一种化妆品原料体外3D全皮皮肤模型抗衰老功效的筛选方法

摘要

本发明公开了一种化妆品原料体外3D全皮皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，对目标原料的抗衰老活性进行筛选，包含免疫学、分子生物学、组织学、生理学四种维度的检测，构建化妆品原料的抗衰老功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效、全面的优势；为皮肤护理产品抗衰老活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为抗衰老原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种化妆品原料体外3D全皮皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，属 于化妆品原料性能测试技术领域。

背景技术

抗衰老类功效性护肤品的开发中，其活性原料的抗衰老功效评估是配方设计前期的重要步骤之一。传统活性原料抗衰老功效评价手段在《化妆品安全技术规范》 中并未涉及。目前主要的评价手段集中在对DPPH自由基、羟自由基等的清除效果 的实验，实验结果单一，实验维度单一，存在假阳性，对于原料筛选非常不方便。 随着生物学领域对于细胞、类器官、动物和人体的系统性研究的不断深入，采用多 维度的生物学手段对于原料的功效性评价已经逐渐替代单一的实验。同时，随着3R 原则的循环经济理念推出，3R原则已经成为生物医药科学研究及相关法规管理普遍 遵守的准则，欧洲化妆品法规也颁布了关于动物实验在化妆产品中的禁令，这些法 规的变化促进了体外替代验证方法的开发及应用。3D皮肤模型由于具有与人体皮 肤结构和生理功能相似的特点，已经成为体外替代实验中的优良实验模型。那么， 构建体外替代功效验证方法有助于更为经济高效地实现抗衰老类化妆品原料的开发 和筛选。

皮肤的衰老通常是由于真皮层的胶原蛋白的流失、氧化应激通路的激活、皮肤 屏障受损、外界环境因素(紫外线照射、雾霾、尾气、PM2.5等)的影响所造成的。 当皮肤出现衰老之后，皮肤的水分值降低，基质金属蛋白酶MMP家族的基因表达 上调，胶原蛋白collagen家族基因表达下调，真表皮连接处的相关基因和蛋白表达 下调等。3D全皮皮肤模型拥有与人正常皮肤相似的生理和结构，并且市售3D全皮 皮肤为统一化生产，结构特征较为稳定，利用3D全皮皮肤模型进行抗衰老活性物 的检测，可以用3D全皮皮肤模型模拟真实皮肤的逐渐衰老的状态，同时评估化妆 品原料的抗衰老功效。在转录组学水平、蛋白组学水平、组织学水平和生理学水平， 目前利用3D全皮皮肤模型+四种评估维度结合，综合评估化妆品原料抗衰老功效的 体外方法还未见相关专利和文献报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种化妆品原料体外3D全皮皮肤 模型抗衰老功效的筛选方法，包含四种维度的评价手段，包含免疫学、分子生物学、 组织学、生理学四种维度的检测，构建化妆品原料的抗衰老功效评价方法，属于系 统型评估方法，具有快速、高效的优势。

实现上述目的的技术方案是：一种化妆品原料体外3D全皮皮肤模型抗衰老功 效的筛选方法，其特征在于，利用3D全皮皮肤模型，从四个维度对目标原料的抗 衰老活性进行筛选，具体包括以下步骤：

S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；

S2，3D全皮皮肤模型培养；

S3，3D全皮皮肤模型活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：

S31，取步骤S2中生长状态稳定3D全皮皮肤模型，加入实验样品，所述实验 样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培 养3天～10天，用MTT检测3D全皮皮肤模型组织存活率；

S32，筛选得到CV90时对应的原料样品3D全皮皮肤模型给药浓度，所述CV90 代表3D皮肤组织存活率为90％；

S4，3D全皮皮肤模型的水分值检测步骤、基因表达检测步骤、免疫荧光检查 步骤及真皮层厚度检测步骤，包括以下工序：

S41，取步骤S2中生长状态稳定的3D全皮皮肤，设置阴性对照组及样品组， 所述阴性对照组加入缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原 料样品，将阴性对照组及样品组分别培养3天～10天；

S42，对步骤S41中培养完成的3D全皮皮肤模型进行收集，实施3D全皮皮肤 模型水分值表达检测；

S43，对步骤S41中培养完成的3D全皮皮肤模型进行收集，分别实施3D全皮 皮肤模型中MMP9、COL3A1、Elastin、Nrf2的基因表达检测；

S44，对步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，进行石蜡包埋和切 片，然后分别实施3D全皮皮肤模型中Collagen VI和proCollagen I的免疫荧光表达 检测；

S45，对步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，进行石蜡包埋和切 片，然后分别实施3D全皮皮肤模型中真皮层厚度的检测；

S5，评价步骤，具体包括以下内容：

S51，水分值检测的评价步骤：汇总步骤S42中水分值检测结果，计算检测原料 样品组与阴性对照组的水分值含量，比较样品组与阴性对照组的水分值，应用 GraphPadPrism作图，低于阴性对照组评分为0；高于阴性对照组评分为1；

S52，基因相对表达量的评价步骤：汇总步骤S43中基因表达检测结果，计算检 测原料样品组基因表达与阴性对照组的基因表达比值，得到基因的相对表达量，应 用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用Two-way ANOVA 统计分析；所有的统计分析均为双尾；

p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抗衰老作用，评 分为0.3；

p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抗衰老作用，评分为0.5；

p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极显著抗衰老 作用，评分为0.7；

p<0.0001认为具有极其显著差异，用“****”表示，说明该受试物具有极其显著 抗衰老作用，评分为1.0；

S53，免疫荧光表达评价步骤：汇总步骤S44中免疫荧光表达检测结果，应用 ImageJ计算荧光强度，结果表示为Mean±SD；按照荧光强度进行排序，数值越高， 说明受试物的抗衰老作用越强；应用GraphPad Prism作图，各组间比较采用Two- way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；

p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抗衰老作用，评 分为0.3；

p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抗衰老作用，评分为0.5；

p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极显著抗衰老 作用，评分为0.7；

p<0.0001认为具有极其显著差异，用“****”表示，说明该受试物具有极其显著 抗衰老作用，评分为1.0；

S54，真皮层厚度评价步骤：汇总步骤S45中真皮层厚度结果，比较样品组与阴 性对照组的厚度值，应用GraphPad Prism作图；低于阴性对照组评分为0；高于阴 性对照组评分为1；

S6，根据步骤S5的评分标准汇总所有检测指标评分，评分公式为：

原料得分＝水分值分值×0.1+基因相对表达量分值×0.1333+免疫荧光蛋白强度相对表达量分值×0.1333+真皮层厚度值分值×0.1；

其中，0.1、0.1333、0.1333和0.1为系数；基因相对表达量分值为MMP9、 COL3A1、Elastin、Nrf2的四种基因相对表达量分值之和；免疫荧光蛋白强度相对表 达量分值为Collagen VI和proCollagen I两种免疫荧光蛋白强度相对表达量分值之 和；根据原料得分筛选出具有最佳抗衰老功效的原料。

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，其中，在一 种具有表皮层和真皮层的3D全皮皮肤模型中，所实施的水分值检测构成生理学水 平评价指标，所实施的MMP9、COL3A1、Elastin、Nrf2的基因表达检测中至少一 种基因表达检测构成转录组学水平评价指标，所实施的Collagen VI和proCollagen I 的免疫荧光表达检测中至少一种免疫荧光表达检测构成蛋白组学水平评价指标；所 实施的真皮层厚度检查构成组织学水平评价指标。

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，步骤S1中， 水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；

水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜溶剂溶解后进行后续实验。

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，其中，使用 二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的5％，且对照样品 和实验样品中溶剂的体积比例相同。

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，步骤S2中， 3D皮肤采购配套专用培养基进行气液两相培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％ CO

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，步骤S32中， 每种待测原料样品配置CV90对应的给药浓度，每个浓度设2个及以上复孔。

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，步骤S42中， 水分值检测采用Courage+Khazaka皮肤水分测试仪探头对皮肤模型的水分值含量进 行测定。

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，步骤S43中，MMP9、COL3A1、Elastin和Nrf2的基因表达检测采用定量RT-PCR法。

上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，步骤S44中，Collagen VI和proCollagen I的免疫荧光表达是对相应的皮肤模型进行免疫荧光检测 得到免疫荧光定位和表达量。

本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，包含四种维度 的一种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了正常全皮皮肤表皮层和真皮层，构建 化妆品原料的抗衰老功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势； 为皮肤护理产品抗衰老活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为抗 衰老原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品 开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。

附图说明

图1为受试物1～4的T-skin全皮组织存活率；

图2为受试物1～4的T-skin全皮模型水分值含量；

图3a为受试物1～4的T-skin全皮模型基因MMP9的相对表达量；

图3b为受试物1～4的T-skin全皮模型基因COL3A1的相对表达量；

图3c为受试物1～4的T-skin全皮模型基因Elastin的相对表达量；

图3d为受试物1～4的T-skin全皮模型基因Nrf2的相对表达量；

图4a为受试物1～4的T-skin全皮模型蛋白Collagen VI的免疫荧光和image J 蛋白相对表达；

图4b为受试物1～4的T-skin全皮模型蛋白proCollagen I的免疫荧光和image J蛋白相对表达；

图5为受试物1～4的T-skin全皮模型真皮层厚度测量；

图6为本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法的流程图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：

实施例中所用试剂和材料如无特殊说明均可从市场常规购得。

一、实验材料

1.实验材料及仪器

1.1 3D全皮皮肤

3D全皮皮肤来源于市售功能稳定的人重组3D全皮皮肤模型。本实施例中，T- skin全皮皮肤模型购自上海斯安肤诺生物科技有限公司。

1.2主要试剂

(1)3D全皮皮肤培养相关试剂：T-skin维持培养基、T-skin检测培养基均购自 上海斯安肤诺生物科技有限公司，DPBS购自美国Gibco公司；

(2)化学试剂、噻唑蓝(MTT)、聚氧乙烯醚(TritonX100)、(牛血清蛋白) BSA均购自美国Sigma公司；DMSO、盐酸、异丙醇、PBS、乙醇、二甲苯、石蜡、 柠檬酸、柠檬酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司；DAPI染液、HE(苏木精伊 红)染液购自上海碧云天生物技术有限公司。

(4)定量RT-PCR检测：PRC引物合成自上海生工生物科技有限公司、SYBR 购自Roche罗氏试剂、GeneJET RNA Purification Kit试剂盒购自Thermo，反转录试 剂盒PrimeScript

(5)免疫荧光检测：Collagen VI和proCollagen I的抗体分别购自Abcam。

1.3溶液配置

(1)噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末100mg，加PBS20mL，涡旋振荡溶 解，经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃避光保存，使用时4℃解冻；

(2)3D全皮皮肤MTT检测液：MTT溶液在T-skin检测培养基中稀释至 0.3mg/mL；

(3)3D全皮皮肤酸化异丙醇萃取液：盐酸溶于异丙醇，终浓度为0.04mol/mL。

(4)柠檬酸钠：10mM柠檬酸钠(PH6.0)

(5)封闭液：0.025％TritonX100+1.5％BSA

1.4仪器

CO

2.待测原料样品

原料样品即受试物的名称如表1所示：

表1

二、3D全皮皮肤模型水分值评估原料抗衰老活性

3D全皮皮肤模型经过运输后，放入6孔板内进行稳定培养，每孔2ml维持培 养基，培养条件为37℃、5％CO

2.1受试物3D全皮皮肤毒性MTT检测

2.1.1 3D全皮皮肤MTT检测

每种原料样品(受试物)用培养基稀释3个浓度，质量浓度分别为10％，5％ 和1％，添加1-20mg/cm

在6孔板中加入0.3mg/ml的MTT工作液，将全皮模型转移至孔内，确认没有 气泡。将载有MTT溶液和表皮模型的培养板放在37℃，5％CO

2.1.2 3D皮肤细胞活力分析

请参阅图1，细胞活力计算公式如下：

细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100％

式中：As为实验孔(含有3D全皮皮肤的培养基、MTT、待受试物)OD值；

Ac为对照孔(含有3D全皮皮肤的培养基、MTT、不含受试物)OD值；

Ab为空白孔(不含3D全皮皮肤和受试物的培养基、MTT)OD值；

3D皮肤细胞90％活率(CV90)的计算公式为：

式中：a为细胞活率超过90％的最小值；c为细胞活率低于90％的最大值；b 和d一一对应地表示a和c细胞活性对应的浓度；

根据公式计算表1中受试物1～4的细胞活力，选取CV90对应的浓度作为抗 衰老验证给药浓度，图1为受试物1～4的T-skin全皮组织存活率。

2.2 3D全皮模型水分值测定

请参阅图2，受试物选择CV90的浓度，每孔添加1-20mg/cm

三、3D全皮皮肤模型定量RT-PCR基因表达检测评估原料抗衰老活性

请参阅图3a、图3b、图3c和图3d，受试物选择CV90的浓度，每孔添加 200μL于3D表皮模型上，于37℃、5％CO

表2

由

四、3D全皮皮肤模型Collagen VI和proCollagen I免疫荧光检测评估原料抗 衰老活性

请参阅图4a和图4b，受试物选择CV90的浓度，每孔添加1-20mg/cm

3D全皮皮肤模型Collagen VI和proCollagen I免疫荧光检测流程如下：

用手术刀将全皮皮肤模型材料切下，放置在4％组织固定液中固定，PBS清洗。 梯度乙醇脱水。纯二甲苯浸泡，最后将皮肤材料浸泡在液体石蜡放入石蜡包埋系统 中过夜。根据需要调整厚度计，以5-12μm厚度为宜。皮肤材料贴片后，100％二甲 苯脱蜡2次，梯度复水，蒸馏水浸泡。10mM柠檬酸钠溶液(PH6.0)中，97℃抗原 修复。用0.025％TritonX-100+1.5％BSA的PBS封闭液封闭1-2h。将抗体按照说明 书及文献要求的比例进行稀释。封闭结束后，在载玻片上加100-200μl(封闭液+抗 体)，用PARAFILM封口膜封。4℃杂一抗过夜。用PBS洗3次。用PBS作为稀释 液，按照二抗的说明书对抗体进行稀释，稀释后，在载玻片上加100-200μl(封闭液 +抗体)，用PARAFILM封口膜封，避光室温孵育1-2h。用PBS洗3次。用DAPI染液进行复染细胞核。用PBS洗3次。选择说明书推荐的荧光通道FITC和DAPI (385nm)荧光通过分别进行荧光观察，利用imageJ计算荧光强度。图4a为T-skin 全皮模型蛋白CollagenVI的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达；图4b为T-skin全 皮模型蛋白proCollagen I的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达。

五、3D全皮皮肤模型真皮层厚度检测评估原料抗衰老活性

请参阅图5，受试物选择CV90的浓度，每孔添加1-20mg/cm

3D全皮皮肤模型真皮层厚度检测流程如下：

用手术刀将皮肤模型材料切下，放置在4％组织固定液中固定，PBS清洗。梯度 乙醇脱水。纯二甲苯浸泡，最后将皮肤材料浸泡在液体石蜡放入石蜡包埋系统中过 夜。根据需要调整厚度计，以5-12μm厚度为宜。皮肤材料贴片后，100％二甲苯脱 蜡2次，梯度复水，蒸馏水浸泡。用HE(苏木精伊红)染液试剂盒对皮肤切片进行 组织结构染色，使用说明参照说明书。图5显示了受试物1-4的T-skin全皮模型真 皮层厚度值。

六、结果分析

应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用Two-way ANOVA统计分析。所有的统计分析均为双尾。p<0.05认为具有显著差异，用 “*”表示，p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，p<0.001认为具有极显著 差异，用“***”表示。

6.1 3D全皮皮肤模型水分值评估原料抗衰老活性检测结果

6.1.1受试物3D全皮皮肤毒性检测

受试物(原料样品)1～4的细胞存活率MTT检测结果如图1所示，根据所得 结果按照公式计算CV90，待测样品在3D皮肤模型上的CV90对应浓度如表3所 示，后续给药按照该浓度进行孵育。

表3

6.1.2 3D全皮模型水分值测定

请参阅图2，样品组加入CV90对应给药浓度的原料样品，培养3天～10天， 经过缓冲液的冲洗后，Courage+Khazaka皮肤水分测试仪探头对T-skin全皮皮肤模 型进行水分值测定，每个模型测三次，取平均值(见图6)。依次进行排序，低于 阴性对照组评分为0；高于阴性对照组评分为1。

6.2 3D全皮皮肤模型基因的相对表达量评估原料抗衰老活性检测结果

6.2.1受试物3D全皮皮肤毒性检测

受试物(原料样品)1～4的细胞存活率MTT检测结果如图1所示，根据所得 结果按照公式计算CV90，待测样品在3D皮肤模型上的CV90对应浓度如表3所 示，后续给药按照该浓度进行孵育。

6.2.2 3D全皮模型的基因相对表达量检测

收集3D皮肤组织，GeneJET RNA Purification Kit对皮肤模型的RNA进行提取，参照试剂盒说明书。RNA浓度检测使用Nanodrop分光光度计，使用说明参照说明 书。反转录使用PrimeScript

6.3 3D全皮模型蛋白Collagen VI和proCollagen I的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达评估原料抗衰老活性检测结果

6.3.1受试物3D全皮皮肤毒性检测

受试物(原料样品)1～4的细胞存活率MTT检测结果如图1所示，根据所得 结果按照公式计算CV90，待测样品在3D皮肤模型上的CV90对应浓度如表3所 示，后续给药按照该浓度进行孵育。

6.3.2 3D全皮模型免疫荧光蛋白表达量检测

收集3D全皮皮肤组织，进行免疫荧光染色实验。将抗体按照说明书及文献要 求的比例进行稀释，分别进行抗体杂交。利用荧光显微镜进行拍照，利用imageJ 计算荧光强度，并计算以阴性对照组为对照的蛋白相对表达量。Collagen VI蛋白 相对表达量如图3a所示，proCollagen I蛋白相对表达量如图3b所示，*P<0.05, **P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001为样品组与阴性对照组对比。

6.4 3D全皮模型真皮层厚度评估原料抗衰老活性检测结果

6.4.1受试物3D全皮皮肤毒性检测

受试物(原料样品)1～4的细胞存活率MTT检测结果如图1所示，根据所得 结果按照公式计算CV90，待测样品在3D皮肤模型上的CV90对应浓度如表3所 示，后续给药按照该浓度进行孵育。

6.4.2 3D全皮模型真皮层厚度测定

收集3D皮肤组织，进行组织包埋和石蜡切片，进行HE染色实验。按照说明 书的要求进行染色，利用光学显微镜进行拍照，利用计算机软件的测量工具进行测 量，比较样品组与阴性对照组的厚度值，应用GraphPad Prism作图。低于阴性对 照组评分为0；高于阴性对照组评分为1。

6.5综合评估结果及分析

所有受试物按照图6所示流程进行评估，本实施例中检测的4个受试物在3D 全皮模型水分值的结果汇总如表4,3D全皮模型基因表达水平的实验显著性差异结 果汇总一一对应地如表5所示，3D全皮模型蛋白表达水平的实验显著性差异结果 汇总一一对应地如表6所示，3D全皮模型真皮层厚度值得结果汇总如表7所示， 依据表8的评分标准进行评估及打分，受试物抗衰老功效评估结果如表9所示，水 分值维度占比0.1、基因相对表达量维度占比0.1333、免疫荧光蛋白强度相对表达 量维度占比0.1333、真皮层厚度值维度占比0.1；加权总和为1(水分值分值× 0.1+基因相对表达量分值×0.1333+免疫荧光蛋白强度相对表达量分值×0.1333+真 皮层厚度值分值×0.1＝1)；根据汇总得分结果进行排序，本批受试物均具有抗衰老 功效，功效强度排序为受试物1>受试物2>受试物3>受试物4>受试物5>受试物 6，筛选得到最佳抗衰老功效原料为活性物A。

表4

表5

表6

表7

表8

表9

请参阅图6，本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法， 包括以下步骤：

S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；

S2，3D全皮皮肤模型培养；

S3，3D全皮皮肤模型活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：

S31，取步骤S2中生长状态稳定3D全皮皮肤模型，加入实验样品，所述实验 样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培 养3天～10天，用MTT检测3D全皮皮肤模型组织存活率；

S32，筛选得到CV90时对应的原料样品3D全皮皮肤模型给药浓度，所述CV90 代表3D皮肤组织存活率为90％；

S4，3D全皮皮肤模型的水分值检测步骤、基因表达检测步骤、免疫荧光检查 步骤及真皮层厚度检测步骤，包括以下工序：

S41，取步骤S2中生长状态稳定的3D全皮皮肤，设置阴性对照组及样品组， 所述阴性对照组加入缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原 料样品，将阴性对照组及样品组分别培养3天～10天；

S42，对步骤S41中培养完成的3D全皮皮肤模型进行收集，实施3D全皮皮肤 模型水分值表达检测；

S43，对步骤S41中培养完成的3D全皮皮肤模型进行收集，分别实施3D全皮 皮肤模型中MMP9、COL3A1、Elastin、Nrf2的基因表达检测；

S44，对步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，进行石蜡包埋和切 片后，分别实施3D全皮皮肤模型中Collagen VI和proCollagen I的免疫荧光表达检 测；

S45，对步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，进行石蜡包埋和切 片后，分别实施3D全皮皮肤模型中真皮层厚度的检测；

S5，评价步骤，具体包括以下内容：

S51，水分值检测的评价步骤：汇总步骤S42中水分值检测结果，计算检测原料 样品组与阴性对照组的水分值含量，比较样品组与对照组的水分值，应用GraphPad Prism作图。低于阴性对照组评分为0；高于阴性对照组评分为1；

S52，基因相对表达量的评价步骤：汇总步骤S43中基因表达检测结果，计算检 测原料样品组基因表达与阴性对照组的基因表达比值，得到基因的相对表达量，应 用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用Two-way ANOVA 统计分析；所有的统计分析均为双尾；

p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抗衰老作用，评 分为0.3；

p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抗衰老作用，评分为0.5；

p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极显著抗衰老 作用，评分为0.7；

p<0.0001认为具有极其显著差异，用“****”表示，说明该受试物具有极其显著 抗衰老作用，评分为1.0；

S53，免疫荧光表达评价步骤：汇总步骤S44中免疫荧光表达检测结果，应用 ImageJ计算荧光强度，结果表示为Mean±SD；按照荧光强度进行排序，数值越高， 说明受试物的抗衰老作用越强；用GraphPad Prism作图，各组间比较采用Two-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；

p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抗衰老作用，评 分为0.3；

p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抗衰老作用，评分为0.5；

p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极显著抗衰老 作用，评分为0.7；

p<0.0001认为具有极其显著差异，用“****”表示，说明该受试物具有极其显著 抗衰老作用，评分为1.0；

S54，真皮层厚度评价步骤：汇总步骤S45中真皮层厚度结果，比较样品组与阴 性对照组的水分值，应用GraphPad Prism作图。低于阴性对照组评分为0；高于阴 性对照组评分为1；

S6，根据步骤S5的评分标准汇总所有检测指标评分，评分公式为：

原料得分＝水分值分值×0.1+基因相对表达量分值×0.1333+免疫荧光蛋白强度相对表达量分值×0.1333+真皮层厚度值分值×0.1；

其中，0.1、0.1333、0.1333和0.1为系数；基因相对表达量分值为MMP9、 COL3A1、Elastin、Nrf2的四种基因相对表达量分值之和；免疫荧光蛋白强度相对表 达量分值为Collagen VI和proCollagen I两种免疫荧光蛋白强度相对表达量分值之 和；原料得分显示原料的抗衰老功效，得分越高，抗衰老功效越好，可以筛选出具 有最佳抗衰老功效的原料。

在一种具有表皮层和真皮层的3D全皮皮肤模型中，所检测的水分值构成生理 学水平评价指标，所检测的MMP9、COL3A1、Elastin、Nrf2的基因表达检测中至 少一种基因表达检测构成转录组学水平评价指标，所检测的Collagen VI和 proCollagen I的免疫荧光表达检测中至少一种免疫荧光表达检测构成蛋白组学水平 评价指标；所检测的真皮层厚度检查构成组织学水平评价指标。

综上所述，本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型抗衰老功效的筛选方法，包 含四种维度的一种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了正常皮肤表皮层和真皮层， 构建化妆品原料的抗衰老功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的 优势；为皮肤护理产品抗衰老活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法， 为抗衰老原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理 产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施 例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。