人工修饰的血管紧张素II及血管紧张素Ⅱ酶标记物

摘要

本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其涉及人工修饰的血管紧张素II及血管紧张素II酶标记物。本发明提供了人工修饰血管紧张素II，其在血管紧张素II的N端或C端修饰有X(G

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其涉及人工修饰的血管紧张素II及血管紧张素Ⅱ酶标记物。

背景技术

免疫学检测技术具有检测灵敏度高、速度快、费用低以及选择性强等优点。它将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的高度专一性、特异性相结合，以酶标记的抗原或抗体作为关键试剂进行免疫测试，所以具有很高的灵敏度。用于标记抗原或抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；反应产物易于显现；能商品化生产。当前应用较多的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广，被广泛的用于临床诊断和免疫测定的试剂等。

用于生物偶联制备酶标记物的方法，主要包括碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法等，每种方法都有其优缺点，具体交联方法的选择还需根据目标分子可用活性官能团(羧基、氨基、醛基、羟基、巯基等)进行确定。根据HRP分子特点，大多利用过碘酸钠法进行酶标抗原、抗体的制备。过碘酸钠法基本原理是：利用过碘酸钠的氧化性将HRP分子中邻羟基氧化为醛基，然后再与伯氨基反应生成西弗碱，通过还原剂将西弗碱还原为稳定的碳氮单键。大多数抗原抗体类都为蛋白质大分子物质，表面具有赖氨酸残基暴露出的伯氨基，或是利用短肽段N端的氨基或是在原有肽段上引入赖氨酸残基也可用来与HRP分子上活化后的醛基进行反应。

血管紧张素II多肽的氨基酸序列为DRVYIHPF(1-8)其部分肽键不稳定，容易在缓冲液体系下降解。并且，此前的酶标抗原的制备方法中，交联反应的周期较长，且反应条件对血管紧张素的稳定性会产生进一步干扰。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供性质稳定的人工修饰的血管紧张素II及血管紧张素Ⅱ酶标记物。

本发明提供了人工修饰的血管紧张素II，其在血管紧张素II的N端或C端修饰有X(G

本发明通过对多肽片段的序列或是空间构型进行一定的修饰，以期提高血管紧张素II的稳定性，同时不影响特异性抗体的识别。具体的，本发明在血管紧张素II的N端或C端引入一定个数的亲水性氨基酸(G，S等)，并在最端侧引入赖氨酸(K)得到游离的伯氨基用于交联，并对C端进行酰胺化用来防止氨基酸的水解以及对氨基酸结构进行环化修饰等，从而抑制血管紧张素II的降解。其中，X表示任意氨基酸，G为Gly，甘氨酸。S为Ser，丝氨酸。K为Lys，赖氨酸。本发明所述的人工修饰的血管紧张素II中，X为K或G，a为1～5的整数，b为1～3的整数，c＝0或1，d为1或2。一些实施例中，所述修饰包括：KGGSK、KGGS或GGGSGGSG。

一些具体实施例中，所述人工修饰的血管紧张素II为如下任一种：

KGGSKDRVYIHPF，

KGGSKDRVYIHPF-NH

KGGSDRVYIHPFHLVI，

KGGSDRVYIHPFHLVI-NH

KGGSDRVYIHPFHLVIGGGSGG，

GGGSGGSGDRVYIHPFGGGSGGSG，

KGGSKDRVYIHPF，其中第5位和13位氨基酸成环，

KGGSKYIHPFYIHPFHLVI其中第5位和19位氨基酸成环。

如上修饰后的血管紧张素II都具有良好的稳定性，经验证其中KGGSKDRVYIHPF-NH

生物酶与修饰多肽偶联后酶结合物的稳定性强于未加修饰的多肽。采用本发明修饰后肽段的酶结合物与未加修饰的多肽的酶结合物相比，酶结合物的稳定性大大提升。

本发明还提供了酶标记的血管紧张素II，其为酶标记的人工修饰的血管紧张素II；所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶中任一种。

具体的，本发明实施例中提供了辣根过氧化物酶标记的人工修饰的血管紧张素II。

本发明酶标记的血管紧张素II的制备方法，包括：使所述的人工修饰的血管紧张素II与生物酶交联，制得酶标记的血管紧张素II。

本发明方法通过对传统过碘酸钠法中交联比例，反应温度，反应pH，反应时间以及还原剂等方面进行了改良优化，大大提高了血管紧张素II酶标抗原的稳定性，同时提高了酶标结合物的反应性。

本发明用氧化剂过碘酸钠将辣根过氧化物酶结构中糖环上的邻羟基氧化成活泼的醛基，然后与人工修饰血管紧张素II N端的氨基进行还原胺化反应，经过后处理得到一种稳定高效的血管紧张素II酶标记物。

首先在辣根过氧化物酶水溶解中，加入一定量的过碘酸钠，利用过碘酸钠的氧化性将酶分子中糖环的邻羟基结构氧化开环生成为两个醛基，反应结束后，对反应进行淬灭，然后将反应溶液透析在醋酸缓冲体系中，透析除去小分子物质。

本发明所述生物酶在交联反应前经氧化，具体包括：在生物酶溶液中加入过碘酸钠溶液，18～22℃活化1～3h后以乙二醇终止反应，然后以醋酸盐缓冲液透析，获得氧化生物酶的溶液。一些实施例中，所述活化的反应包括20℃活化2h。所述乙二醇的添加量为每毫克辣根过氧化物酶加入30μL乙二醇，终止反应的时间为0.5h，温度为4℃。所述透析用pH4.4 0.01mM醋酸盐缓冲液4℃透析12h，透析期间换液3次。

本发明在交联反应开始就加入还原剂，然后调节合适pH条件下，将不稳定的西佛碱(Schiff base)缓慢还原为稳定的碳氮单键。

本发明实施例中，所述生物酶为辣根过氧化物酶。

对于辣根过氧化物酶所述交联反应包括：人工修饰的血管紧张素II的溶于水，获得溶液A，氰基硼氢化钠溶于水，获得溶液B，将所述氧化生物酶溶液与溶液A混合后，加入溶液B，中性条件下进行交联反应。

所述溶液A中人工修饰的血管紧张素II的浓度为5mg/ml。

所述溶液B中氰基硼氢化钠的浓度为5mg/ml。

所述氧化生物酶溶液与溶液A混合至氧化生物酶与人工修饰的血管紧张素II的摩尔比为1：(2～5)，优选为1:3。

所述加入加入溶液B至人工修饰的血管紧张素II与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:50。

所述中性条件下进行交联反应的条件为18～27℃反应8～12h。

所述交联反应后，酶标记的血管紧张素II经0.01M PBS pH7.2缓冲液中，18～27℃透析12h，所述透析期间换液3次。

本发明对传统过碘酸钠法使用的还原剂进行了改良优化，传统过碘酸钠法标记抗原实验周期为4-5d；本发明使用还原性更加温和的氰基硼氢化钠，在偶联反应的开始就开始加入，避免反应结束再加入还原剂，这样不仅缩短了实验周期还提高了交联的效率，并且提升了酶标结合物的反应性和酶标多肽的稳定性。

本发明所述酶标记的血管紧张素II或所述的制备方法制得的酶标记的血管紧张素II在制备血管紧张素II的检测试剂中的应用。

本发明还提供了一种血管紧张素II的检测试剂，其包括所述酶标记的血管紧张素II或所述的制备方法制得的酶标记的血管紧张素II。

本发明所述检测试剂中，所述透析获得的酶标记的血管紧张素II或所述的制备方法制得的酶标记的血管紧张素II的溶液与等体积丙三醇混合，获得酶标抗体制剂。

本发明还提供了一种血管紧张素II的检测方法，其以本发明所述的检测试剂经免疫学方法检测。

本发明提供了人工修饰血管紧张素II，其在血管紧张素II的N端或C端修饰有X(G

具体实施方式

本发明提供了人工修饰的血管紧张素II及血管紧张素II酶标记物。，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1人工修饰血管紧张素II的制备

委托生工生物工程有限公司加工合成KGGSKDRVYIHPF-NH

实施例2酶标记血管紧张素II的制备方法如下：

第一步，HRP的氧化

用去离子水将HRP配制成10mg/ml的溶液，过碘酸钠配制成10mg/ml的溶液，将等体积的过碘酸钠溶液加入到HRP溶液中，20℃条件下反应2h；按照30ul/mg HRP量加入所需乙二醇作为活化反应终止液，在4℃条件下反应1h；终止反应结束后，用pH 4.4 0.01mM醋酸盐缓冲液4℃透析12h，透析期间换液3次。透析结束后准确测量透析后的HRP浓度(可根据初始反应称量HRP质量计算HRP浓度)。

第二步，血管紧张素II和还原剂的准备

称取实施例1制备的修饰后的血管紧张素II的冻干粉，用去离子水溶解成5mg/ml，氰基硼氢化钠用去离子水溶解成5mg/ml，请注意使用前五分钟溶解。

第三步，交联反应

酶标抗体制备方法如下∶按照酶：多肽＝1:3(摩尔比例)，吸取适量的多肽溶液和酶溶液，并将多肽溶液缓慢的加入到酶溶液中，充分混匀后，再按照多肽：氰基硼氢化钠＝1:50(摩尔比例)加入适当体积的氰基硼氢化钠溶液。震荡混匀后，再用0.1M氢氧化钠水溶液，调节pH至7左右，室温避光震荡反应过夜。

第四步，后处理及保存

反应结束后，将反应液转移至透析袋中，密封透析在0.01M PBS pH7.2缓冲液中，室温透析12h，透析期间换液3次。透析结束后准确测量溶液的体积，并加入酶结合物等体积的丙三醇，混匀，-20℃低温避光保存，制备共用时两天。

对比例1

传统标记未人工修饰AII多肽-DRVYIHPF的制备

第一步，HRP的氧化

用去离子水将HRP配制成4mg/ml的溶液，过碘酸钠配制成21.4mg/ml的溶液，按照1mgHRP加入51ul 0.1M过碘酸钠溶液，将过碘酸钠溶液缓慢加入酶溶液中，用移液枪轻轻吹打混匀，放置于棕色保鲜盒中，4℃静置避光反应1h；按照1mgHRP加入26ul乙二醇终止反应，用移液枪轻轻吹打混匀(乙二醇粘度较大，需慢吸慢打)，4℃静置避光反应0.5h；终止反应结束后，用pH 4.4 0.01mM醋酸盐缓冲液4℃透析12h，透析期间换液3次。透析结束后准确测量透析后的HRP浓度(可根据初始反应称量HRP质量计算HRP浓度)。

第二步，多肽偶联

按照HRP/多肽(摩尔比)1/3，根据活化后HRP的浓度，计算出HRP的体积，将其加入提前溶解好的多肽溶液中(5mg/ml)；按照1mlHRP加入153ul 0.2M CB pH9.6调节反应的pH值；将反应容器放置于棕色保鲜盒中，4℃静置避光反应24-26小时；按照1mgHRP加入47ul0.106M硼氢化钠溶液(4mg/ml)终止反应，轻轻晃动瓶托混匀，置于棕色保鲜盒中，4℃静置避光反应2h。

第三步，后处理及保存

提前剪好透析袋，置于纯化水中，30min换液一次，更换两次方可使用；用0.067MPBS pH6.8(单次透析比不低于1:50)4℃避光透析，透析5次，期间换液4次；解透析袋，用移液枪量取体积并转入PET瓶内,加入等体积甘油，混匀。

对比例2

传统标记人工修饰AII多肽-KGGSKDRVYIHPF-NH2的制备

对比例2中的偶联物的标记过程同对比例1

效果验证

对实施例2和对比例制备的酶结合物进行96孔板式检测发光值和稳定数据，结果如下：

表1对比例1制备HRP标记的未人工修饰AII多肽-DRVYIHPF稳定性

表2传统制备HRP标记人工修饰AII多肽-KGGSKDRVYIHPF-NH

表3实施例2制备HRP标记人工修饰AII多肽-KGGSKDRVYIHPF-NH

结果表明，HRP与修饰多肽偶联后酶结合物的稳定性强于未加修饰的多肽。采用本发明修饰后肽段的酶结合物与未加修饰的多肽的酶结合物相比，酶结合物的稳定性大大提升。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。