一种来源于长形芽孢杆菌的水解酶及其修复土壤莠去津污染的方法

摘要

本发明公开了一种来源于长形芽孢杆菌的水解酶及其修复土壤莠去津污染的方法，通过人工合成技术修改编码TRZN的DNA序列，构建抵抗莠去津危害的基因突变型，用于受到莠去津农药污染土壤的植物修复。所述来源于长形芽孢杆菌的TRZN水解酶，是一种三嗪水解酶，编码序列含有1371个核苷酸，具有广泛的底物范围。本发明通过修改编码TRZN的DNA序列，构建抵抗莠去津危害的基因突变型，并将重组基因转入到拟南芥植株，评估转基因植株抵抗莠去津毒害的耐受性，最终通过与野生型植株的对比试验，证明了转基因型植株具备更高的抗莠去津耐性。本发明不但大幅度提升了转基因生物修复莠去津农药污染土壤的效率，并能够筛选改良抵抗莠去津类农药危害的高等植物。

说明书

技术领域

本发明涉及水解酶技术领域，具体为一种来源于长形芽孢杆菌的水解酶及其修复土壤莠去津污染的方法。

背景技术

农药污染，是指农药使用后残存于生物体、农副产品及环境中的微量农药原体、有毒代谢产物、降解产物及杂质超过农药的最高残留限制而形成的污染现象。农药施用后，一部分附着于植物体上，或渗入株体内残留下来，使粮、菜、水果等受到污染；另一部分散落在土壤上(有时则是直接施于土壤中)或蒸发、散逸到空气中，或随雨水及农田排水流入河湖，污染水体和水生生物。农产品的残留农药通过饲料，污染禽畜产品。农药残留通过大气、水体、土壤、食品，最终进入人体，引起各种慢性或急性病害。

莠去津是当前国内外使用最广泛的一种除草剂农药，是一种选择性内吸传导型芽前土壤处理除草剂，也可作芽后茎叶处理。主要通过植物根部吸收并向上传导，抑制植物的光合作用，使其枯死。它的杀草谱较广，可防除多种一年生禾本科和阔叶杂草。通常加工成可湿性粉剂和悬浮剂使用，适用于玉米、水稻、果树、苗圃、林地防除马唐、稗草、狗尾草、莎草、看麦娘、蓼、藜、十字花科、豆科杂草，对某些多年生杂草也有一定抑制作用。莠去津由Geigy化学公司1952年研制开发,1958年申请瑞士专利,1959年投入商业生产。由于该除草剂具有优良的杀草功效且价格便宜,很快在世界各国得到了广泛地应用和推广,成为世界上使用最为广泛也是最重要的除草剂之一。目前,莠去津在国内外杂草防除上仍占有重要地位,世界上有80多个国家在使用这种除草剂。在美国中部,每年要使用数千吨这种除草剂于玉米田中,占其除草剂使用量的60％。在我国莠去津及其混剂仍作为农田最重要的除草剂。

莠去津喷洒到土壤和作物表面后，仅有一小部分落到靶标上，大部分进入土壤，土壤或沉积物中的残留主要通过地表径流、淋溶、湿沉降等途径进入地表水或向下沉积进入地下水，从而对水生生态环境和人类饮用水源构成威胁。此外，少量莠去津可以通过挥发和浮尘进入大气，并通过干沉降和湿沉降返回地面。因此，它对生态环境的影响具有全球性。莠去津残留在土壤中的时间很长，其作为内分泌干扰物的活性会给动植物和人类带来危害。已经证明，它可以在土壤中持续数十年。这意味着多年来，喷洒莠去津的农田可能不会用于种植对莠去津敏感的作物。此外，受莠去津污染的地下水可以流入河流和湖泊，可以伤害水生植物和动物，并污染饮用水。许多研究表明，莠去津扰乱内分泌素，导致两栖动物和鱼类的异常发育。莠去津还被证明可以降低雄性大鼠的睾酮水平，人们担心它会影响人类。因此，有必要建立从环境中去除这种毒素的方法与技术。

利用生物合成技术从长形芽孢杆菌中产生TRZN水解酶，修改编码TRZN酶的DNA序列，构建抵抗莠去津危害的基因突变型，并将重组基因转入到拟南芥植株，提升转基因植株抵抗莠去津毒害的耐受性，该水解酶对于培育抗莠去津的植物品种非常重要，为植物修复土壤莠去津农药污染提供了新的载体与技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于由长形芽孢杆菌生产一种TRZN水解酶，修改编码TRZN的DNA序列，构建抵抗莠去津危害的基因突变型，并将重组基因转入到植物体，提升转基因植株抵抗莠去津毒害的耐受性。

本发明的目的在于提供一种来源于长形芽孢杆菌的水解酶，来源于长形芽孢杆菌生产的TRZN水解酶，是一种三嗪水解酶，编码序列含有1371个核苷酸，所述来源于长形芽孢杆菌生产的TRZN水解酶从s-三嗪环中水解置换氯取代基来引发除草剂莠去津的细菌代谢，所述来源于长形芽孢杆菌生产的TRZN水解酶，是通过人工合成技术修改编码TRZN的DNA序列。

本发明还提供了一种权利要求1所述的来源于长形芽孢杆菌的水解酶修复土壤莠去津污染的方法，步骤如下：

步骤1：验证转基因的长形芽孢杆菌能够产生TRZN，从Genbank获取金黄色节杆菌TC1三嗪氯水解酶的DNA序列，并用Genscript将其修饰成大肠杆菌，同时添加组氨酸标记以帮助检测和纯化重组蛋白，然后，将这一修改版本克隆到S.Elongatus表达载体psyn1/d-topo中，并通过标准程序将其转化为S.Elongatus基因组的NS1位点，对照分析野生型和转基因长形芽孢杆菌抵抗莠去津的能力，通过测定光合作用，验证TRZN酶对细长S.elongatus细胞免受莠去津危害的保护作用；

步骤2：修改编码TRZN的DNA序列，基于细菌细胞中工作良好的TRZN，修改其DNA序列，使其在植物中发挥作用，允许植物识别从何处开始和停止复制TRZN蛋白，从植物病毒中添加控制序列，利用花椰菜花叶病毒的35S启动子，从rtl2质粒复制并将其直接连接到起始密码子前面，建立植物细胞开始复制蛋白质的指令，同时，通过添加一个植物终止符，指示植物细胞停止复制TRZN，启动子和终止子序列都将通过标准的重组DNA技术添加，由此产生的重组DNA分子将通过标准程序在大肠杆菌中转化和分析；

步骤3：将重组基因转入到拟南芥植株，通过PCR和限制性消化构建正确的结构后，将重组基因转移到长形芽孢杆菌gv3101所含的质粒中，再利用长形芽孢杆菌将其转化为植物细胞，通过花浸法将所需质粒引入拟南芥植株，将获得的转基因种子播种在含有50mg/ml卡那霉素的琼脂平板上进行鉴定，并利用检测转基因的引物进行PCR验证，确认转基因植物通过标准程序制造出TRZN蛋白；

步骤4：评估转基因植物抵抗莠去津毒害的能力，在莠去津的存在下，通过比较转基因植物与野生植物的光合速率测试莠去津是否影响光合作用，用氧电极和Licor LI-6400光合作用监视器测量相同浓度的莠去津，同时，比较用莠去津处理的转基因植物和野生型植株的叶绿素荧光参数，评估目标植株与对照植株抵抗莠去津毒害的能力；

步骤5：测试转基因植物降解莠去津的有效性，通过评估转基因植物抵抗莠去津毒害的结果表明转基因植物受到了莠去津的保护，进一步通过薄层色谱法和高效液相色谱法在植物中寻找羟莠去津，并验证转基因植物的提取物是能够在体外将莠去津转化为羟莠去津；

步骤6：转基因拟南芥植株抗性验证，然后通过野生型和转基因型植株的耐受性对比实验，将两种株型移栽到含有0.5mg/kg莠去津的土壤中，2周后的结构显示与转基因植株相比，野生型明显受到抑制，株高和地上部生物量明显降低，根系不生长，叶片数量减少，而转基因型植株受到抑制较小，结果表明TRZN酶显著提高了拟南芥植株对莠去津毒害的耐受性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明建立了一种表达TRZN酶的转基因型拟南芥植株，用于受到莠去津农药污染土壤的植物修复。本发明在验证长形芽孢杆菌能够产生TRZN水解酶的基础上，修改编码TRZN的DNA序列，构建抵抗莠去津危害的基因突变型，并将重组基因转入到拟南芥植株，评估转基因植株抵抗莠去津毒害的耐受性，最终通过与野生型植株的对比试验，在生长特性和光合能力方面测试转基因植物降解莠去津的有效性。本发明不但是利用转基因生物修复农药污染土壤的创新性成果，并可能筛选出能够抵抗莠去津类农药危害的高等植物。

附图说明

图1为TRZN核苷酸序列图；

图2为编码的氨基酸序列图；

图3为TrzN水解酶的结构图；

图4为由TrzN水解酶引发的莠去津代谢途径图；

图5为野生型植株和转基因型植株对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

本发明所用的试验材料及其来源包括：

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型拟南芥Columbia，23℃人工气候箱培育，16h光照培养。

本发明所涉及的双花椰菜花叶病毒(camv)的prtl2载体、ge类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、PCR buffer和DNA marker均购自生物工程大连有限公司。

本发明所使用的所有化学试剂均购自上海国药化学试剂有限公司。

本发明的具体实施例如下：

(1)获取基因资源:从土壤中提取的长形芽孢杆菌获得TC1的三嗪氯水解酶(TRZN)基因序列。用Genscript对TRZN基因序列进行修饰，使其在大肠杆菌和拟南芥中得到最佳表达。

(2)准备植物启动子和终止子：从包含一个双花椰菜花叶病毒(camv)的prtl2载体中获得35S启动子，允许其在所有植物组织中表达TRZN。准备细胞质靶向TRZN插入物并开展细胞质靶向TRZN插入物的验证。

(3)准备细胞器靶向TRZN插入物：将TRZN靶向线粒体，定位叶绿体和过氧化物酶体转运肽序列，并将其与TRZN基因连接，以靶向其表达到所提出的细胞器。对于叶绿体和线粒体转运肽，采用生物信息学方法鉴定和定位col 0a.thaliana基因组DNA的序列。

(4)获得转运肽序列：用外部引物扩增含有线粒体和叶绿体转运肽以及每个转运肽序列3'和5'端侧翼序列的基因组DNA，用外部引物对叶绿体转运肽进行rbcs-external5'和rbcs-external 3'扩增，用rpoy-external 5'和rpoy-external 3'扩增有丝分裂细胞。

(5)分离线粒体和叶绿体转运肽序列:为了分离线粒体和叶绿体转运肽序列并添加合适的克隆限制位点，使用具有500bp侧翼序列的叶绿体和线粒体转运肽DNA作为模板，使用合适的内部引物(rpoy interna)进行q5高保真DNA聚合酶(neb)反应。

(6)克隆zero Blunt TOPO vector：按照Zero Blunt Topo PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher)程序执行Topo克隆反应，从线粒体转运肽Blunt II-Topo载体转化板中选择菌落进行菌落PCR，用Onetaq聚合酶(neb)进行菌落PCR并鉴定具有正确插入物的菌落。

(7)线粒体和叶绿体转运肽与TRZN的验证：从TRZN的线粒体转运肽+pet15b+c6h、TRZN的线粒体转运肽+pet15b+n6h、TRZN的叶绿体转运肽pet15b+c6h和TRZN转化板的叶绿体转运肽+pet15b+n6h中选择菌落进行菌落PCR。

(8)克隆过渡肽+TRZN插入prtl2并验证：在LB氨苄西林(100μg/ml)平板上选择转化剂，利用Onetaq聚合酶(neb)对每个转化板上的菌落进行菌落PCR。通过过氧化物酶体转运肽对具有正确插入物的菌落进行鉴定，并对线粒体转运肽的存在进行鉴定。

(9)pORE-02的克隆与验证：从拟南芥生物资源中心获得植物转化载体，对从每个转化板中选择的菌落进行Onetaq菌落PCR，使用PCR引物35S启动子和逆转录TRZN-qpcr对pORE-02进行克隆与验证。

(10)克隆syn_1/d-topo载体:利用Genart-Syn-Topo克隆手册(ThermoFisher)描述的程序，将纯化的PCR产物克隆到psyn_1/d-Topo中，采用载体与PCR产物进行拓扑克隆反应，制备TRZN插入物，优化其在大肠杆菌中的表达。

(11)验证优化的TRZN:选择阳性菌落，用奇霉素(100μg/ml)在结核肉汤中培养过夜。采用碱解法提取DNA，采用Onetaq聚合酶和引物进行PCR反应，以进一步确认在syn_1/d-topo载体中存在大肠杆菌优化的TRZN，并获得重组基因。

(12)将重组基因转入到拟南芥植株:将重组基因转移到长形芽孢杆菌gv3101所含的质粒中，再利用长形芽孢杆菌将其转化为植物细胞。通过花浸法(the floral dipmethod)将所需质粒引入拟南芥植株，将获得的转基因种子播种在含有50mg/ml卡那霉素的琼脂平板上进行鉴定，并利用检测转基因的引物进行PCR验证，确认转基因植物通过标准程序制造出TRZN蛋白。

(13)评价转基因植物对莠去津的耐受性：在标准条件下，通过比较转基因植物与野生植物的光合速率在750纳米和665纳米的吸光度下估算细胞生长和叶绿素a含量，同时，比较用莠去津处理的转基因植物和野生型植物的叶绿素荧光参数，评估目标植株与对照植株抵抗莠去津毒害的能力。

(14)测试转基因植物降解莠去津的有效性:通过薄层色谱检测法和高效液相色谱法在植物中寻找羟莠去津，并测试转基因植物的提取物是否能在体外将莠去津转化为羟莠去津，评价目标植物降解莠去津的有效性。

(15)最终开展野生型和转基因型拟南芥植株的耐受性对比实验，将两种株型移栽到含有0.5mg/kg莠去津的土壤中，2周后的结构显示与转基因植株相比(图5)，野生型明显受到抑制，株高和地上部生物量明显降低，根系不生长，叶片数量减少，而转基因型植株受到抑制较小。结果表明TRZN酶显著提高了拟南芥植株对莠去津毒害的耐受性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。