一种自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶及其制备方法

摘要

本发明提供一种自交联的抗氧化型PCA‑g‑CMCS/OSA席夫碱水凝胶的制备方法，属于生物医学工程领域。步骤包括：1)通过羧甲基修饰CS得到可以在pH＞6.4范围溶解的CMCS，以期满足EDC/NHS和席夫碱的反应要求形成IPN水凝胶；2)通过碳二亚胺法将PCA接枝到CMCS上合成PCA‑g‑CMCS；3)通过改变反应pH、温度、质量浓度与OSA的醛基亚胺共轭形成席夫碱，制备抗氧化型水凝胶。引入PCA的席夫碱水凝胶具有三维多孔结构，支架孔径在100‑200μm之间分布均匀；具有较快的成胶能力；此外通过建立H

说明书

技术领域

本发明属于互穿聚合物网络复合材料生物医学工程技术领域，涉及一种自交联的抗氧化 型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶及其制备方法。

背景技术

原儿茶酸(Protocatechuic acid,PCA)等酚类化合物在诸多研究中已被证实具有重要的抗氧 化特性，并且在神经保护和修复氧化损伤过程中似乎是非常有价值的潜在药物，如PCA对氧 化应激、嘌呤能和胆碱能酶活性以及氧化脑损伤中失调的代谢途径的治疗作用。相比于其他 器官，肾脏、肝脏和大脑更容易发生氧化损伤的高耗氧率(20％的自身氧气消耗)，这种损伤的 特征主要体现为不饱和脂肪酸含量高，含铁量高，低水平的抗氧化剂和解毒酶，如超氧化物 歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)等，因此PCA等酚类化合物对于以自由基过量积累为特征的持续氧化应激损伤 的疾病治疗具有广阔的临床应用前景。然而在组织工程和再生医学实际应用过程中，PCA这 种小分子活性抗氧化物质存在着稳定性较差、血液循环半衰期短和有效剂量毒性等诸多不足 之处，因而难以长效发挥其抗氧化保护作用，通常需要与其他材料结合以形成更加稳定的抗 氧化复合材料。目前已设计构建了基于PCA多种形式的新材料，包括零维结构的碳点、一维 结构的抗氧化纳米纤维、二维结构的抗氧化涂层或者薄膜以及三维结构的抗氧化纳米粒子或 者抗氧化水凝胶等等。

羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMCS)是一种溶于水的壳聚糖(Chitosan,CS)衍生 物，其骨架含有多种活性官能团，当取代度达到60％以上，可以溶于酸性、中性和碱性环境。 CS的pH敏感性特点可因环境因素改变结构，在pH<5的酸性条件下可溶胀成胶，可用于药 物缓释，但在碱性介质中不稳定，大大限制了其应用范围。引入羧甲基基团的CS晶体结构 遭到破坏导致结晶度下降，从而改善了CS的水溶性。CMCS水凝胶具有增强组织渗透性和 药物停留时间的特性，这使它们成为很好的药物传递载体。近年来，多酚-CS共聚物包含了 酚酸和多糖两者优良的性质，在食品包装和生物医药研究领域十分热门。现如今，很多研究 报道植物多酚因其优异的生物活性在很多领域中发挥了各种功效，如抗氧化、抗肿瘤、抑菌、 抗心脑血管疾病等。孙等采用离子交联法将CMCS与叶酸(FA)复合制备出FA-CMCS复合物， 利用断尾取血法探究复合物的凝血、止血性能，结果显示当FA和CMCS的质量比为2:5时， 二者基团的作用力最强，复合物结构最稳定，凝血、止血效果最好。本课题组如Xu等通过 碳二亚胺法制备了PCA-g-CMCS凝胶支架，表现出明显的DPPH和ABTS自由基清除活性和 抗氧化能力，并且能保持体外药物释放。另外有研究表明，多种酚酸偶联CMCS对大肠杆菌 和金黄色葡萄球菌的生长产生抑制且具有较强的抗氧化性。可以预见，基于CMCS的改性抗 氧化复合材料有望成为治疗神经退行性疾病的良好抗氧化生物材料。

海藻酸钠(Sodium alginate,SA)是一种从褐藻和马尾藻提取的廉价天然多糖，具有乳化功 能和热稳定性，在生物医药、组织工程和医用敷料等多个领域得到广泛应用。CMCS和SA 分子含有大量的羟基和羧基基团活性位点，通过氯化钙和戊二醛进行化学交联形成双网络凝 胶微球或凝胶作为药物载体，这种凝胶表现出很高的包埋率和优秀的释放效果。这种反应存 在明显的缺陷，一方面戊二醛反应条件温和但是具有毒性；另一方面，钙离子通过置换SA 中的钠离子形成海藻酸钙，但是这种反应是可逆的，在水溶液中能够稳定保持凝胶状态，但 在含有钠、钾离子的生理环境发生逆向反应导致分子网络不稳定。目前关于SA的改性有诸 多研究报道，其中，通过NaIO

IPN通过原位交联的方式形成能够自愈合的动态三维结构，作为药物载体在生物医学领 域被广泛研究。此前本课题组通过碳二亚胺的方式二次交联成功合成PCA-g-CMCS水凝胶， 存在着制备过程复杂、机械性能差、成胶速度慢等问题，而CMCS/OSA负载药物制备的复合 水凝胶材料在发挥药效过程存在着药物损耗大的缺陷。本发明通过碳二亚胺的方式将PCA抗 氧化物质接入到CMCS/OSA水凝胶骨架，一是可以提高药物的生物利用率，二是通过化学的 方式引入可以提高分子间作用力，使三维结构更加紧密，由于水凝胶与组织细胞外基质的结 构相似，本发明合成的具有抗氧化性的水凝胶具有贯通的三维网络结构，可操控的成胶性能， 较强的抗氧化性和对氧化应激损伤模型具有明显的神经保护作用，有望用于神经组织工程领 域。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种自交联的抗氧化型席夫碱水凝胶及其制备方 法，即提供形成以壳聚糖CS衍生物为主骨架的互穿聚合物网络IPN三维结构的合成路径， 以CS为基础引入羧甲基亲水性基团提高高分子的水溶性，与原儿茶酸PCA在碳二亚胺 EDC/NHS酸性体系下发生分子间和分子内交联形成PCA-g-CMCS，再与氧化海藻酸钠OSA通过席夫碱作用形成亚胺共价键形成PCA-g-CMCS/OSA水凝胶，通过调节质量浓度、温度 和pH可以控制水凝胶成胶能力，具有很好孔隙结构、清除自由基能力和过氧化氢H

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

一种自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

第一步，制备两性电解质CMCS

所述的两性电解质CMCS能够同时满足碳二亚胺(酸性环境)和席夫碱(中、碱性环境)的反 应条件，提供大量羧基和氨基与PCA和含有醛基的OSA反应合成IPN水凝胶。包括以下步 骤：

S1、将壳聚糖(CS)和氢氧化钠(NaOH)加入到水和异丙醇的混合溶液中，室温下缓慢搅拌 使CS充分溶胀碱化，碱化1～3h，得到分散体系A。所述的每20ml水和异丙醇的混合溶液中， 对应加入2～6g的壳聚糖，对应加入2～10g的氢氧化钠。

第一步所述步骤S1中，水和异丙醇的混合溶液中，水和异丙醇的体积比为0.25～4：1。 第一步所述步骤S1中，磁力搅拌转速为10～15rpm。

S2、将一氯乙酸溶于异丙醇溶液中，得到溶液B，并将溶液B缓慢滴加到步骤S1制备的分散体系A中，所述滴加时间为20～30min，在25℃～50℃温度下搅拌2～8h。其中，每4ml异丙醇溶液中对应加入2～5g的一氯乙酸。每4ml异丙醇溶液对应加入步骤S1中10～20ml的分散体系A。

S3、室温下，向步骤S2反应完成后的CS分散介质中加入无水乙醇溶液，磁力搅拌0.5-2h 以中止反应。所述的步骤S1每20ml的分散体系A，对应加入50-100ml无水乙醇溶液。

S4、将步骤S3得到的反应产物过滤，用水和乙醇混合溶液多次冲洗，脱盐脱水至滤液 pH值接近中性。所述乙醇浓度为80％(v/v)。

S5、将步骤S4得到的产物置于真空干燥箱内调整温度为100℃，真空干燥12～24h，获得 羧甲基壳聚糖(CMCS)白色粉末。

第二步，基于两性电解质CMCS得到水溶性PCA-g-CMCS抗氧化接枝物

S1、将2～4mmolCMCS溶于PBS缓冲溶液配制2％(w/v)溶液；

S2、将原儿茶酸(PCA)溶于N,N二甲基甲酰胺(DMF)和2-吗啉乙烷磺酸(MES)缓冲溶液的 混合体系中，然后依次加入交联剂碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，得到混合溶液， 避光冰水浴1～3h以活化羧基，得到活化溶液。所述混合溶液中，MES浓度为100mM，DMF 和MES总体积为18ml。所述的PCA的物质的量为1mmol，PCA与交联剂EDC和NHS的摩 尔比为1：1：1。

第二步所述步骤S2中，N,N二甲基甲酰胺(DMF)和2-吗啉乙烷磺酸(MES)缓冲溶液的混 合体系中，N,N二甲基甲酰胺(DMF)和2-吗啉乙烷磺酸(MES)的体积比为1：9。其中，MES缓冲溶液的pH为5.5。

S3、将步骤S2的活化溶液缓慢加入到S1步骤的CMCS溶液，每18ml活化液中对应加入10～30mlCMCS溶液，调节反应体系的pH值为6～7，将反应体系置于室温下避光磁力搅拌18h。第二步所述步骤S3中，采用1M盐酸HCl和1M NaOH调节反应体系的pH值。

S4、将步骤S3得到的反应溶液加入到透析袋中透析2～3天，并离心去除小分子物质；所 述透析袋的分子截留量为3500Da，离心速度为2500rpm，时间为5min。透析期间每8h换一 次超纯水以加快纯化速度，得到纯化的接枝物。

S5、将步骤S4中纯化溶液加入到孔板-20～-30℃的冰箱中冷冻4～7h，将冷冻后的纯化产 物冷冻干燥，得到海绵状PCA-g-CMCS接枝物，避光保存。真空冷冻干燥中冷阱的温度为 -40～-60℃，时间为36～48h。

第三步，制备提供大量醛基活性位点氧化海藻酸钠(OSA)的高分子材料

S1、将海藻酸钠(SA)分散于乙醇中，得到分散体系A；高碘酸钠溶解于超纯水中，得到 溶液B。所述的每25ml乙醇，对应加入3～12g海藻酸钠(SA)。所述的每25ml超纯水，对应加入2～6g高碘酸钠。

S2、将步骤S1中的溶液B加入到分散体系A中，避光连续搅拌4～10h，得到混合溶液A。 所述溶液B与分散体系A的体积比为1～3：1。

S3、向反应体系加入乙二醇，继续磁力搅拌30～60min以淬灭氧化反应，得到混合溶液B。 所述的每25ml步骤S2混合溶液A，对应加入0.5～1ml乙二醇。

S4、继续加入NaCl和无水乙醇析出沉淀，抽滤，真空干燥得到白色固体，重新溶于水 用透析袋透析2～4天，离心去除不溶物，得到纯化液体。所述透析袋的分子截留量为8000-14000Da，离心速度为2500rpm，时间为5min。所述的每25ml步骤S3混合溶液B，对 应加入1～3gNaCl和100～200ml无水乙醇。

S5、将步骤S4得到的纯化液体置于-20～-30℃冰箱冷冻4～6h，冷冻干燥2得到纯化的OSA。 所述真空冷冻干燥温度为-40～-60℃，时间为36～48h。

第四步，制备自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶

原儿茶酸接枝羧甲基壳聚糖聚合物与氧化海藻酸钠自交联形成IPN三维多孔结构，具有 较强的抗氧化能力和对H

S1、将第二步制备的水溶性PCA-g-CMCS接枝物溶于PBS缓冲溶液(pH＝6.5～7.4)，得到 PCA-g-CMCS溶液；所述PCA-g-CMCS溶液浓度为2～3％(w/v)。

S2、将第三步制备的OSA醛基大分子溶于PBS缓冲溶液(pH＝6.5～7.4)，得到OSA溶液； 所述OSA溶液浓度为3～10％(w/v)。

S3、将步骤S1中的溶液和步骤S2中的溶液以体积比为1～10：1混合，在25～50℃下自 交联得到湿态PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶。

S4、将步骤S3得到的水凝胶材料放于-20～-30℃冰箱冷冻4～6h，经真空冷冻干燥后得到 PCA-g-CMCS/OSA干态支架；所述真空冷冻干燥温度为-40～-60℃，时间为18～24h。

一种自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶，采用上述制备方法制得。

采用上述方案，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明以CS为主骨架提供满足IPN均相水凝胶反应要求的CMCS的合成路径，用于解决由于CS水溶性有限(仅在酸性或碱性环境溶解)从而导致在EDC/NHS酸性体系、席夫碱碱性体系反应过程中出现的相分离问题。将PCA小分子抗氧化剂和OSA含醛基的大分子交联剂引入CMCS骨架使得该水凝胶材料具备优良的抗氧化能力和可控的成胶性能，并且对H

(2)本发明采用的水凝胶原料CMCS和OSA均具备良好的生物相容性，对人体无害，因此这种原位交联水凝胶材料可通过注射形式植入体内，可应用于神经组织工程以清除体内 积累的过量自由基减缓氧化应激损伤，。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的CMCS、PCA-g-CMCS、OSA、PCA-g-CMCS/OSA Ⅰ的傅 里叶红外变换(FTIR)谱图；图1(a)为波数在4000-400cm-1范围内的FTIR谱图；图1(b) 为波数在4000-400cm-1范围内的FTIR谱图；

图2为本发明实施例1制备的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA Ⅰ席夫碱水凝胶对应的实物图 和SEM图；图2(a)为放大倍数为400X的SEM图；图2(b)为放大倍数为600X的SEM 图；图2(c)为放大倍数为2500X的SEM图；

图3为本发明实施例1制备的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA Ⅰ席夫碱水凝胶对H

具体实施方式

下面结合附图和表以及实施例对本文发明的具体实施方式作进一步说明，但不限定于本 发明。

实施例1

一种自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶的制备方法(标记为 PCA-g-CMCS/OSAⅠ)，其包括如下步骤：包括(1)CMCS的制备、(2)水溶性PCA-g-CMCS 接枝物的制备、(3)OSA的制备和(4)PCA-g-CMCS/OSA水凝胶的制备。具体如下：

第一步，制备两性电解质CMCS，包括以下步骤：

S1、将2gCS和2.7g NaOH加入到20ml水和异丙醇的混合溶液中，其中水和异丙醇的体 积比为0.25：1，室温下以15rpm转速缓慢搅拌使CS充分溶胀碱化，碱化3h，得到分散体系A。

S2、将3g一氯乙酸溶于4ml异丙醇溶液中，得到溶液B，并将溶液B缓慢滴加到步骤S1制备的分散体系A中，所述滴加时间为25min，在50℃温度下搅拌3h。

S3、室温下，向步骤S2反应完成后的20mlCS分散体系A中加入80ml无水乙醇溶液，磁力搅拌2h以中止反应。

S4、将步骤S3得到的反应产物过滤，用水和乙醇混合溶液多次冲洗，脱盐脱水至滤液 pH值接近中性。所述乙醇浓度为80％(v/v)。

S5、将步骤S4得到的产物置于真空干燥箱内调整温度为100℃，真空干燥24h，获得CMCS 白色粉末。

第二步，基于两性电解质CMCS得到水溶性PCA-g-CMCS抗氧化接枝物，包括以下步骤：

S1、将2mmolCMCS溶于PBS缓冲溶液配制2％(w/v)溶液；

S2、将1mmolPCA溶于18mlDMF和100mMMES缓冲溶液(pH＝5.5)的混合体系中， 其中DMF和MES的体积比为1：9，然后依次加入交联剂EDC、NHS，得到混合溶液，避 光冰水浴1h以活化羧基，得到活化溶液，其中PCA与交联剂EDC和NHS的摩尔比为1：1： 1。

S3、将步骤S2的18ml活化溶液缓慢加入到S1步骤的23mlCMCS溶液，用1MHCl和 1MNaOH调节反应体系的pH值为6.5，将反应体系置于室温下避光磁力搅拌18h。

S4、将步骤S3得到的反应溶液加入到透析袋中透析2天，并离心去除小分子物质；所述 透析袋的分子截留量为3500Da，离心速度为2500rpm，时间为5min。透析期间每8h换一次 超纯水以加快纯化速度，得到纯化的接枝物。

S5、将步骤S4中纯化溶液加入到孔板-20℃的冰箱中冷冻4h，将冷冻后的纯化产物冷冻 干燥，得到海绵状PCA-g-CMCS接枝物，避光保存。真空冷冻干燥中冷阱的温度为-50℃， 时间为48h。

第三步，制备提供大量醛基活性位点OSA的高分子材料，包括以下步骤：

S1、将2.5gSA分散于25ml乙醇中，得到分散体系A；2.5g高碘酸钠溶解于25ml超纯水中，得到溶液B。

S2、将步骤S1中的溶液B加入到分散体系A中，其中溶液B和分散体系A的体积比为1：1，避光连续搅拌6h，得到混合溶液A。

S3、向反应体系加入0.5ml乙二醇，继续磁力搅拌30min以淬灭氧化反应，得到混合溶 液B。

S4、继续加入1gNaCl和100ml无水乙醇析出沉淀，抽滤，真空干燥得到白色固体，重新溶于水用分子截留量为8000-14000Da的透析袋透析3天，以2500rpm转速离心5min去除不溶物，得到纯化液体。

S5、将步骤S4得到的纯化液体置于-20℃冰箱冷冻4h，冷冻干燥得到纯化的OSA。所述 真空冷冻干燥温度为-60℃，时间为42h。

第四步，制备自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶：

S1、将第二步制备的水溶性PCA-g-CMCS接枝物溶于PBS缓冲溶液(pH＝7.4)，得到PCA-g-CMCS溶液；所述PCA-g-CMCS溶液浓度为3％(w/v)。

S2、将第三步制备的OSA醛基大分子溶于PBS缓冲溶液(pH＝7.4)，得到OSA溶液；所述OSA溶液浓度为6％(w/v)。

S3、将步骤S1中的溶液和步骤S2中的溶液以体积比为6：1混合，在25℃下自交联得到湿态PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶。

S4、将步骤S3得到的水凝胶材料放于-30℃冰箱冷冻6h，经真空冷冻干燥后得到PCA-g-CMCS/OSA干态支架；所述真空冷冻干燥温度为-60℃，时间为18h。

实施例2

一种自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶的制备方法(标记为 PCA-g-CMCS/OSAⅡ)，其包括如下步骤：包括(1)CMCS的制备、(2)水溶性PCA-g-CMCS 接枝物的制备、(3)OSA的制备和(4)PCA-g-CMCS/OSA水凝胶的制备。具体如下：

第一步，制备两性电解质CMCS：

S1、将6g CS和10g NaOH加入到20ml水和异丙醇的混合溶液中，其中水和异丙醇的体 积比为1：1，室温下以10rpm转速缓慢搅拌使CS充分溶胀碱化，碱化1h，得到分散体系A。

S2、将2g一氯乙酸溶于4ml异丙醇溶液中，得到溶液B，并将溶液B缓慢滴加到步骤S1制备的分散体系A中，所述滴加时间为20min，在25℃温度下搅拌8h。

S3、室温下，向步骤S2反应完成后的20ml CS分散介质中加入100ml无水乙醇溶液，磁力搅拌0.5h以中止反应。

S4、将步骤S3得到的反应产物过滤，用水和乙醇混合溶液多次冲洗，脱盐脱水至滤液 pH值接近中性。所述乙醇浓度为80％(v/v)。

S5、将步骤S4得到的产物置于真空干燥箱内调整温度为100℃，真空干燥18h，获得CMCS 白色粉末。

第二步，基于两性电解质CMCS得到水溶性PCA-g-CMCS抗氧化接枝物，包括以下步骤：

S1、将4mmolCMCS溶于PBS缓冲溶液配制2％(w/v)溶液；

S2、将1mmol PCA溶于18ml DMF和100mM MES缓冲溶液(pH＝5.5)的混合体系中，其中DMF和MES的体积比为1：9，然后依次加入交联剂EDC、NHS，得到混合溶液，避 光冰水浴3h以活化羧基，得到活化溶液，其中PCA与交联剂EDC和NHS的摩尔比为1：1： 1。

S3、将步骤S2的18ml活化溶液缓慢加入到S1步骤的10ml CMCS溶液，用1MHCl和 1MNaOH调节反应体系的pH值为6，将反应体系置于室温下避光磁力搅拌18h。

S4、将步骤S3得到的20反应溶液加入到透析袋中透析2天，并离心去除小分子物质； 所述透析袋的分子截留量为3500Da，离心速度为2500rpm，时间为5min。透析期间每8h换 一次超纯水以加快纯化速度，得到纯化的接枝物。

S5、将步骤S4中纯化溶液加入到孔板-30℃的冰箱中冷冻6h，将冷冻后的纯化产物冷冻 干燥，得到海绵状PCA-g-CMCS接枝物，避光保存。真空冷冻干燥中冷阱的温度为-40℃， 时间为42h。

第三步，制备提供大量醛基活性位点OSA的高分子材料，包括以下步骤：

S1、将12g SA分散于25ml乙醇中，得到分散体系A；2g高碘酸钠溶解于25ml超纯水中，得到溶液B。

S2、将步骤S1中的溶液B加入到分散体系A中，避光连续搅拌4h，得到混合溶液A。所述溶液B与分散体系A的体积比为3：1。

S3、向反应体系加入乙二醇，继续磁力搅拌60min以淬灭氧化反应，得到混合溶液B。 所述的每25ml步骤S2混合溶液A，对应加入1ml乙二醇。

S4、继续加入3gNaCl和200ml无水乙醇析出沉淀，抽滤，真空干燥得到白色固体，重新溶于水用分子截留量为8000-14000Da的透析袋透析2天，以2500rpm转速离心5min去除不溶物，得到纯化液体。

S5、将步骤S4得到的纯化液体置于-30℃冰箱冷冻5h，冷冻干燥得到纯化的OSA。所述 真空冷冻干燥温度为-50℃，时间为36h。

第四步，制备自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶：

S1、将第二步制备的水溶性PCA-g-CMCS接枝物溶于PBS缓冲溶液(pH＝6.5)，得到PCA-g-CMCS溶液；所述PCA-g-CMCS溶液浓度为2.5％(w/v)。

S2、将第三步制备的OSA醛基大分子溶于PBS缓冲溶液(pH＝7.4)，得到OSA溶液；所述OSA溶液浓度为10％(w/v)。

S3、将步骤S1中的溶液和步骤S2中的溶液以体积比为10：1混合，在50℃下自交联得 到湿态PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶。

S4、将步骤S3得到的水凝胶材料放于-20℃冰箱冷冻4h，经真空冷冻干燥后得到PCA-g-CMCS/OSA干态支架；所述真空冷冻干燥温度为-50℃，时间为20h。

实施例3

一种自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶的制备方法(标记为 PCA-g-CMCS/OSAⅢ)，其包括如下步骤：包括(1)CMCS的制备、(2)水溶性PCA-g-CMCS 接枝物的制备、(3)OSA的制备和(4)PCA-g-CMCS/OSA水凝胶的制备。具体如下：

第一步，制备两性电解质CMCS，包括以下步骤：

S1、将2g CS和2g NaOH加入到20ml水和异丙醇的混合溶液中，其中水和异丙醇的体 积比为4：1，室温下以12rpm转速缓慢搅拌使CS充分溶胀碱化，碱化2h，得到分散体系A。

S2、将5g一氯乙酸溶于4ml异丙醇溶液中，得到溶液B，并将溶液B缓慢滴加到步骤S1制备的分散体系A中，所述滴加时间为30min，在25℃温度下搅拌8h。

S3、室温下，向步骤S2反应完成后的CS分散介质中加入无水乙醇溶液，磁力搅拌0.5h 以中止反应。所述的步骤S1每10ml的分散体系A，对应加入50ml无水乙醇溶液。

S4、将步骤S3得到的反应产物过滤，用水和乙醇混合溶液多次冲洗，脱盐脱水至滤液 pH值接近中性。所述乙醇浓度为80％(v/v)。

S5、将步骤S4得到的产物置于真空干燥箱内调整温度为100℃，真空干燥12h，获得CMCS 白色粉末。

第二步，基于两性电解质CMCS得到水溶性PCA-g-CMCS抗氧化接枝物，包括以下步骤：

S1、将3mmolCMCS溶于PBS缓冲溶液配制2％(w/v)溶液；

S2、将1mmol PCA溶于18ml DMF和100mM MES缓冲溶液(pH＝5.5)的混合体系中，其中DMF和MES的体积比为1：9，然后依次加入交联剂EDC、NHS，得到混合溶液，避 光冰水浴2h以活化羧基，得到活化溶液，其中PCA与交联剂EDC和NHS的摩尔比为1：1： 1。

S3、将步骤S2的活化溶液缓慢加入到S1步骤的CMCS溶液，每18ml活化液中对应加入30ml CMCS溶液，用1MHCl和1M NaOH调节反应体系的pH值为7，将反应体系置于室 温下避光磁力搅拌18h。

S4、将步骤S3得到的反应溶液加入到透析袋中透析2.5天，并离心去除小分子物质；所 述透析袋的分子截留量为3500Da，离心速度为2500rpm，时间为5min。透析期间每8h换一 次超纯水以加快纯化速度，得到纯化的接枝物。

S5、将步骤S4中纯化溶液加入到孔板-25℃的冰箱中冷冻4h，将冷冻后的纯化产物冷冻 干燥，得到海绵状PCA-g-CMCS接枝物，避光保存。真空冷冻干燥中冷阱的温度为-60℃， 时间为36h。

第三步，制备提供大量醛基活性位点OSA的高分子材料，包括以下步骤：

S1、将3g SA分散于25ml乙醇中，得到分散体系A；4g高碘酸钠溶解于25ml超纯水中， 得到溶液B。

S2、将步骤S1中的溶液B加入到分散体系A中，避光连续搅拌10h，得到混合溶液A。所述溶液B与分散体系A的体积比为2：1。

S3、向反应体系加入0.8ml乙二醇，继续磁力搅拌45min以淬灭氧化反应，得到混合溶 液B。

S4、继续加入2g NaCl和150ml无水乙醇析出沉淀，抽滤，真空干燥得到白色固体，重 新溶于水用分子截留量为8000-14000Da的透析袋透析4天，以2500rpm转速离心5min去除 不溶物，得到纯化液体。

S5、将步骤S4得到的纯化液体置于-25℃冰箱冷冻6h，冷冻干燥得到纯化的OSA。所述 真空冷冻干燥温度为-40℃，时间为48h。

第四步，制备自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶，包括以下步骤：

S1、将第二步制备的水溶性PCA-g-CMCS接枝物溶于PBS缓冲溶液(pH＝6.5)，得到PCA-g-CMCS溶液；所述PCA-g-CMCS溶液浓度为2％(w/v)。

S2、将第三步制备的OSA醛基大分子溶于PBS缓冲溶液(pH＝6.5)，得到OSA溶液；所述OSA溶液浓度为8％(w/v)。

S3、将步骤S1中的溶液和步骤S2中的溶液以体积比为1：1混合，在37℃下自交联得到湿态PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶。

S4、将步骤S3得到的水凝胶材料放于-25℃冰箱冷冻5h，经真空冷冻干燥后得到PCA-g-CMCS/OSA干态支架；所述真空冷冻干燥温度为-40℃，时间为24h。

实施例4

一种自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶的制备方法(标记为 PCA-g-CMCS/OSAⅣ)，其包括如下步骤：包括(1)CMCS的制备、(2)水溶性PCA-g-CMCS 接枝物的制备、(3)OSA的制备和(4)PCA-g-CMCS/OSA水凝胶的制备。具体如下：

第一步，制备两性电解质CMCS，包括以下步骤：

S1、将4g CS和6g NaOH加入到20ml水和异丙醇的混合溶液中，其中水和异丙醇的体 积比为0.25：1，室温下以15rpm转速缓慢搅拌使CS充分溶胀碱化，碱化3h，得到分散体系A。

S2、将2g一氯乙酸溶于4ml异丙醇溶液中，得到溶液B，并将溶液B缓慢滴加到步骤S1制备的分散体系A中，所述滴加时间为30min，在25℃温度下搅拌8h。

S3、室温下，向步骤S2反应完成后的CS分散体系中加入50ml无水乙醇溶液，磁力搅拌2h以中止反应。所述的步骤S1每20ml的分散体系A，对应加入50ml无水乙醇溶液。

S4、将步骤S3得到的反应产物过滤，用水和乙醇混合溶液多次冲洗，脱盐脱水至滤液 pH值接近中性。所述乙醇浓度为80％(v/v)。

S5、将步骤S4得到的产物置于真空干燥箱内调整温度为100℃，真空干燥24h，获得CMCS 白色粉末。

第二步，基于两性电解质CMCS得到水溶性PCA-g-CMCS抗氧化接枝物，包括以下步骤：

S1、将2mmolCMCS溶于PBS缓冲溶液配制2％(w/v)溶液；

S2、将1mmol PCA溶于18ml DMF和100mM MES缓冲溶液(pH＝5.5)的混合体系中，其中DMF和MES的体积比为1：9，然后依次加入交联剂EDC、NHS，得到混合溶液，避 光冰水浴3h以活化羧基，得到活化溶液，其中PCA与交联剂EDC和NHS的摩尔比为1：1： 1。

S3、将步骤S2的18ml活化溶液缓慢加入到S1步骤的30ml CMCS溶液，用1MHCl和 1MNaOH调节反应体系的pH值为6.5，将反应体系置于室温下避光磁力搅拌18h。

S4、将步骤S3得到的反应溶液加入到透析袋中透析3天，并离心去除小分子物质；所述 透析袋的分子截留量为3500Da，离心速度为2500rpm，时间为5min。透析期间每8h换一次 超纯水以加快纯化速度，得到纯化的接枝物。

S5、将步骤S4中纯化溶液加入到孔板-20℃的冰箱中冷冻5h，将冷冻后的纯化产物冷冻 干燥，得到海绵状PCA-g-CMCS接枝物，避光保存。真空冷冻干燥中冷阱的温度为-50℃， 时间为48h。

第三步，制备提供大量醛基活性位点OSA的高分子材料，包括以下步骤：

S1、将3g SA分散于25ml乙醇中，得到分散体系A；2g高碘酸钠溶解于25ml超纯水中， 得到溶液B。

S2、将步骤S1中的溶液B加入到分散体系A中，避光连续搅拌4h，得到混合溶液A。所述溶液B与分散体系A的体积比为2：1。

S3、向反应体系加入乙二醇，继续磁力搅拌60min以淬灭氧化反应，得到混合溶液B。 所述的每25ml步骤S2混合溶液A，对应加入0.5ml乙二醇。

S4、继续加入2g NaCl和150ml无水乙醇析出沉淀，抽滤，真空干燥得到白色固体，重 新溶于水用分子截留量为8000-14000Da的透析袋透析4天，以2500rpm转速离心5min去除 不溶物，得到纯化液体。

S5、将步骤S4得到的纯化液体置于-20℃冰箱冷冻6h，冷冻干燥得到纯化的OSA。所述 真空冷冻干燥温度为-50℃，时间为36h。

第四步，制备自交联的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝，包括以下步骤：

S1、将第二步制备的水溶性PCA-g-CMCS接枝物溶于PBS缓冲溶液(pH＝7.0)，得到PCA-g-CMCS溶液；所述PCA-g-CMCS溶液浓度为3％(w/v)。

S2、将第三步制备的OSA醛基大分子溶于PBS缓冲溶液(pH＝7.0)，得到OSA溶液；所述OSA溶液浓度为3％(w/v)。

S3、将步骤S1中的溶液和步骤S2中的溶液以体积比为1：1混合，在25℃下自交联得到湿态PCA-g-CMCS/OSA席夫碱水凝胶。

S4、将步骤S3得到的水凝胶材料放于-20℃冰箱冷冻4h，经真空冷冻干燥后得到PCA-g-CMCS/OSA干态支架；所述真空冷冻干燥温度为-40℃，时间为22h。

表1

表1为实施例1得到的CMCS的溶解范围。取0.2mg CMCS溶解到10mL HCl溶液(0.1M)， 连续搅拌，每加入100μl NaOH(0.1M)观察CMCS的溶解情况，用PHS-3C雷磁pH计记录溶 液变化的pH值。此前本课题组已成功合成溶解范围在pH≤5.75和pH≥7.25的CMCS，这种 仅溶于酸性或碱性的CMCS和PCA在EDC/NHS体系可以通过调节pH和投料比提高接枝率，但是与OSA反应时出现明显的相分离现象。多项研究表明，CMCS与OSA结合的席夫碱反 应一般在接近中性或偏碱性的pH条件下是稳定的。通过优化反应条件(异丙醇浓度、碱化时 间、反应时间和反应温度)来调整羧甲基含量，以改善制备的CMCS的pH溶解范围，使其能 够有效地进行后续的PCA接枝和OSA席夫碱反应。在80％(v/v)异丙醇的分散介质能够使 NaOH在CS体系中充分渗透和扩散，有助于提高氯乙酸的利用率，使合成的CMCS的pH溶 解区为中性。在溶胀和碱化过程中，NaOH的Na

采用傅里叶红外光谱仪分析对实施例1进行结构分析。将待测样品置于液氮环境下用研 钵研磨成粉末，干燥过夜并密封储存。样品粉与KBr晶体按一定质量比研磨干燥后，取少量 压制透明薄片。在400-4000cm

表2

水凝胶的凝胶时间用倾斜试验法测定，简单地说，两种溶液混合后立即注入玻璃试管中。 实验每5秒钟水平倾斜一次试管，记录样品停止流动时的凝胶时间。表2为为本发明实施例1制备的抗氧化型PCA-g-CMCS/OSA Ⅰ席夫碱水凝胶对应的成胶时间。席夫碱水凝胶可以原 位包封药物或细胞，匹配任何形状的受损组织，以最小的侵入性方法减轻患者的痛苦，并易 于给药。大量研究报道CS衍生物可与含醛基的高分子材料形成自交联水凝胶，如N-琥珀酰 壳聚糖(NSC)/氧化半乳甘露聚糖(OxGM)(9.7min)、氨基羧甲基壳聚糖(A-CS)/OSA(5～10min)。 同有研究表明，通过控制OSA的含量，可以调控水凝胶的成胶时间。在此发明中， PCA-g-CMCS/OSAⅠ能够在130-160s快速凝胶化，与此前研究的CS衍生物和含醛基大分子 形成的席夫碱水凝胶相比，成胶时间更短，说明PCA的接枝也缩短了水凝胶的凝胶时间。这 可能是因为在合成PCA-g-CMCS的过程中，CMCS的羧基和氨基也同时进行了自交联，从而 延长了分子链，促进了凝胶的形成。因此，PCA-g-CMCS/OSAⅠ水凝胶作为药物传递载体具 有很大的潜力，因为较短的凝胶时间可以减少药物从聚合物混合物的溶液状态向外扩散。

通过物理图片和扫描电镜观察了冻干水凝胶的形貌。如图2所示，干态PCA-g-CMCS/OSA Ⅰ水凝胶支架呈粉色，具有三维网络结构。对水凝胶图像进行局部放大后，可以明显看出水 凝胶具有多孔结构，局部呈固体颗粒状。这可能是由于PCA-g-CMCS/OSAⅠ引入了具有苯 环结构的疏水基团PCA，降低了水凝胶的亲水性和溶解度。适当改变表面粗糙度，增加比表 面积有利于细胞粘附。此外，细胞粘附、细胞间相互作用和细胞跨膜迁移都取决于孔径大小。 PCA-g-CMCS/OSA水凝胶的孔径为100～200μm，50～160μm孔径的神经细胞生长最好，其孔 结构与体外培养的神经细胞相似。

通过H

本发明通过羧甲基修饰CS得到可以在pH＞6.4范围溶解的CMCS，以期满足EDC/NHS和席夫碱的反应要求形成IPN水凝胶；通过碳二亚胺法将PCA接枝到CMCS上合成 PCA-g-CMCS；通过改变反应pH、温度、质量浓度与OSA的醛基亚胺共轭形成席夫碱，制 备抗氧化型水凝胶支架。引入PCA的席夫碱水凝胶具有三维多孔结构，支架孔径在100-200 μm之间分布均匀；具有较快的成胶能力；此外通过建立H

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于 本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所做出的等同替换和显而易 见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。