香草扁桃酸半抗原衍生物及其合成方法，香草扁桃酸抗原及其制备方法，抗体及试剂盒

摘要

本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种香草扁桃酸半抗原衍生物及其合成方法，香草扁桃酸抗原及其制备方法，抗体及试剂盒。一种香草扁桃酸半抗原衍生物，该衍生位点未破坏VMA原分子的羟基和羧基基团，未改变VMA分子的带电性。所述香草扁桃酸半抗原衍生物的合成方法易于操作，香草扁桃酸半抗原衍生物的收率在27.69%以上，纯度在90.56%以上。将香草扁桃酸半抗原衍生物制备成抗原、抗体，抗体可用于临床上快速检测尿液中香草扁桃酸的浓度，且香草扁桃酸抗体具有较高的特异性和准确度。

说明书

技术领域

本申请涉及生物技术领域，更具体地涉及香草扁桃酸半抗原衍生物及其合成方法，香草扁桃酸抗原及其制备方法，抗体及试剂盒。

背景技术

香草扁桃酸(Vanilmandelic acid，VMA)是肾上腺髓质激素儿茶酚胺(CA)类物质的终末代谢产物，由尿液排出。当人体患有神经鞘肿瘤如嗜络细胞瘤和神经母细胞瘤时，人体尿液中VMA的含量显著升高。在临床上，对于上述疾病24h尿液中VMA浓度的检测是一种非常有效的筛查方法。

目前，香草扁桃酸的传统检测分析主要有分光广度法，重氮法，偏高碘酸钠氧化法等，普遍存在灵敏度低等缺点。据报道，利用液相色谱串联质谱的检测检测方法检测VMA可以提高灵敏度，但是相关设备较为昂贵，且需要对样品进行衍生化和前处理，操作复杂，难以在临床大规模推广，不适合于常规筛查。此外，尿液中含有多种儿茶酚胺的代谢产物，结构上同VMA高度相似，需要一种特异性的物质准确地检测尿液中VMA的浓度。

因此，需要一种灵敏度高、特异性强和操作简单的检测方法，更加快速，更加准确地检测尿液中香草扁桃酸的浓度。

发明内容

为了给出一种灵敏度高、特异性强和操作简单的VMA的检测方法，本申请提供了一种香草扁桃酸半抗原衍生物及其合成方法，香草扁桃酸抗原及其应用。

第一方面，本申请提供了一种香草扁桃酸半抗原衍生物，其结构式如式Ⅰ所示，

本申请提出了一种香草扁桃酸半抗原衍生物。所述香草扁桃酸半抗原衍生物的衍生位点位于香草扁桃酸的甲氧基位置，该衍生位点远离香草扁桃酸的特征结构，没有破坏VMA原分子的羟基和羧基基团，避免了对VMA分子带电性的改变，未影响VMA原分子的性能。利用本申请中香草扁桃酸半抗原衍生物制备香草扁桃酸抗原，再利用香草扁桃酸抗原制备香草扁桃酸抗体，所述香草扁桃酸抗体同多种香草扁桃酸类似物没有交叉，对VMA具有较强的特异性，能够更加准确的识别尿液中VMA，具有很好的临床应用性和市场前景。

第二方面，本申请提供了一种香草扁桃酸半抗原衍生物的合成方法，包括以下步骤，S1：使3-甲氧基-4-羟基扁桃酸与氯化苄反应，得到中间体I；

S2：在-78℃至-70℃温度下，使中间体I发生亲核取代反应，得到中间体II；

S3：使中间体II与丁二酸酐反应，得到中间体III，

S4：使中间体III发生氢化还原反应，得到式I化合物。

在一个实施方案中，所述步骤S1的反应体系中，使用乙腈作为溶剂，使用碳酸钾使反应体系呈弱碱性；反应体系在室温下发生反应。

在一个实施方案中，所述步骤S2的亲核取代反应中，使用二氯甲烷作为溶剂，使用三溴化硼作为路易斯酸(Lewis酸)。

在一个实施方案中，步骤S2包括：首先称取所述中间体I，再加入二氯甲烷，在干冰丙酮浴的作用下，将体系降温到-78℃至-70℃，继续加入三溴化硼和二氯甲烷，使体系保持在-78℃至-70℃温度下发生反应；反应结束后将反应混合物加入到冰水中，最后将碳酸氢钠加入到冰水中，有固体析出，经过滤得到中间体II；

在一个实施方案中，所述步骤S3的反应中使用吡啶作为溶剂。

在一个实施方案中，步骤S3包括：称取所述中间体II，加入吡啶和丁二酸酐，反应体系在室温下发生反应，反应结束后将反应混合物加入到水中，经过滤得到中间体III；

在一个实施方案中，所述步骤S4的氢化还原反应使用钯碳作为催化剂，使用甲醇作为溶剂。

在一个实施方案中，步骤S4包括：称取所述中间体III，加入甲醇，钯碳，在氢气条件下，反应体系在室温下发生反应，反应结束后过滤，柱层析纯化，得到香草扁桃酸半抗原衍生物，其结构式如式I所示。

在一个实施方案中，香草扁桃酸半抗原衍生物的合成路线如下所示，

利用本申请所述的合成路线制备香草扁桃酸半抗原衍生物，能够以高收率和高纯度获得香草扁桃酸半抗原衍生物，在一些实施方案中，香草扁桃酸半抗原衍生物的收率可达到41.95％以上，纯度在99.65％以上。

在一个实施方案中，所述香草扁桃酸半抗原衍生物的合成操作包括以下步骤：

S1：分别称取3-甲氧基-4-羟基扁桃酸和碳酸钾加入到反应瓶中，再加入乙腈和氯化苄，反应体系在室温下反应12小时，TLC检测反应结束，反应结束后将反应混合物加入到水中，有固体析出，过滤，烘干滤饼，得到中间体I。

S2：称取由步骤S1制备的中间体I，将所述中间体I加入到反应瓶中，再加入二氯甲烷，将体系降温到-78℃至-70℃，加入三溴化硼和二氯甲烷，使体系保持在-78℃至-70℃温度下发生反应，TLC检测反应结束，反应结束后将反应混合物加入到冰水中，加入碳酸氢钠，有固体析出，过滤，烘干滤饼，得到中间体II。

S3：称取由步骤S2制备的中间体II，将所述中间体II加入到反应瓶中，然后加入吡啶和丁二酸酐，反应体系在室温下反应12小时，TLC检测反应结束，将反应混合物加入到水中，有固体析出，过滤，烘干滤饼，得到中间体III。

S4：称取由步骤S3制备的中间体III，将所述中间体III加入到反应瓶中，再加入甲醇和钯碳，在氢气条件下，反应体系在室温下反应12小时，TLC检测反应结束，过滤，滤液蒸干得粗品，柱层析纯化，得到香草扁桃酸半抗原衍生物。

在一个实施方案中，所述3-甲氧基-4-羟基扁桃酸和所述氯化苄的摩尔比为1:(1-3)。

在一个具体实施方案中，所述3-甲氧基-4-羟基扁桃酸和所述氯化苄的摩尔比为1:2。

第三方面，本申请提供了一种香草扁桃酸抗原。香草扁桃酸抗原是通过采用载体蛋白和本申请所述的香草扁桃酸半抗原衍生物进行共价偶联制备得到。

在本申请中，香草扁桃酸衍生物属于小分子化合物，不具备免疫原性。通过本申请所述香草扁桃酸抗原的制备方法，将所述香草扁桃酸衍生物同载体蛋白共价偶联得到香草扁桃酸抗原，使香草扁桃酸衍生物具备免疫原性。

所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白和兔血清白蛋白。

第四方面，本申请提供了一种香草扁桃酸抗原的制备方法，包括以下步骤：

在有机溶剂的存在下，将本申请所述的香草扁桃酸半抗原衍生物和交联剂混合，得到溶液A；将载体蛋白溶液在缓冲溶液中，得到溶液B；

将所述溶液A和所述溶液B混合并搅拌，得到抗原混合物；

对所述抗原混合物进行透析，即得到香草扁桃酸抗原。

在一个实施方案中，所述有机溶剂为二甲基亚砜。

在一个实施方案中，所述缓冲溶液为PBS。

在一个实施方案中，所述交联剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐。

第五方面，本申请提供了一种香草扁桃酸抗体。所述香草扁桃酸抗体通过本申请所述的香草扁桃酸抗原制备而成。

在本申请中，香草扁桃酸抗体的制备包括以下步骤：将香草扁桃酸抗原进行稀释，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，在动物体内进行首次免疫，所述动物包括但不限于小鼠、兔和羊。间隔一段时间后，采用弗氏不完全佐剂和香草扁桃酸抗原等体积混合乳化，再次在动物体内免疫。免疫后，取脾细胞和骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合，通过间接竞争ELISA筛选能够特异性识别香草扁桃酸的抗体。再经过后期的克隆化，香草扁桃酸抗体可分为单克隆抗体和多克隆抗体。

第六方面，本申请提供了一种试剂盒。

本申请制备的香草扁桃酸抗体具有较强的特异性，对尿液中内源性的几种类似物的交叉反应非常低，能够准确地识别尿液中香草扁桃酸。将所述香草扁桃酸抗体制备成试剂盒，试剂盒可用于对尿液中香草扁桃酸浓度的检测，能够快速的进行检测，操作简单，在临床上可以实现大规模的推广使用。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请提供了一种香草扁桃酸半抗原衍生物，该衍生位点未破坏VMA原分子的羟基和羧基基团，未改变VMA分子的带电性，未影响VMA的性能；

2、本申请提供了一种香草扁桃酸半抗原衍生物的合成方法，合成方法简单，且香草扁桃酸半抗原衍生物的收率在27.69％以上，纯度在90.56％以上；在一些实施方案中，香草扁桃酸半抗原衍生物的收率可以在41.95％以上，纯度在99.65％以上；

3、本申请将香草扁桃酸半抗原衍生物与载体蛋白结合，使香草扁桃酸衍生物具备免疫原性，得到香草扁桃酸抗原；再将香草扁桃酸抗原制备得到香草扁桃酸抗体，所述香草扁桃酸抗体可用于临床上，香草扁桃酸抗体具有较强的特异性，能够准确地识别并检测尿液中香草扁桃酸的浓度，操作简单且灵敏度高。

附图说明

图1为香草扁桃酸半抗原衍生物的结构式；

图2为香草扁桃酸半抗原衍生物的合成路线图；

图3为磁微粒发光法测定香草扁桃酸浓度同LC-MS法相关性分析图；

图中，1为中间体I；2为中间体II；3为中间体III；4为香草扁桃酸半抗原衍生物。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

原料

本申请中所用原料的来源如表1所示。

表1原料来源表

在表1中未涉及的原料均可通过市售获得，无特殊要求。

实施例

实施例1

所述香草扁桃酸半抗原衍生物的合成方法，包括以下步骤，

S1：称取1g(5mmol)的3-甲氧基-4-羟基扁桃酸和2.76g(20mmol)的碳酸钾加入到反应瓶中，再加入20mL的乙腈和1.27g的(10mmol)氯化苄，反应体系在室温下反应12小时，TLC检测反应结束，将反应混合物加入到100mL的水中，有固体析出，过滤，烘干滤饼，得到0.8g中间体I，Ms+18＝396。

S2：称取由步骤S1制备的中间体I，将1.89g(5mmol)所述中间体I加入到反应瓶中，再加入50mL的二氯甲烷，将反应体系降温到-78℃，加入5mL的三溴化硼，反应体系保持-78℃温度反应3h，TLC检测反应结束，将反应混合物加入到100mL的冰水中，再加入碳酸氢钠，有固体析出，过滤，烘干滤饼，得到0.62g中间体II，Ms+1＝365。

S3：称取由步骤S2制备的中间体II，将1.32g的(5mmol)中间体II加入到反应瓶中，然后加入10mL的吡啶和0.5g的(5mmol)丁二酸酐，反应体系在室温下反应12小时，TLC检测反应结束，将反应混合物加入到100mL的水中，有固体析出，过滤，烘干滤饼，得到0.49g中间体III，Ms-1＝463。

S4：称取由步骤S3制备的中间体III，将1.16g的(2.5mmol)中间体III加入到反应瓶中，再加入50mL的甲醇和200mg的钯碳；在氢气条件下，反应体系在室温反应12小时，TLC检测反应结束，过滤，滤液蒸干得粗品，柱层析纯化，得到300mg的香草扁桃酸半抗原衍生物。

利用氢核磁共振(400MHZ，DMSO-d6)对制备的香草扁桃酸半抗原衍生物进行光谱扫描，结果如下：δ12.68-12.70(s，1H)，δ，12.11-12.13(s，1H)，δ9.34-9.36(s，1H)，δ6.99-7.05(m，2H)，δ6.79-6.82(m，1H)，δ5.51(s，1H)，δ5.10-5.13(bar，1H)，δ2.70-2.82(m，4H).LCMS(M+1)＝285。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于，实施例2的步骤S4中的反应条件是：将甲醇更换为乙醇。得到242mg的香草扁桃酸半抗原衍生物。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于，实施例3的步骤S4中的反应条件是：将甲醇更换为丙醇。得到208mg的香草扁桃酸半抗原衍生物。

实施例4

实施例4与实施例1的区别在于，实施例4的步骤S4中的反应条件是：S4：称取由步骤S3制备的中间体III，将1.16g的(2.5mmol)中间体III加入到反应瓶中，再加入30mL的四氯化碳，20mL的乙腈，100mg的四氧化钌和120mg的偏高碘酸钠。体系室温反应12小时，TLC检测反应结束，过滤，滤液蒸干得粗品，柱层析纯化。得到198mg的香草扁桃酸半抗原衍生物。

对上述实施例1-4进行产率的计算及纯度的检测，具体检测结果如表2所示。其中香草扁桃酸半抗原衍生物的产率可通过公式(1)计算得出。香草扁桃酸半抗原衍生物的纯度由HPLC测定。

HPLC测定纯度的具体过程：流动相A：5mM NH4HCO3；流动相B：Acetonitrile；分析柱Shim-pack-Scepter C18-120。

表2产率及纯度的检测结果

结合实施例1-4并结合表2可以看出，实施例1-4中香草扁桃酸半抗原衍生物的产率在27.69％以上，香草扁桃酸半抗原衍生物的纯度在90.56％以上。尤其是实施例1，当步骤S4中采用甲醇时，香草扁桃酸半抗原衍生物的产率为41.95％，纯度为99.65％。

实施例5

香草扁桃酸抗原的制备方法包括以下步骤：

a.称取22mg由实施例1制备的香草扁桃酸半抗原衍生物，加入2mL的二甲基亚砜进行溶解；

b.称取15mg的交联剂，将交联剂溶解在100μL水中，然后加入到步骤a中，室温反应1h，得到A液；所述交联剂为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐；

c.称取25mg的载体蛋白溶解在5mL的PBS中，得到B液；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；

d.将所述A液和所述B液进行混合，室温搅拌2h，得到草扁桃酸抗原混合物；

e.对草扁桃酸抗原混合物透析4次，得到香草扁桃酸抗原，在-20℃冷冻保存。

实施例6

香草扁桃酸单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：采用杂交瘤细胞融合技术进行制备。

首先，利用PBS缓冲液将实施例5制备的香草扁桃酸抗原稀释到1mg/mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全，按照0.1mg/只的剂量在小鼠体内进行首次免疫；然后，间隔4周后，取1mg所述的香草扁桃酸抗原同弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后，按照0.1mg/只的剂量在小鼠体内进行再次免疫。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行效价及竞争测定，其中杂交瘤细胞的效价为128000。

筛选得到4株细胞(5A1，12C1，2B3，4D7)，小鼠腹水制备，并Protein A/G纯化。测定抗体对香草扁桃酸及几种内源性类似物的结合能力，具体检测结果如表3所示。

表3香草扁桃酸抗体特异性分析

注：交叉反应率＝Ic50 VMA/Ic50代谢物*100％

结合表3可以看出，2B3表现出对香草扁桃酸较强的特异性，并且对内源性的几种类似物交叉反应非常低，能够准确地识别出尿液中香草扁桃酸并能够检测出香草扁桃酸的浓度。

实施例7

磁微粒化学发光法香草扁桃酸尿液检测方法的建立：

1)50mg Dynal beads M270 COOH磁珠，稀释在2mL 50mM MES pH6.0缓冲液中，加入1mg由实施例6制备的香草扁桃酸抗体2B3，混匀后，加入2mg EDC，室温震荡反应2h；

2)磁吸去除上清，加入TBST室温反应2h；

3)磁吸去除上清，加入TBST，稀释到0.4mg/mL，命名为磁微粒工作液，2-8度保存待用；

4)1mg ALP溶解在1mL PBS中，加入0.5mg香草扁桃酸衍生物10分子(溶解在100ulDMSO中)，混合均匀，加入1mg EDC固体，室温混匀2h。透析到PBS中，稀释到1ug/mL，命名为酶标工作液；

5)反应程序：20ul样本+40ul磁微粒液工作液+50ul酶标工作液，37度孵育反应5min，清洗，加入AMPPD发光液显色；

选取临床46例香草扁桃酸尿液样本，对比本发明构建的磁微粒化学发光法同LC-MS法的测定香草扁桃酸结果进行比对。

参照图3，磁微粒发光法测定香草扁桃酸浓度同LC-MS法相关性分析图，得到的线性方程为：y＝1.051x-0.5965，其中R

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。