基于分子标志物的肥厚型心肌病诊断产品及其应用

摘要

本发明公开了基于分子标志物的肥厚型心肌病诊断产品及其应用，所述分子标志物为SFRP1和IER3联合，本发明还提供了用于早期诊断肥厚型心肌病的相关产品，所述产品中包含检测分子标志物SFRP1和IER3的试剂，该产品能够用于肥厚型心肌病的准确诊断中，具有较高的特异性和敏感性，本发明为肥厚型心肌病的早期诊断提供了一种新思路，具有重要的推广应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及基于分子标志物的肥厚型心肌病诊断产品及其应用。

背景技术

肥厚型心肌病作为最常见的常染色体显性遗传性心脏病，是青少年和运动员发生心源性猝死最常见的病因(Kirchhof P,Benussi S,Kotecha D,et al.2016ESCGuidelines for the management of atrial fibrillation developed incollaboration with EACTS[J].Kardiologia Polska(Polish Heart Journal),2016,74(12):1359-1469.)。肥厚型心肌病的主要形态学特征是无其他继发因素导致的心室壁异常的肥厚，其形态学及临床表现均具有高度的异质性。形态学方面，其肥厚部位可位于室间隔、心尖部、左心室中部及左室弥漫型心肌肥厚(Andersson T,Magnuson A,Bryngelsson IL,et al.All-cause mortality in 272 186patients hospitalized with incidentatrial fibrillation 1995–2008:a Swedish nationwide long-term case–controlstudy[J].European heart journal,2013,34(14):1061-1067.)。由于肥厚型心肌病的症状不具有特异性，早期肥厚型心肌病心脏彩超检查也不易诊断，所以对于肥厚型心肌病的早期临床诊断较为困难。

目前，肥厚型心肌病的临床诊断符合2014年欧洲心脏病学会(European Societyof Cardiology，ESC)发布的肥厚型心肌病诊治指南的诊断标准，肥厚型心肌病的诊断标准在成人中为：任意成像(超声心动图、心脏磁共振成像或计算机断层扫描)检测结果显示，并非完全因心脏负荷异常引起的左心室心肌某节段或多个节段室壁厚度≥15mm；在儿童中为左心室室壁厚度≥预测平均值+2×标准差；对于肥厚型心肌病患者的一级亲属，若心脏成像检测结果发现无其他已知原因的左心室室壁某节段或多个节段厚度≥13mm，即可确诊为肥厚型心肌病。药物治疗是目前临床最常见的肥厚型心肌病的治疗方式，主要类型包括各种抗心律失常药物、抗凝剂及利尿剂。抗心律失常药物包括β受体阻滞剂、非二氢吡啶类钙拮抗剂、钠通道阻滞剂、胺碘酮；抗凝剂包括华法林等，对于合并房颤的肥厚型心肌病患者，服用华法林可降低缺血性卒中的风险；对使用β受体阻滞剂或非二氢吡啶类钙拮抗剂治疗后心力衰竭症状仍未明显缓解的肥厚型心肌病患者，加用利尿剂一定程度上有望改善患者症状。

肥厚型心肌病的精准诊断和/或鉴别诊断主要依赖于影像学检查，其具有耗时长、费用相对较高、不能动态观察疾病的发展情况、难以被广泛应用等缺点，因此，寻求新的、可靠的、无创的、快速的诊断方法对肥厚型心肌病的早期诊断和早期干预治疗具有重要的临床意义。

发明内容

为了克服目前本领域存在的上述问题，本发明提供了基于分子标志物的肥厚型心肌病诊断产品及其应用，所述分子标志物为SFRP1和IER3两者联合。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测样本中分子标志物表达水平的试剂在制备诊断肥厚型心肌病的产品中的应用。

进一步，所述分子标志物为SFRP1和IER3。

进一步，所述检测样本中分子标志物表达水平的试剂包括检测样本中分子标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中分子标志物的蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括：特异性扩增所述分子标志物SFRP1和IER3的引物、特异性识别所述分子标志物SFRP1和IER3的探针、和/或特异性结合所述分子标志物SFRP1和IER3编码的蛋白的结合剂。

进一步，特异性扩增所述分子标志物SFRP1和IER3的引物的序列分别如SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示。

进一步，特异性结合所述分子标志物SFRP1和IER3编码的蛋白的结合剂包括所述蛋白的受体、针对蛋白的抗体、针对蛋白的肽抗体、结合蛋白的凝集素、双特异性双重结合剂或双特异性抗体；

优选地，特异性结合所述分子标志物SFRP1和IER3编码的蛋白的结合剂为针对所述蛋白的抗体。

进一步，所述分子标志物同生物标志物、基因标志物、标志物，是指患者(肥厚型心肌病)表型的指示物，例如病理学状态或对治疗剂的可能的反应性的指示物，其可以在所述患者的生物样本中检测到，生物标志物包括但不限于DNA、RNA、蛋白质、小分子代谢物质、糖类、基于糖脂的分子等；在本发明的具体实施例中，所述分子标志物为SFRP1和IER3，优选地，所述分子标志物为SFRP1和IER3两者联合，所述分子标志物的信息如下，其详细信息可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得；

基因SFRP1(Secreted frizzled related protein 1)，Gene ID为6422；

基因IER3(Immediate early response 3)，Gene ID为8870。

进一步，所述样本是指获自或衍生自目标受试者的组合物，其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本，如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物；血液或任意血液组分；体液；来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞；或血浆。术语样本包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本，如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分(如蛋白质或多核苷酸)富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。本发明中所述的样本包括但不限于血液、组织、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合，优选地，所述样本选自于受试者的血液或组织。

进一步，所述引物同扩增引物，是指包含5-100个核苷酸的核酸片段，优选地，所述引物或扩增引物包含能起始酶促反应(例如，酶促扩增反应)的15-30个核苷酸，在本发明的具体实施方式中，所述特异性扩增分子标志物SFRP1和IER3的引物的序列分别如SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4所示。

进一步，所述探针是指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因Labeling作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针和RNA探针等形式制备。

进一步，所述特异性结合分子标志物SFRP1和IER3编码的蛋白的结合剂包括与所述分子标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体、和/或化合物。

进一步，所述抗体是本领域众所周知的，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。本发明中的抗体是指与本发明所述的分子标志物SFRP1和IER3蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体。抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物学结合活性即可。

进一步，所述肽具有与靶物质(本发明所述的分子标志物蛋白)高度结合的能力，并且在热处理或化学处理期间不会发生变性。而且，由于其尺寸小，可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言，因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上，其可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。

进一步，所述适配体是指一种由特定类型的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)组成的多核苷酸，所述单链核酸自身具有稳定的三级结构，并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子(本发明所述的分子标志物蛋白)结合的特性。如上所述，由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质，但比蛋白更稳定并具有简单的结构，并且是由易于合成的多核苷酸组成，因此可以代替抗体来使用。

进一步，所述表达水平同水平，是指本发明中所述分子标志物SFRP1和IER3的绝对量或相对量，可以通过多种技术确定本发明中所述分子标志物组合(SFRP1和IER3)中任何一种的表达水平，特别地，可以通过使用本领域技术人员熟知的方法对本发明中所述分子标志物的绝对量或相对量进行检测。

进一步，所述诊断是指基于与个体相关的一个或多个的症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即不存在疾病或疾患)，或者可被诊断为不健康的/异常的(即存在疾病或疾患)，上述术语诊断、早期诊断、进行诊断及这些术语的变化型包括与特定疾病或疾患(肥厚型心肌病)相关地疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后对疾病的反应的发现，在本发明中，所述肥厚型心肌病的诊断包括对不患有肥厚型心肌病的个体和患有肥厚型心肌病的个体的进行区分。

进一步，所述试剂是通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测样本中分子标志物SFRP1和IER3的表达水平。

进一步，所述测序技术为核酸测序技术，包括链终止子(Sanger)测序技术和染料终止子测序技术，本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此，在测序前通常将RNA逆转录成DNA，此外，所述测序技术还包括下一代测序技术(即深度测序/高通量测序技术)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

进一步，所述核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

进一步，所述蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别分子标志物SFRP1和IER3上不同表位的两种抗体进行该分子标志物SFRP1和IER3的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。

本发明的第二方面提供了一种用于诊断肥厚型心肌病的产品。

进一步，所述产品包括检测样本中分子标志物表达水平的试剂，所述分子标志物为SFRP1和IER3。

进一步，所述试剂包括：特异性扩增所述分子标志物SFRP1和IER3的引物、特异性识别所述分子标志物SFRP1和IER3的探针、和/或特异性结合所述分子标志物SFRP1和IER3编码的蛋白的结合剂。

进一步，所述特异性结合所述分子标志物SFRP1和IER3编码的蛋白的结合剂包括与所述分子标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体、和/或化合物。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

进一步，所述试剂盒包括RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速检测试剂盒、或MRM(多反应监测)试剂盒；

优选地，所述试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。RT-PCR试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物。各引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的核苷酸，其长度可为约7至50bp，更特别为约10-39bp。此外，所述试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物；

更优选地，所述RT-PCR试剂盒还可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同pH值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶(例如Taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水、和无菌水；

优选地，所述试剂盒可包含用于操作DNA芯片所必需的元件。所述DNA芯片试剂盒可包含与基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸；

在一些实施方案中，本发明公开的试剂盒可包含用于进行ELISA所必需的元件。所述ELISA试剂盒可包含特异性针对蛋白(本发明所述的分子标志物蛋白)的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力，与其他蛋白无交叉反应性，并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述ELISA试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。此外，所述ELISA试剂盒可进一步包含能够检测被结合的抗体的试剂，例如，标记的第二抗体、发色团、酶(例如，与抗体缀合)、及其底物或能够结合所述抗体的物质。

本发明的第三方面提供了检测样本中分子标志物表达水平的试剂在制备肥厚型心肌病诊断系统/装置中的应用。

进一步，所述分子标志物为SFRP1和IER3。

进一步，所述检测样本中分子标志物表达水平的试剂包括检测样本中分子标志物的mRNA表达水平的试剂、检测样本中分子标志物的蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括：特异性扩增所述分子标志物SFRP1和IER3的引物、特异性识别所述分子标志物SFRP1和IER3的探针、和/或特异性结合所述分子标志物SFRP1和IER3编码的蛋白的结合剂。

本发明的第四方面提供了一种肥厚型心肌病诊断系统/装置。

进一步，所述系统/装置包括处理器、输入模块、输出模块；

其中，处理器用于对输入的信息采用生物信息学方法进行逻辑运算；输入模块用于输入样本中分子标志物SFRP1和IER3的表达水平，包含指令的计算机可读介质，所述指令在由所述处理器执行时在SFRP1和IER3的输入表达水平上执行算法；输出模块用于输出受试者是否患有肥厚型心肌病或者患有肥厚型心肌病的风险。

进一步，所述受试者意指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等，在本发明的具体实施方式中，所述受试者优选为人。

本发明还提供了一种计算机可读存储介质。

进一步，所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明第四方面所述的肥厚型心肌病诊断系统/装置。

进一步，所述系统/装置是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。本领域所属技术领域的技术人员熟知，本发明可以实现为设备、方法或计算机程序产品。因此，本发明公开的内容可以具体实现为以下形式，即可以是完全的硬件、也可以是完全的软件(包括固件、驻留软件、微代码等)，还可以是硬件和软件结合的形式。此外，在一些具体实施例中，本发明还可以实现为在一个或多个计算机可读介质中的计算机程序产品的形式，该计算机可读介质中包含计算机可读的程序代码。

可以采用一个或多个计算机可读的介质的任意组合。计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或者计算机可读存储介质。计算机可读存储介质例如可以是但不限于电、磁、光、电磁、红外线、或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。计算机可读存储介质的更具体的例子包括：具有一个或多个导线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦式可编程只读存储器(EPROM或闪存)、光纤、便携式紧凑磁盘只读存储器(CD-ROM)、光存储器件、磁存储器件，或者上述的任意合适的组合。在本文中，计算机可读存储介质可以是任何包含或存储程序的有形介质，该程序可以被指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供的分子标志物SFRP1和IER3两者联合与肥厚型心肌病具有极高的关联度，所述分子标志物SFRP1和IER3两者联合在训练集和验证集中均表现出对肥厚型心肌病较好的诊断效能，准确性、敏感性和特异性均较高，可用于肥厚型心肌病的早期诊断和筛查中，进而在早期进行及时有效的干预治疗。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示基因SFRP1和IER3在训练集中的差异表达的结果图，其中，A图：SFRP1，B图：IER3；

图2显示基因SFRP1和IER3在验证集中的差异表达的结果图，其中，A图：SFRP1，B图：IER3；

图3显示基因SFRP1和IER3在训练集中的ROC曲线结果图，其中，A图：SFRP1，B图：IER3；

图4显示基因SFRP1+IER3联合在训练集中的ROC曲线结果图；

图5显示基因SFRP1和IER3在验证集中的ROC曲线结果图，其中，A图：SFRP1，B图：IER3；

图6显示基因SFRP1和IER3联合在验证集中的ROC曲线结果图；

图7显示利用QPCR检测SFRP1基因在肥厚型心肌病患者和健康对照人群之间差异表达的结果图；

图8显示利用QPCR检测IER3基因在肥厚型心肌病患者和健康对照人群之间差异表达的结果图；

图9显示SFRP1基因对肥厚型心肌病诊断效能的ROC曲线结果图；

图10显示IER3基因对肥厚型心肌病诊断效能的ROC曲线结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1筛选肥厚型心肌病中差异表达的基因

1、数据来源

在本实施例中，收集肥厚型心肌病患者(HCM)及健康对照者(Control)相关的数据，所采用的数据均来自于Gene Expression Omnibus(GEO)数据库，以“Hypertrophiccardiomyopathy”为检索关键词，在GEO数据库中进行检索，在排除细胞系或动物水平上的研究、以及单样本的研究后共有两套数据集被纳入，分别为GSE141910和GSE36961；其中，GSE141910包含了28个肥厚型心肌病患者来源的样本和166个健康对照者来源的正常样本；GSE36961数据集中包含有106肥厚型心肌病患者来源的样本和39个健康对照者来源的正常样本；

将上述从GEO数据库中下载的数据集GSE141910作为训练集，样本量为Control：HCM＝166：28；将上述从GEO数据库中下载的数据集GSE36961作为验证集，样本量为Control：HCM＝39：106。

2、数据预处理

对上述从GEO数据库下载的训练集和验证集的原始数据进行了标准化处理。其中，对于下载的数据集GSE141910和GSE36961的基因表达矩阵文件，使用GPL平台注释文件对基因表达谱进行注释，将基因探针转换成gene symbol，其中多个探针对应同一个基因的，取平均值作为该基因的表达量。

3、差异表达分析

使用R软件中的“limma”包分别对上述数据集GSE141910和GSE36961中经预处理的数据进行差异表达分析，其中，差异表达基因的筛选标准均为：adj.P.Value<0.05，|log

4、实验结果

结果显示，筛选得到的训练集和验证集中的差异表达基因取交集后得到50个共有的表达趋势一致的差异表达基因，其中，筛选出的差异表达基因SFRP1和IER3在训练集中的差异表达情况见表1和图1，在验证集中的差异表达情况见表2和图2，基因SFRP1和IER3在肥厚型心肌病中的表达情况分别为上调、上调，且差异具有显著的统计学意义(adj.P.Value<0.05)。

表1基因在训练集中的差异表达结果

表2基因在验证集中的差异表达结果

实施例2基因SFRP1和IER3对肥厚型心肌病诊断效能的验证

1、实验方法

对实施例1中筛选出的在肥厚型心肌病中显著差异表达的基因SFRP1和IER3，使用R包“pROC”(版本1.15.0)执行接收器工作特性(ROC)分析，计算曲线下面积(AUC)以评估基因SFRP1、基因IER3、基因SFRP1+IER3两者联合分别在训练集和验证集中对诊断肥厚型心肌病的准确性，以及其敏感性和特异性。AUC值的范围是0到1，其中，0.7是可接受的性能，而0.9是优异的性能；

在判断单独指标在训练集和验证集中的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析，选择Youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值，AUC在0.5

在判断指标联合在训练集和验证集中的诊断效能时，对各基因的表达水平进行Logistics回归分析，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性等。

2、实验结果

结果见表3-4和图3-6，结果显示SFRP1+IER3两者联合对肥厚型心肌病的诊断效能显著优于单个基因SFRP1、IER3的诊断效能，SFRP1+IER3两者联合在训练集和验证集中的AUC值、敏感性和特异性均较高，表明了SFRP1+IER3两者联合对肥厚型心肌病诊断的准确性高，能够应用于肥厚型心肌病的早期筛查诊断中。

表3基因在训练集中的诊断效能结果

表4基因在验证集中的诊断效能结果

实施例3 QPCR验证基因SFRP1和IER3的差异表达情况及其诊断效能

1、样本收集

分别收集15例健康对照者的血液样本和23例肥厚型心肌病患者的血液样本各5mL，EDTA抗凝，-80℃冷冻储存。上述所有参与者均已知情同意，所述肥厚型心肌病患者均经心脏彩超检查，并经过临床诊断确诊，上述所有样本的取得均通过组织伦理委员会的同意；

其中，肥厚型心肌病组的纳入标准和排除标准如下：

(1)纳入标准：通过心脏彩超的测量，室间隔或左心室壁厚度≥15mm，或室间隔与左室后壁之比≥1：3；

(2)排除标准：先天性心脏病患者、先天性心脏病术后患者、淀粉样变心脏病患者、风湿性心脏病患者、起搏器植入患者、房室传导阻滞患者，既往高血压预激综合征等引起继发性心室肥厚患者。

2、总RNA的提取

取出冰冻血液样本，于37℃水浴或室温水浴中融化血液，进一步利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品(具体操作详见说明书)，并保存于-80℃备用。加入TRIzol后室温下放置10min，使收集的血液样品充分裂解(注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存)。每1mL TRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀后，室温放置3-5min，使其自然分相。4℃、12,000rpm离心15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min。4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。RNA沉淀中加入1mL 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mL TRIzol加入1mL 75％乙醇。4℃、8,000rpm离心5min，弃上清。室温放置晾干后，在沉淀内加入50μL RNase-free水，以充分溶解RNA，-70℃保存。

3、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8-2.2之间。

4、逆转录

取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μL，充分混匀。70℃水浴5min后，立即冰浴2-3min；继续加入5×逆转录缓冲液5μL，dNTP(2.5mM)5μL，RNasin 40U/μL，反转录酶M-MLV 200U/μL，补无核酶水至预期体积，42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活反转录酶M-MLV。

5、QPCR扩增反应

(1)引物设计

根据Genbank中基因SFRP1和基因IER3的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

SFRP1基因：

正向引物为5’-ATTCTAATGATTGGCAAGTC-3’(SEQ ID NO:1)；

反向引物为5’-GTGTGGTATGAGTCTGTT-3’(SEQ ID NO:2)；

IER3基因：

正向引物为5’-AACTCCGTCTGTCTACTG-3’(SEQ ID NO:3)；

反向引物为5’-CGACTTCAAGAAGATGGAA-3’(SEQ ID NO:4)；

GAPDH基因：

正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO:5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO:6)。

(2)配制PCR反应体系

正向引物和反向引物各1μL，SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μL，模板2μL，加入去离子水补足至25μL。

(3)PCR反应条件

95℃5min，(95℃10s，60℃30s，72℃25s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

6、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异分析采用t检验，认为当P<0.05时差异具有统计学意义。

7、实验结果

结果显示，与健康对照组的血液相比，SFRP1基因mRNA的表达水平在肥厚型心肌病患者组中呈现显著上调(见图7)，IER3基因mRNA的表达水平在肥厚型心肌病患者组中呈现显著上调(见图8)，差异具有显著的统计学意义(*P<0.05)，其对肥厚型心肌病的诊断效能结果见图9和图10，AUC值分别为0.858和0.817，这一结果进一步表明了基因SFRP1和IER3可作为肥厚型心肌病的诊断标志物。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 河南省人民医院

<120> 基于分子标志物的肥厚型心肌病诊断产品及其应用

<141> 2021-12-31

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attctaatga ttggcaagtc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtggtatg agtctgtt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aactccgtct gtctactg 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgacttcaag aagatggaa 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20