维利帕尼在抗新型冠状病毒中的应用

摘要

公开了维利帕尼在抗新型冠状病毒中的应用，具体公开了维利帕尼在制备SARS‑CoV‑2‑E通道抑制剂及抗新型冠状病毒的药物中的应用。本发明通过实验显示了维利帕尼具有强效的SARS‑CoV‑2‑E通道抑制性；CCK8检测细胞活性显示，维利帕尼可特异性地保护SARS‑CoV‑2‑E通道所导致的细胞死亡；且在BLM电生理记录中，维利帕尼可强效地抑制SARS‑CoV‑2‑E通道介导的电流；在病毒滴度测定实验中，维利帕尼能够明显降低新型冠状病毒的复制，实现维利帕尼作为药物分子应用于抗新型冠状病毒药物的临床前药效学评价。

说明书

技术领域

本发明属于药物研发和制药领域，具体涉及维利帕尼(小分子)作为SARS-CoV-2-E通道抑制剂在抗新型冠状病毒中的应用。

背景技术

新型冠状病毒(新冠病毒，SARS-CoV-2)，属于冠状病毒家族，具有极强传染性和极高死亡率，导致了全球范围内严峻的呼吸系统疾病大流行。该病毒感染主要出现呼吸道症状包括发热、咳嗽、气促和呼吸困难等；进一步的感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前，已有许多药物用于临床试验，包括抑制RdRP(依赖RNA的RNA聚合酶)的核苷类似物瑞德西韦(remdesivir)、羟氯喹、地塞米松等，但这些药物在实际应用过程中均存在不足。如地塞米松虽能够提升呼吸困难重症患者的生存几率，但无法用于轻症患者；羟氯喹由于毒副作用较强导致2020年6月被美国食品药品监督局(FDA)紧急撤回；同时，世界卫生组织公布了近7个月的药物抗新冠病毒临床治疗应用，全球30多个国家共计11266名患者在接受瑞德西韦、羟氯喹、洛匹那韦、干扰素、干扰素加洛匹那韦等试验药物作为临床治疗后，与未接受药物的患者相比，其总体死亡率、接受呼吸机治疗时间及住院时间等指标之间并无差异，说明目前临床试验的抗新冠肺炎治疗药物疗效甚微。此外，目前应用于临床治疗的药物均无明确的治疗机制。因此，至今仍无有效的靶标明确的药物用于临床。

冠状病毒包膜蛋白(SARS-CoV-2-E)是SARS-CoV-2的重要结构蛋白之一。SARS-CoV-2是一种囊膜、单股正链的RNA病毒，基因序列大小约为26～32kb，可编码冠状病毒非结构蛋白及结构蛋白两大类，它所包含的4种结构蛋白为病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)。其中SARS-CoV-2-E由75个氨基酸编码而成，是最小的结构蛋白，属于跨膜整合蛋白，具有亲水的氨基末端(NTD)、疏水性跨膜结构域(TMD)以及长而亲水的羧基端(CTD)三部分，与严重急性呼吸综合征(SARS)病毒具有高度同源性。已有工作证明，SARS-CoV-2-E蛋白可以通透钾、钠、钙，镁等离子，对氯离子显示弱通透性，是一种非选择性阳离子通道。

SARS-CoV-2-E通道作为新冠病毒中的一种结构蛋白离子通道，在SARS-CoV-2病毒侵染过程具有重要作用。已有研究报道在不同的宿主细胞上表达与生理感染水平相当的SARS-CoV-2-E蛋白，可介导快速的细胞死亡并诱发“炎症风暴”；同时，SARS-CoV-2-E蛋白能够作为毒力因子诱发宿主发生炎症和死亡，加剧患者的病情进展，且对SARS-CoV-2自身的存活、复制、释放、以及侵袭具有至关重要的作用。由此可见，抑制SARS-CoV-2-E离子通道活性，不仅可以抑制病毒增殖，减少宿主感染后的恶性进展，同时能够降低肺部炎症反应，减少宿主损伤。此外，近期SARS-CoV-2-E的结构解析也同样显示SARS-CoV-2-E是一个极具潜力的抗病毒药物靶点。然而，目前尚无靶向SARS-CoV-2-E通道并应用于抗新冠肺炎治疗的药物。

维利帕尼(Veliparib)，化学名为2-[(2R)-2-甲基-2-吡咯烷基]-1H-苯并咪唑-7-甲酰胺，是一种有效的口服PARP(poly ADP-ribose polymerase)抑制剂，它通过几种不同的作用机制发挥功能。PARP-1是一种含量较高的核酶，调节多种细胞过程，包括染色质重塑、转录调节，多聚ADP-核糖体聚合和损伤信号。当PARP-1和2被抑制时，单链DNA断裂的积累会导致双链断裂，如果不能正确修复，则会导致基因组完整性的丧失和随后的细胞死亡。目前Veliparib已进入III期临床，用于卵巢癌和乳腺癌的治疗，治疗效果显著，同时其可以在同基因和异种移植瘤模型中穿越血脑屏，表现出很好的安全性、药物代谢动力学和药物效应动力学性能。

发明内容

本发明基于外源性表达SARS-CoV-2-E可导致宿主细胞死亡的效应，建立基于细胞存活率为指标的高通量筛选方法。首先对已上市的老药进行筛选，获得具有细胞保护活性的药物，然后通过平面脂双层工作站(BLM)检测药物对SARS-CoV-2-E通道的阻断效果，同时考察药物对新冠病毒复制的抑制活性，获得靶向SARS-CoV-2-E通道的抗新冠治疗药物。本研究显示维利帕尼(小分子)具有很好的细胞保护效应，能够阻断SARS-CoV-2-E通道活性，并且具有抑制新冠病毒复制的功能，是一种潜在的抗新冠病毒药物，具有治疗新冠肺炎的应用前景。本发明提供了维利帕尼的新应用。

根据本发明的一个方面，提供了维利帕尼在制备SARS-CoV-2-E通道抑制剂中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供了维利帕尼在制备抗SARS-CoV-2病毒的药物、消毒用品或防护用品中的应用。

根据本发明的另一个方面，提供了维利帕尼在制备用于治疗新冠肺炎的药物中的应用。

在所述应用中，维利帕尼为SARS-CoV-2-E通道抑制剂。

根据本发明的另一个方面，提供了维利帕尼用于抗SARS-CoV-2病毒药物的临床前药效学评价的用途。

本发明通过实验显示了维利帕尼能够强效地抑制SARS-CoV-2-E介导的通道电流；维利帕尼能够特异性地保护细胞免于由SARS-CoV-2-E通道介导的细胞死亡；在病毒侵染的细胞中，维利帕尼能够抑制SARS-CoV-2病毒的复制，显著降低新冠病毒滴度。

附图说明

图1为维利帕尼的结构式。

图2示出了维利帕尼对SARS-CoV-2-E通道电流的抑制作用效果。

图3示出了维利帕尼对细胞保护随浓度的变化曲线及IC

图4示出了维利帕尼对SARS-CoV-2-E通道抑制率随浓度的变化曲线及IC

图5示出了维利帕尼对SARS-CoV-2病毒的抑制率随浓度的变化曲线及IC

具体实施方式

在下文中，将结合附图通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明的目的，其并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

维利帕尼(Veliparib)粉末购买于MCE公司

实验材料与仪器

转染试剂Lipofectamine 3000购买于Thermo Fisher公司；Cell Counting Kit(CCK-8)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)粉末，His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂(HisSep Ni-NTAAgarose Resin 6FF)购自翊圣公司；磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)购自Avanti Polar Lipids公司；二甲基亚砜(DMSO)，咪唑(Imidazole)，氯化钾(KCl)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，癸烷(decane)购于sigma公司；RNA提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit)，反转录试剂盒(PrimeScript

酶标仪(Thermo Scientific Microplate Reader)，实时荧光定量PCR仪器(ABI7500)购于Thermo Fisher公司；匀质机(AH-100B)购自ATS ENGINEERING公司；平面脂双层工作站(The Planar Lipid Bilayer Workstation，BLM Workstation)购自WARNER公司。

实施例1维利帕尼保护细胞免于SARS-CoV-2-E引发的细胞死亡

在本实施例中，通过CCK8试剂盒分析维利帕尼对Vero E6细胞的保护活性(IC

如图3所示，结果表明，维利帕尼有较好的细胞保护作用，IC

实施例2维利帕尼强效抑制SARS-CoV-2-E通道电流

在本实施例中，通过平面脂双层工作站检测维利帕尼对SARS-CoV-2-E通道电流的抑制作用。

1.SARS-CoV-2-E蛋白纯化

SARS-CoV-2-E基因序列由华大基因公司合成并构建至pET28a载体上，将重组质粒转化至BL21-lysS感受态中，扩增3～4h至菌对数生长期时加入0.5mM的IPTG诱导SARS-CoV-2-E蛋白表达，22℃表达16～18h。诱导后的菌液在4000rpm下离心20min，去上清并用重悬液(4mM DTT，20mM咪唑，25mM Tris-base，150mM NaCl pH＝8.0)重悬，再加入终浓度为1mM的PMSF，使用匀质机(AH-100B,ATS ENGINEERING INC)破菌。菌液破碎后在13000rpm下离心30min，取上清并用0.22μm滤膜(Millex-GP,Millipore)进行过滤。将滤液转至His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂(HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF，翊圣)中充分结合2h，然后分别用30ml的20，30，40，50mM的咪唑清洗层析柱，最后用300mM的咪唑洗脱，并使用3kD超滤管(

2.化合物BLM检测

将磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰丝氨酸(PS)(Avanti Polar Lipids；Alabaster；AL)按3:2的比例混合并用氮气吹干，再溶于癸烷中至终浓度为50mg/ml。将BLM系统中的CUP(cis)与槽子(trans)安装好，并分别加入1ml的内外液(500mM KCl在cis侧/50mM KCl在trans侧，5mM HEPES，pH＝6.35)。接着将制备好的磷脂涂于CUP的孔上，并在Clampex10.3软件中记录到稳定的基线。5min后，在cis侧加入纯化的SARS-CoV-2-E蛋白，等待蛋白上膜。待SARS-CoV-2-E介导的电流开放后，记录3min然后在trans侧加入1，10，50，100μM的维利帕尼并继续记录至10min，检测其是否对通道电流有抑制作用。通过膜片钳放大器(BC535，WARNER)的电压钳模式记录电流，单通道的电导及开放频率通过高斯函数进行拟合，且开放时间小于0.5-1.5ms的被视为噪音并忽略。所有数据以平均值±标准差表示。

3.实验结果分析

电生理数据分析利用Clampfit 10.3(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)，再利用GraphPad Prim 5(GraphPad Sofware,San Diego,CA)，剂量效应曲线用希尔等式(Hillequation)拟合。

如图2所示，100μM的维利帕尼可有效地抑制SARS-CoV-2-E通道所介导的阳离子电流，图4所示维利帕尼抑制通道的IC

实施例3维利帕尼在Vero E6细胞上抗SARS-CoV-2活性

测定化合物维利帕尼对2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)复制抑制活性：SARS-CoV-2病毒来源于国家病毒资源库微生物菌毒种保藏中心(Wuhan-Hu-1)。将Vero E6细胞在密度为5×10

以上实验结果表明维利帕尼能够有效地抑制SARS-CoV-2病毒的复制，有较好的体外抗病毒活性，可作为药物分子应用于抗病毒药物的临床前药效学评价。

如本发明所表明的，维利帕尼能够有效地抑制SARS-CoV-2-E介导的单通道电流，保护SARS-CoV-2-E通道介导的细胞死亡，同时表现出良好的抗SARS-CoV-2病毒活性。研究表明维利帕尼可作为潜在的抗新冠病毒治疗药物，以及用于抗SARS-COV-2病毒的消毒用品、防护用品。