光谱数据集利用主成分分析算法计算主成分得分矩阵;
d.绘制主成分1(PC1)、主成分2(PC2)的散点图,标明数据库中的散点分类和所测试光谱对应的散点,即得人体尿液SERS主成分分析散点分布图。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(1)中溶胶测试小管包括上下两层高硼硅玻璃小管,分别用以盛装银纳米粒子溶胶及纳米粒子聚集剂,且上层与下层之间用弹性膜隔开,弹性隔膜用以密封下层纳米粒子聚集剂及承载上层银纳米增强粒子溶胶;溶胶测试小管顶部还配有包含弹性隔膜的软橡胶帽,用以密封溶胶测试小管,方便储存和运输;溶胶测试小管为玻璃材质管壁有利于透光,方便采集管内样品的拉曼信号。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(1)中银纳米粒子溶胶采用柠檬酸钠还原法制得,具体制备方法如下:将100mL 1-5mM硝酸银溶液加热煮沸,再一次性加入5mL 1wt%的柠檬酸钠溶液,继续煮沸3小时,即可得到粒径在80~100nm的银纳米粒子溶胶,。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(1)中纳米粒子聚集剂为HCl、NaCl、KCl、NaOH中的一种或几种,纳米粒子聚集剂浓度为1mol/L,其中最优的聚集剂为1mol/L的HCl。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(2)中收集的尿液不需要进行任何前处理即可直接用于测试。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(2)中银纳米粒子溶胶、纳米粒子聚集剂及尿液的比例为150-450uL:40-120uL:100-300uL。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(2)中拉曼光谱仪为便携式拉曼光谱仪,激光激发波长为785nm。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(3)中SERS数据库是由不同能量摄入量的人员的尿液的表面增强拉曼光谱检测数据组成。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(3)中尿液的SERS数据库建立之前,先对尿液的表面增强拉曼光谱进行归一化处理,以消除激光功率和采集时间带来偏差;再计算光谱的一阶导差分谱,以避免荧光背景带来的干扰。
在本发明一较佳实施例中,所述步骤(4)a中的采集SERS光谱信号方式同步骤(3)。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1.本发明设计的溶胶测试小管具有体积小、重量轻、便于储存、运输及使用等优点;可以避免现场检测时携带纳米增强粒子溶胶及纳米粒子聚集剂带来的不便,同时也节省了操作步骤,有利于实现快速便捷检测;同时可以批量制备以备随时使用。
2.本发明中的尿液测试无需前处理,光谱测试时间耗时短,光谱数据分析可在1分钟内得到结果,整体测试分析时间不超过2分钟,操作简便且高效。
3.本发明所得的测试数据和数值计算数据都是基于客观测试分析所得,避免了人为主观因素带来的误差。
4.本发明通过采集不同能量摄入量的人员的尿液的SERS信号并进行主成分分析,从而建立起尿液的SERS信号与能量摄入量的关系,实现直接分析尿液的SERS信号就可以得到能量摄入量的信息,避免了复杂繁琐的计算,为人体的能量摄入均衡提供参考;这种方法无需专业技术人员及任何大型仪器设备即可完成测试;其操作简单,成本低,速度快,仪器便携,易推广,是一种非常适合用于现场快速评估能量摄入量的SERS方法,在生物医学领域具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明设计的溶胶测试小管的示意图,图A为立体图,图B为截面图;
其中:1-软橡胶帽1、2-上层高硼硅玻璃小管、3-下层高硼硅玻璃小管、4-软橡胶帽中间的弹性隔膜、5-两层高硼硅玻璃小管之间的弹性隔膜
图2是本发明用的银纳米粒子的扫描电镜图;
图3是本发明制得的银纳米粒子溶胶的紫外可见吸收光谱图;
图4是本发明测得的不同能量摄入量的人员尿液的平均表面增强拉曼光谱,A组能量摄入量为2300千卡/天,B组能量摄入量为1500千卡/天;
图5是本发明测得的不同能量摄入量的尿液的主成分分析的散点图,A组能量摄入量为 2300千卡/天;B组能量摄入量为1500千卡/天。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步解释。
1.溶胶测试小管的设计
溶胶测试小管包括软橡胶帽1(用于密封试剂)、上层高硼硅玻璃小管2(用于盛装纳米增强粒子)、下层高硼硅玻璃小管3(用于盛装纳米粒子聚集剂),如附图1(A)所示。溶胶测试小管还包括软橡胶帽中间的弹性隔膜4及两层高硼硅玻璃小管之间的弹性隔膜5,可抵抗一定的压力及承载、密封试剂,又便于移液枪枪头穿刺弹性膜实现试剂混匀,如附图 1(B)所示。在溶胶测试小管中可装入预装液以备使用,具体步骤如下:用移液枪移取配制好的纳米粒子聚集剂于溶胶测试小管的下层中,用弹性隔膜将其密封并用热缩管连接上下两层高硼硅玻璃小管;再移取银纳米溶胶于溶胶测试小管的上层中,用带有弹性隔膜的软橡胶帽密封上层管,完成整个装预装液过程;其中银纳米粒子溶胶、纳米粒子聚集剂及尿液的比例为150-450uL:40-120uL:100-300uL。
2.银纳米粒子溶胶的制备
银纳米粒子溶胶合成采用柠檬酸钠还原法,将100mL 1-5mM硝酸银溶液加热煮沸,再一次性加入5mL 1wt%的柠檬酸钠溶液,继续煮沸3小时,即可得到银溶胶,银纳米粒子的粒径在80~100nm。
3.尿液的收集
实验A组参试人员共有11人,摄入能量2300千卡/天;实验B组参试人员共有11人,摄入能量1500千卡/天。每组实验为期3天,收集受试者晨尿,每份3mL,为了达到人体代谢平衡,前两天作为代谢缓冲期,不予收集样本,而选择第三天稳定期的尿液样本进行信号采集。尿液无需任何前处理,可直接用于后续的检测。
4.SERS光谱信号的采集
用移液枪吸取收集到的200uL尿液先与溶胶测试小管上层中的纳米增强粒子混匀,再与溶胶测试小管下层中的纳米粒子聚集剂混匀,用便携式拉曼仪器采集溶胶测试小管下层在 300~1200cm
5.基于SERS谱图建立尿液SERS数据库
对采集到的尿液的SERS谱图进行主成分分析,建立数据库;为了避免采集过程的信号波动带来偏差,需要都所有光谱数据进行归一化操作,即将光谱强度值除以采集时间、除以采集功率;计算得到的谱图集可进行主成分分析。下面是具体的计算过程:
(1)对所有的光谱计算一阶导差分谱,以消除荧光背景;
(2)利用MATLAB R2017a软件中的统计和机器学习工具包对上述的一阶导差分谱(A组和B组)进行主成分分析;
(3)绘制主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的散点图,计算两个主成分的总贡献率。
6.基于尿液SERS数据库的主成分分析
具体步骤如下:
(1)收集新来的待测人员的尿液,用移液枪移取200uL尿液样品,戳破溶胶测试小管软橡胶帽的弹性隔膜,实现加样,将尿液与银纳米粒子溶胶混匀,再利用移液吸头戳破中间弹性隔膜,实现尿液样本-银纳米粒子溶胶混合物与纳米粒子聚集剂混匀,按上述SERS光谱信号的采集的条件展开测试;
(2)对采集的SERS光谱进行功率-时间归一化操作,并计算一阶导差分谱图;将该谱图与事先建立好的SERS数据库合并得到新的光谱数据集;
(3)将光谱数据集利用主成分分析算法计算主成分得分矩阵;
(4)绘制主成分1(PC1)、主成分2(PC2)的散点图,标明数据库中的散点分类和所测试光谱对应的散点,所获得的人体尿液SERS主成分分析散点分布图即是本发明测量结果。
本发明的一体化SERS溶胶检测套件,具有重量轻、体积小、十分便于溶胶的储存、运输和使用等优点,该套件用于采集人体尿液SERS谱图,并结合主成分分析算法获得直观的散点分布图,可直接判断人体能量摄入量的水平;所得的测试数据和数值计算数据都是基于客观测试分析所得,避免了人为主观因素带来的误差;尿液测试无需前处理,光谱测试时间耗时短,光谱数据分析可在1分钟内得到结果,整体测试分析时间不超过2分钟。因此本发明在生物医学领域具有非常广阔的应用前景。
实施例1
(1)银纳米溶胶的制备:银纳米溶胶合成采用柠檬酸钠还原法,将100mL 1.5mM硝酸银溶液加热煮沸,再一次性加入5mL 1wt%的柠檬酸钠溶液,继续煮沸3小时,即可得到银溶胶。
(2)溶胶测试小管装入预装液:用移液枪移取80uL纳米粒子聚集剂于溶胶测试小管的下层中,用弹性隔膜将其密封并用热缩管连接上下两层高硼硅玻璃小管。再用移液枪移取制备好的300uL银纳米溶胶于溶胶测试小管的上层中,完成后盖上软橡胶帽,完成整个装预装液过程。
(3)尿液收集:实验A组参试人员共有11人,摄入能量2300千卡/天;实验B组参试人员共有11人,摄入能量1500千卡/天。每组实验为期3天,收集受试者晨尿,每份3mL,为了达到人体代谢平衡,前两天作为代谢缓冲期,不予收集样本,而选择第三天稳定期的尿液样本进行信号采集。尿液无需任何前处理,可直接用于后续的检测。
(4)采集SERS信号:用移液枪吸取收集到的200uL尿液同时用移液枪头戳破溶胶测试小管中的上层顶端的弹性隔膜,与其中的纳米增强粒子混匀,再戳破溶胶测试小管中弹性隔膜5与溶胶测试小管下层中纳米粒子聚集剂混匀,最后用便携式拉曼仪器收集溶胶测试小管下层在300~1200cm
(5)建立尿液的SERS数据库:对收集到的两组尿液的SERS谱图分别计算平均光谱,如图4所示。对所有SERS谱图进行主成分分析,在建立数据库前,为了避免采集过程的信号波动带来偏差,需要对所有光谱数据进行归一化操作,即将光谱强度值除以采集时间、除以采集功率。所获得散点分布图如图5所示。
(6)基于尿液SERS数据库的主成分分析:采集待测人员的尿液SERS光谱再进行功率、时间归一化及差分扣除背景预处理。对处理后的数据与SERS数据库合成并进行主成分分析,获得散点分布图,标明测试散点在图中位置。
实施例2
(1)银纳米溶胶的制备:银纳米溶胶合成采用柠檬酸钠还原法,将100mL 2mM硝酸银溶液加热煮沸,再一次性加入5mL 1wt%的柠檬酸钠溶液,继续煮沸3小时,即可得到银溶胶,银纳米粒子的粒径在80~100nm,银纳米粒子的紫外可见吸收峰位于404nm处,如附图2、图3所示。
(2)溶胶测试小管装入预装液:用移液枪移取50uL纳米粒子聚集剂于溶胶测试小管的下层中,用弹性隔膜将其密封并用热缩管连接上下两层高硼硅玻璃小管。再用移液枪移取制备好的300uL银纳米溶胶于溶胶测试小管的上层中,完成后盖上软橡胶帽,完成整个装预装液过程。
(3)尿液收集:实验A组参试人员共有11人,摄入能量2300千卡/天;实验B组参试人员共有11人,摄入能量1500千卡/天。每组实验为期3天,收集受试者晨尿,每份3mL,为了达到人体代谢平衡,前两天作为代谢缓冲期,不予收集样本,而选择第三天稳定期的尿液样本进行信号采集;尿液无需任何前处理,可直接用于后续的检测。
(4)采集SERS信号:用移液枪吸取收集到的200uL尿液同时用移液枪头戳破溶胶测试小管中的上层顶端的弹性隔膜,与其中的纳米增强粒子混匀,再戳破溶胶测试小管中弹性隔膜5与溶胶测试小管下层中纳米粒子聚集剂混匀,最后用便携式拉曼仪器收集溶胶测试小管下层在300~1200cm
(5)建立尿液的SERS数据库:对收集到的两组尿液的SERS谱图分别计算平均光谱。对所有SERS谱图进行主成分分析,在建立数据库前,为了避免采集过程的信号波动带来偏差,需要对所有光谱数据进行归一化操作,即将光谱强度值除以采集时间、除以采集功率。
(6)基于尿液SERS数据库的主成分分析:采集待测人员的尿液SERS光谱再进行功率、时间归一化及差分扣除背景预处理。对处理后的数据与SERS数据库合成并进行主成分分析,获得散点分布图,标明测试散点在图中位置。
上述实施例仅用来进一步说明本发明的一种能量摄入量的SERS快速分析方法,但本发明并不局限于实施例,凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均落入本发明技术方案的保护范围内。
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