一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法及其应用

摘要

本发明公开了一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法及其应用，属于分子生物技术。根据隐性白羽基因突变特征序列设计三条特异性引物：NOR‑UP：ACCCCATCCCTGAAGACACT；MUT‑UP：TTGCGTCATTCCTTCCTTATCTA；DOWN：GCCCAGAGAGCACAGCAGTAAT。利用该引物组合进行PCR扩增反应，通过观察反应产物凝胶电泳条带就能鉴定鸡隐形白羽基因型。该方法无需进行基因组DNA的提取，操作简单，易于推广，降低了鸡隐性白羽基因型分子检测的成本，有利于提高家鸡品种选育工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法及其应用。

背景技术

羽色与冠型、体型性状等均是家禽是一种重要的外观表型性状，作为品种的特征性状之一而被农业工作者们广泛关注。羽色的表型多种多样，如白羽、黄羽、芦花羽、横斑羽、麻羽等。其中白羽性状可根据白羽基因的显隐性分为显性白羽和隐性白羽，前者主要有显型白羽基因II控制、后者主要由隐性白羽基因cc、oo、PP和aa这4对隐性基因控制。

隐性白化基因aa定位在家鸡(Gallus gallus domesticus)的1号常染色体的络氨酸酶基因(Tyrosinase，TYR)上。TYR基因第4内含子中插入一段长约7.5kb的内源性逆转录病毒，导致TYR基因转录物中缺少第五外显子编码的跨膜结构域而无法正常转录，从而使TYR失去正常功能活性，致使黑色素无法合成，导致隐性白羽形成。

目前对家鸡的隐性白羽基因型在群体中进行鉴定的方法主要有两种，第一种即通过传统测交判断，第二种则是通过分子检测技术。在隐性白羽鸡的选育中，分子手段相比传统育种而言准确性高，周期短，工作步骤繁琐，但同时也存在着需要一些专业技术人员和一定量的专业设备的协助才可完成。因此，对隐性白羽基因型检测的简单化和成本低廉化成为了生产实践中的迫切需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用本发明公开的引物对抗凝全血模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分型后就能够鉴定鸡隐性白羽基因型，该方法操作简单，易于推广，并且对隐性白羽鸡的育种选育提供理论基础和数据支持。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的引物组合，包括：

NOR-UP：ACCCCATCCCTGAAGACACT；

MUT-UP：TTGCGTCATTCCTTCCTTATCTA；

DOWN：GCCCAGAGAGCACAGCAGTAAT。

本发明还提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的试剂盒，包含所述的引物组合。

本发明还提供一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以鸡全血为模板，利用所述的引物组合或所述的试剂盒进行PCR扩增反应，对扩增产物凝胶电泳后进行辨别，若电泳结果只出现一条542bp的条带，则为非隐性白羽基因纯合子，若电泳结果只出现一条310bp条带，则为隐性白羽基因纯合子，若电泳结果出现一条542bp条带和一条310bp条带，则为携带隐性白羽基因的杂合子。

进一步地，所述模板为鸡抗凝全血。

进一步地，所述鸡抗凝全血以双蒸水稀释后，形成鸡抗凝全血双蒸水稀释液，作为模板。

进一步地，所述鸡抗凝全血与双蒸水的体积比为1：2。

进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：将配制好的扩增反应体系放置于PCR仪中，95℃预变性5min；95℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃最终延伸5min，4℃保存。

进一步地，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：2×血液样本缓冲液5μL、鸡抗凝全血双蒸水稀释液1μL、NOR-UP和MUT-UP引物各0.2μL、DOWN引物0.4μL、10mM脱氧核苷三磷酸0.2μL、血液超保真DNA聚合酶0.3μL和双蒸水2.7μL。

本发明还提供一种所述的引物组合或所述的试剂盒在鉴定鸡隐性白羽基因型中的应用。

进一步地，所述引物组合或所述试剂盒中引物NOR-UP和DOWN用于非隐性白羽等位基因的检测，引物MUT-UP和DOWN用于隐性白羽等位基因的检测。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明是以经双蒸水稀释后的鸡抗凝全血样本为模板，利用本发明公开的引物或试剂盒进行常规PCR技术扩增后，经琼脂糖凝胶电泳分型后就能够鉴定鸡隐性白羽基因型的基因型。操作简单，易于推广，并且对隐性白羽鸡的育种选育提供理论基础和数据支持。

(2)本发明以双蒸水稀释的鸡抗凝全血作为扩增模板，仅需稀释三倍体积，无需提取基因组DNA。相比于传统的DNA分子检测技术，降低了技术门槛、提升了检测速度，同时还减少了检测成本。

(3)相比于现有的普通全血PCR分子检测技术，本发明使用的分子检测方法，可以对抗凝血进行直接PCR扩增。育种企业可根据需要，或挑选隐性白羽纯合子个体进行培育，或剔除隐性白羽纯合子个体和杂合子个体，培育非隐性白羽纯系，对于家鸡的品种选育具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为抗凝全血法PCR扩增产物凝胶电泳图，其中，1-15分别为15例麻黄鸡样本，M为Marker；

图2为验证引物特异性及扩增效率的凝胶电泳图，其中，前6个泳道为隐性白洛克鸡样本，后6个泳道为麻黄鸡样本，最左侧为Marker。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1一种全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法

本实施例在于提供一种分子检测方法，利用经过简单处理的抗凝血为模板，通过常温PCR的方法来鉴定特定基因组位置的基因差异，进而鉴定隐性白羽基因座的基因型。具体包括以下方法步骤：

步骤1：模板准备

(1)血样采集。随机选取15例广州市江丰实业股份有限公司的130日龄麻黄鸡，上述鸡的羽色均为非白羽。采集上述15例鸡的翅下静脉的血液3mL，置于碧迪EDTA-K2抗凝采血管中，该抗凝采血管内含EDTA抗凝剂。

(2)血样处理。抽取2.5μL(1)中采集的抗凝血样，加入5μL体积的双蒸水，混匀，获得经双蒸水稀释的鸡抗凝血样。

步骤2：隐性白羽基因座目的片段PCR扩增

经过步骤1处理的双蒸水稀释鸡抗凝血为模板，由广州天一辉远基因科技有限公司合成的利用NCBI网站的Primer-BLAST工具设计的如表1的引物。将引物与诺唯赞生物科技股份有限公司提供的2×血液样本缓冲液、10mM脱氧核苷三磷酸和血液超保真DNA聚合酶配置如表2的扩增反应体系，按照如表3的热循环参数及程序进行PCR扩增。

表1扩增引物

表2扩增反应体系

表3扩增反应程序

扩增产物交由广州天一辉远基因科技有限公司进行测序，测序结果如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.4

GCCCAGAGAGCACAGCAGTAATTATGCCTCCGATCACAGCTGCGCCAACCAGCCAGGGCCAGATCTGATGGGCTTGCTTGAGGTAGGGGATTAAAAAGTCCTGGAAAGAACCAAGTGCTAGAAAGGAGAAAAACAGAGGTCCTTTTACATGATGCAATGCAGTACCAGTGTATACAGATTGTGTAACAGATAACACTGGAAGGCTCAGAGTGAAAAATGATTATTGAAGTGAAGAAAATTGTCTGAAGGTTACAAATAATTCTAAGCAAATTCCACCAGTCCTTAAAGTTTCCCAATTTTTGTGTTGAAATTGAAGGGAACTGGGTTTACTATTTCCAGTGCTATTTATGGTTTTGTGAAAGCTGTAAGAATAGAAAGCAAGAATGATCATAGAATCATTGAATCGCTGAATCGTTTGAGCTGAAAGATGCTCTTGAAGGCCATCTAGCCCAGCTCCCCTGCTATGAAAAGGGACATCTACAGCTCCATCAAGTGCTCAGAGCTCAATCCAGCCTAATCTTGAGTGTCTTCAGGGATGGGGT

SEQ ID NO.5

GCCCAGAGAGCACAGCAGTAATTATGCCTCCGATCACAGCTGCGCCAACCAGCCAGGGCCAGATCTGATGGGCTTGCTTGAGGTAGGGGATTAAAAAGTCCTGGAAAGAACCAAGTGCTAGAAAGGAGAAAAACAGAGGTCCTTTTACATGATGCAATGCAGTACCAGTGTATACAGATTGTGTAACAGATAACACTGTGTAGTCAAATAGAGCCAGAGGCAACTTGAATAGTCTAAAGACCAAATAAGGAAAAAGCAAGACATTCCATATGCTCATTGGTGGCAACTAGATAAGGAAGGAATGACGCAA

步骤3：目的片段电泳分型

(1)电泳分型。吸取步骤2扩增的目的基因PCR产物上清液9μL与1μL 10×DNA凝胶上样缓冲液混合后，将样品点入浓度为1％琼脂糖TAE凝胶中，电泳20min。

(2)结果判定。琼脂糖凝胶电泳分型图中，若只出现一条542bp(SEQ ID NO.4)的条带，则说明其为非隐性白羽基因纯合子个体，基因型为AA；若只出现一条310bp(SEQ IDNO.5)条带，则说明其为隐性白羽基因纯合子个体，基因型为aa；若出现一条542bp条带和一条310bp条带，则说明其为携带隐性白羽基因的杂合子个体，基因型为Aa(图1)。

实施例2验证引物的扩增效率及其特异性

本实例对已知基因型样本进行分型。试验材料选取已知为隐性白羽基因型纯合子的隐性白洛克鸡6只和已知是不携带隐性白羽基因的麻黄鸡6只，用于验证引物的扩增效率及其特异性。

1.实验材料

选取已知为隐性白羽基因型纯合子的隐性白洛克鸡6只和已知是不携带隐性白羽基因的麻黄鸡6只。上述12例血样均采集自广州市江丰实业股份有限公司。

2.实验方法

步骤1：模板准备

(1)血样采集。采集上述12例鸡的翅下静脉的血液3mL，置于碧迪EDTA-K2抗凝采血管中，该抗凝采血管内含EDTA抗凝剂。

(2)血样处理。抽取2.5μL(1)中采集的抗凝血样，加入5μL体积的双蒸水，混匀，获得经双蒸水稀释的鸡抗凝血样。

步骤2：隐性白羽基因座目的片段PCR扩增

经过步骤1处理的稀释抗凝血为模板，利用实施例1中表1所示的引物，以及表2所示的扩增反应体系，和表3所示的热循环参数及程序进行PCR扩增。

步骤3：目的片段电泳分型

(1)电泳分型。吸取步骤2扩增的目的基因PCR产物上清液9μL与1μL 10×DNA凝胶上样缓冲液混合后，将样品点入浓度为1％琼脂糖TAE凝胶中，电泳20min。

(2)结果判定。琼脂糖凝胶电泳分型图中，隐性白羽洛克鸡的基因组DNA只扩增出一条542bp的条带，则说明其基因型为AA；已知不携带隐性白羽基因的麻黄鸡只扩增出一条310bp的条带，说明其基因型为aa(图2)。

上述结果表明，通过该方法可以准确地讲隐性白羽基因和非隐性白羽基因的个体区分开。

实施例3单盲检测判定方法的可靠性

本实例采用单盲的方式，对已知基因型样本进行分型。试验材料选取通过测交确定的12只隐性白羽基因杂合子麻黄鸡F1代(Aa)和12只无隐性白羽基因纯合子麻黄鸡(AA)。

1.实验材料

选取已知为纯系无隐性白羽基因的麻黄鸡12只以及麻黄鸡与纯系隐性白羽白洛克杂交F1代血样12只。上述24例血样均采集自广州市江丰实业股份有限公司。

2.实验方法

步骤1：模板准备

(1)血样采集。采集上述24例鸡的翅下静脉的血液3mL，置于碧迪EDTA-K2抗凝采血管中，该抗凝采血管内含EDTA抗凝剂。

(2)血样处理。抽取2.5μL(1)中采集的抗凝血样，加入5μL体积的双蒸水，混匀，获得经双蒸水稀释的鸡抗凝血样。

步骤2：隐性白羽基因座目的片段PCR扩增

经过步骤1处理的稀释抗凝血为模板，利用实施例1中表1所示的引物，以及表4所示的扩增反应体系，和表3所示的热循环参数及程序进行PCR扩增。

表4扩增反应体系

步骤3：目的片段电泳分型

(1)电泳分型。吸取步骤2扩增的目的基因PCR产物上清液9μL与1μL 10×DNA凝胶上样缓冲液混合后，将样品点入浓度为1％琼脂糖TAE凝胶中，电泳20min。

(2)结果判定。琼脂糖凝胶电泳分型图中，若只出现一条542bp的条带，则说明其为非隐性白羽基因纯合子个体，基因型为AA；若出现一条542bp条带和一条310bp条带，则说明其为携带隐性白羽基因的杂合子个体，基因型为Aa。结果汇总如表5所示。

表5单盲检测判定结果

注：纯系无隐性白羽基因的麻黄鸡血样编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，麻黄鸡与纯系隐性白羽白洛克杂交F1代血样编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11、F1-12。

上述结果表明，通过该方法可准确地检测有色羽鸡群中的隐性白羽基因是否存在。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种抗凝全血法鉴定鸡隐性白羽基因型的分子检测方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accccatccc tgaagacact 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgcgtcatt ccttccttat cta 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcccagagag cacagcagta at 22

<210> 4

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcccagagag cacagcagta attatgcctc cgatcacagc tgcgccaacc agccagggcc 60

agatctgatg ggcttgcttg aggtagggga ttaaaaagtc ctggaaagaa ccaagtgcta 120

gaaaggagaa aaacagaggt ccttttacat gatgcaatgc agtaccagtg tatacagatt 180

gtgtaacaga taacactgga aggctcagag tgaaaaatga ttattgaagt gaagaaaatt 240

gtctgaaggt tacaaataat tctaagcaaa ttccaccagt ccttaaagtt tcccaatttt 300

tgtgttgaaa ttgaagggaa ctgggtttac tatttccagt gctatttatg gttttgtgaa 360

agctgtaaga atagaaagca agaatgatca tagaatcatt gaatcgctga atcgtttgag 420

ctgaaagatg ctcttgaagg ccatctagcc cagctcccct gctatgaaaa gggacatcta 480

cagctccatc aagtgctcag agctcaatcc agcctaatct tgagtgtctt cagggatggg 540

gt 542

<210> 5

<211> 310

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcccagagag cacagcagta attatgcctc cgatcacagc tgcgccaacc agccagggcc 60

agatctgatg ggcttgcttg aggtagggga ttaaaaagtc ctggaaagaa ccaagtgcta 120

gaaaggagaa aaacagaggt ccttttacat gatgcaatgc agtaccagtg tatacagatt 180

gtgtaacaga taacactgtg tagtcaaata gagccagagg caacttgaat agtctaaaga 240

ccaaataagg aaaaagcaag acattccata tgctcattgg tggcaactag ataaggaagg 300

aatgacgcaa 310