黑参中22(R)-三七参苷Ab1及其差向异构体三七参苷Ab1的提取分离方法与应用

摘要

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从黑参中提取、分离和鉴定出的一对差向异构体及其提取分离方法。所述的化合物为一对差向异构体，分子式为C

说明书

技术领域

本发明涉及中药提取、分离领域，涉及从黑参药材中提取、分离和鉴别出的一对差向异构体及其提取分离方法，具体涉及从黑参中22(R)-三七参苷Ab1及其差向异构体三七参苷Ab1的提取分离方法与应用。

背景技术

黑参为五加科植物人参

现代药理学研究表明，黑参具有抗癌、抗心力衰竭、保肝、免疫增强、降血糖、抗糖尿病、抗氧化活性和对中枢神经系统保护作用。研究表明黑参中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：人参皂苷、人参多糖。其中的稀有人参皂苷是黑参中的一大类活性成分，目前已报道的人参皂苷类成分类有人参皂苷Rk1、Rk3、Rg3、Rg5、CK、F4、Rg6、Rh4和Rs5等。

目前从黑参中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对黑参中化合物的开发和分离是亟待需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供从黑参中提取的一种新化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1及其差向异构体Notoginsenoside Ab1，经研究发现本发明的化合物具有心肌保护的作用，同时提供一种针对本发明化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供一种从黑参中分离出的一对差向异构体化合物，其特征在于，所述化合物为22(R)-三七参苷Ab1及其差向异构体三七参苷Ab1，分子式均为C

本发明还提供一种如上所述的22(R)-三七参苷Ab1及其差向异构体三七参苷Ab1的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、取黑参药材干燥，粉碎后，采用乙醇回流提取，将提取液过滤，合并滤液减压浓缩，放凉至室温，得药液备用；

步骤2、将步骤1中浓缩液上大孔吸附树脂，依次用水、低浓度乙醇、高浓度乙醇洗脱，收集高浓度乙醇洗脱物，减压浓缩干燥；

步骤3、将步骤2中高浓度乙醇洗脱物经硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，回收洗脱液至浸膏，经薄层色谱检测，显色，将体积比为10：1的二氯甲烷-甲醇部位合并，减压浓缩至干，备用；

步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位减压浓缩至干，得浓缩物备用；

步骤5、对步骤4中所得浓缩物进行HPLC分离制备，以甲醇-水作为流动相进行等度洗脱，制备得到化合物22(R)- 三七参苷 Ab1和三七参苷 Ab1。

进一步地，所述步骤1中乙醇回流提取1~3次，每次煎煮1~3小时，乙醇用量为药材的8～16倍，乙醇浓度为40%~100%。

进一步地，所述步骤2中所用树脂为D101大孔吸附树脂或AB-8大孔吸附树脂；所用低浓度乙醇浓度为10%~60%，高浓度乙醇浓度为60%~90%。

进一步地，所述步骤3中所用二氯甲烷-甲醇的体积比为0：100，50：1，30：1，10：1和5：1；所述硅胶目数100-300目。

进一步地，所述步骤4中ODS的预处理过程为甲醇充分浸泡8~24小时，上柱，再以初始流动相平衡。

进一步地，所述步骤4中所用甲醇和水的体积比为10：90，30：70，50：50，70：30，85：15，90：10和100：0；填料粒度为40～70μm。

进一步地，所述步骤5中所用甲醇洗脱程序为等度洗脱，所用甲醇-水体积比为40：60~70：30，该化合物保留时间为50-120 min。

本发明还提供一种上述所述的从黑参中分离出的一对差向异构体化合物的用途，其特征在于，化合物22(R)- 三七参苷 Ab1和三七参苷 Ab1用于制备心肌保护的药物。

本发明还提供一种用于心肌保护的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括22(R)- 三七参苷 Ab1和三七参苷 Ab1的任一种化合物及其药学上可接受的载体。

与现有技术相比本发明的有益效果。

本发明中所述黑参中新化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1的分离和药理活性研究未被现有技术所报道，Notoginsenoside Ab1结构虽有报道，但从黑参中分离得到尚属首次；本发明提供来源于黑参的一对差向异构体及一种针对本发明化合物的提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、ODS中压柱及高效液相色谱仪进行分离纯化与制备，成功提取分离出两个化合物，该方法操作步骤仅为五步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用乙醇、二氯甲烷、甲醇等常规试剂，工艺方法简单环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90％，此外经研究表明此化合物具有心肌保护作用，因此本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1及其差向异构体Notoginsenoside Ab1可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备心肌保护的药物。

附图说明

图1为本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1的高分辨质谱图。

图2为本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1的

图3为本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1的

图4为本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1的HSQC谱图。

图5为本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1的HMBC谱图。

图6为本发明化合物Notoginsenoside Ab1的

图7为本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1、Notoginsenoside Ab1的CD、ECD谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

实施例1。本发明提供两个黑参中化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1、Notoginsenoside Ab1，分子式均为C

所述化合物根据结构命名为22(R)-Notoginsenoside Ab1、NotoginsenosideAb1，表1为该两个化合物的核磁数据：

表1：本发明化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1及Notoginsenoside Ab1的核磁数据。

本发明新化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1的结构鉴定与推导。

22(R)-Notoginsenoside Ab1：白色无定型粉末，易溶于吡啶、甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷香草醛-硫酸显色剂后斑点呈紫色。HRESI(-)TOFMS给出m/z: 671.3930 [M+Cl]

本发明化合物Notoginsenoside Ab1的结构鉴定。

Notoginsenoside Ab1：白色无定型粉末，易溶于吡啶、甲醇。点样于硅胶薄层板后，喷香草醛-硫酸显色剂后斑点呈紫色。由

根据以上信息，可确定此化合物为上述结构。

本发明还提供上述新化合物的提取分离方法，具体步骤为。

步骤1：称取黑参干燥药材10kg，采用70%乙醇回流提取，乙醇用量为药材的10倍，回流提取两次，每次煎煮2h，提取液滤过，合并滤液，加热浓缩至5L，放凉至室温，得药液备用。

步骤2：将步骤1中浓缩液注入到15L D101大孔吸附树脂，依次用水（50L）、60%乙醇（50L）、95%乙醇（50L）洗脱，将95%乙醇洗脱液干燥。

步骤3：将步骤2中95%乙醇洗脱物加甲醇溶解后，用100~200目硅胶拌样后，经200~300目硅胶柱分离，采用二氯甲烷-甲醇梯度（100：0、50：1、30：1、10：1、5：1）洗脱，将二氯甲烷-甲醇（10：1）洗脱的部分，显色合并，减压浓缩至干，备用。

步骤4、将步骤3中所得物再经预处理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料)层析分离，用甲醇-水梯度（10：90、30：70、70：30、100：0）洗脱，得到4个洗脱部位，将70%甲醇洗脱部分，减压浓缩至干，得浓缩物备用。

步骤5、将步骤4中所得浓缩物经HPLC(高效液相)分离制备，以55%甲醇水

为流动相进行等度洗脱，流速2ml/min，检测波长210nm。最终得到本发明所述的新化合物22(R)-Notoginsenoside Ab1及其差向异构体Notoginsenoside Ab1，经归一化测定纯度均为93～99％。

实施例2. 本发明化合物的心肌保护作用。

1 主要材料。

1.1 药品与试剂：实验所用新化合物由上述方法制备，纯度为99%，精密称取，用DMSO溶解后，加培养液稀释至所需浓度。DMEM培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青公司），CCK-8试剂盒（南京建成生物工程）。

1.2 实验动物：出生2天的SD大鼠（辽宁长生生物技术股份有限公司，SCXK 2020-0001）。

1.3 分组：分为正常组、模型组和低、中、高给药组(含DMSO溶媒的培养液)。

2 实验方法。

2.1 SD大鼠乳鼠心肌细胞的体外分离与培养。

取新生3天以内的SD乳鼠，摘取心脏的心尖部分，转移至加入预冷PBS的培养皿中，用眼科镊子将心脏剪成1mm

将组织碎块使用胰酶37℃水浴锅摇晃消化，小心吸取上清，转移至预先加有5mL含10％FBS的DMEM中(此步骤重复5-8次)。

合并所有细胞悬液，过200目筛，1000rpm离心5min，弃上清，加入含10％FBS的DMEM中重悬，加入培养皿中进行差速培养。

1.5h后小心吸取上层未贴壁细胞至另一培养皿中，37℃，5％CO

细胞毒活性测定。

大鼠心肌细胞胰酶处理，制成浓度为1×10

丢弃原培养液，每孔加入200μL各浓度1μM、10μM、30μM的22(R)-NotoginsenosideAb1和Notoginsenoside Ab1培养液。孵育24小时后，抽吸孔内液体，每孔加入含CCK-8细胞活力测定试剂5μL的新完全培养基200μL。细胞在37℃培养箱中孵育4h，用Elisa试剂盒在450nm处测量各孔的吸光度，以确定其对二者的细胞毒活性。

2.2 体外心肌细胞缺氧/复氧模型的建立。

心肌细胞于37℃，95％N

将含10％FBS的DMEM培养基弃去，添加无糖无血清培养基，并通95％N

将96孔板中培养液更换为无糖无血清培养基，置于缺氧装置中，使用95％N

缺氧结束后，更换为含有10％FBS的DMEM培养基，于正常培养箱中培养4小时，获得缺氧/复氧心肌损伤细胞模型。

2.3 CCK-8法检测化合物对心肌细胞缺氧/复氧再灌注损伤的保护作用。

大鼠心肌细胞胰酶处理，制成浓度为1×10

丢弃HRI模型心肌细胞原培养液，每孔加入200μL各浓度22(R)-NotoginsenosideAb1。孵育24小时后，抽吸孔内液体，每孔加入含CCK-8细胞活力测定试剂5μL的新完全培养基200μL。细胞在37℃培养箱中孵育4h，用Elisa试剂盒在450nm处测量各孔的吸光度，以确定其对HRI模型心肌细胞的保护作用。

相对细胞活力=上述加药细胞组的OD值/正常细胞组的OD值。

所有数据用SPSS 20.0软件处理，并以mean±SD值表示。采用成组t检验比较，P值<0.05被认为具有统计学意义。

3.实验结果。

1μM、10μM、30μM浓度下，22(R)-Notoginsenoside Ab1、Notoginsenoside Ab1均未表现出现细胞毒作用。

1μM、10μM、30μM浓度下，22(R)-Notoginsenoside Ab1、Notoginsenoside Ab1对损伤心肌活力见表2。

表2 22(R)-Notoginsenoside Ab1、Notoginsenoside Ab1对缺氧/复氧心肌细胞损伤模型的保护作用。

注：##P<0.01与空白组比较；*P<0.05与模型组比较，**p<0.05与模型组比较。

实验结果表明本发明各浓度的22(R)-Notoginsenoside Ab1和NotoginsenosideAb1对HRI诱导的心肌细胞具有较好的保护作用，且随药物浓度增大，对心肌损伤细胞保护能力显著提高。Notoginsenoside Ab1较22(R)-Notoginsenoside Ab1心肌保护作用更强。

综上所述，本发明提供新化合物及其差向异构体的提取分离方法，依次采用乙醇回流提取、硅胶柱层析、ODS中压柱及液相分离制备，成功的分离得到一种新化合物及其差向异构体，该方法简便，快速，环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，由于所得化合物化学结构独特，均从中药黑参中首次提取出来，其具有心肌保护作用，因此本发明化合物及其组合物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。