一种头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的急慢性毒性测定方法

摘要

本发明涉及水生态生物领域，公开了一种头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的急慢性毒性测定方法。采集萼花臂尾轮虫，进行单克隆并将幼体置于养殖容器中培养；选用纯度为≥98％的头孢氨苄，经按母液稀释法和EPA将其配置所得测试液体；选取养殖容器中的轮虫，分别置于不同测试液体质量浓度梯度下的培养容器内，经每个浓度梯度重复测试，观察记录每一培养容器中的轮虫情况。能够得知不同浓度的头孢氨苄对轮虫的摄食行为和种群动态的影响，同时，能够获知水体污染物对轮虫种群动态的生态毒理学效应。从而人工能够依据测得的水生态数据，及时有效地使用及管理水生态中抗生素，使水生态系统保持相应的平衡，并为头孢类抗生素的准确安全使用提供科学指导。

说明书

技术领域

本发明涉及水生态生物领域，特别涉及一种头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的急慢性毒性测定方法。

背景技术

抗生素是一类由微生物在生命过程中所产生的次生代谢产物及其衍生物，其在低浓度下可以有效地抑制敏感菌种的生长、代谢或致其死亡，临床用抗生素可由微生物培养液中提取或化学方法合成。抗生素类药物已在农业、畜牧业和治疗感染性疾病方面发挥重要的作用。

头孢菌素是20世纪50年代开始应用的抗生素；作为第一代口服头孢菌素，头孢氨苄是人类消耗抗生素最多的种类之一；目前，头孢菌素抗生素已从第一代发展到第四代，全球已开发上市近70种头孢类抗生素，我国临床应用约46种；全球头孢类抗生素的销售额平均以10％的速度递增，约占世界抗感染药物销售额的40％以上。

随着抗生素在人类医疗领域的广泛使用甚至滥用，携带抗生素抗性基因的致病菌日趋增多，并对人类健康构成严重威胁，甚至出现了诸多“超级细菌”。长期的、大量的、持续性的排放会造成水环境抗生素的“假性持久性”污染，成为环境中的新兴污染物，对水生生物以及人类健康造成毒害效应。研究表明，抗生素对水生生物的毒性效应差异较大，半最大效应浓度(EC50)通常为mg/L的级别，如恶喹酸对大型溞(Daphnia magna) 的48h急性毒性EC50为4.6mg/L，秦妙菌素为40mg/L，有些抗生素 EC50则高于200mg/L，土霉素甚至高达1000mg/L，而发光菌费氏弧菌 (Vibrio Fischeri)对μg/L范围的抗生素敏感。实验表明，诺氟沙星对大型溞的急性毒性较大，其死亡率随诺氟沙星浓度增高及暴露时间的延长而显著增加，低于亚致死浓度的诺氟沙星显著改变了大型溞的种群增长模式，降低了瞬时生长率及种群大小；磺胺类、氯霉素类、喹诺酮类和四环素类均能不同程度的抑制大型溞的繁殖。

轮虫是广泛分布于各类水体中的一类浮游动物，因其具有繁殖迅速、世代时间短以及对环境因子的变化敏感等特点，现已成为水生态毒理学和水环境监测领域的重要受试生物之一。

但研究表明，80％以上的抗生素类药物未被完全吸收转化而跟随尿液、粪便等直接排出体外，最终进入生态环境。而污水处理厂现有处理技术并不能对其进行有效去除，部分未降解的药物活性成分就随处理过的污水最终排入天然水体。水环境中含有大量的微型生物，它们对污染物有一定的耐受性，但是超过了其耐受性限度会表现出中毒现象，甚至导致死亡。

而现有的水生态系统中，无法得知不同浓度下的头孢氨苄对轮虫的抑制作用，使得人工也无法作出相应的补救措施，导致影响水生态系统的平衡。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的急慢性毒性测定方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的急慢性毒性测定方法，包括以下步骤：

采集萼花臂尾轮虫，进行单克隆并将幼体置于养殖容器中培养；

选用纯度为≥98％的头孢氨苄，经按母液稀释法和EPA将其配置所得测试液体；

选取所述养殖容器中的轮虫，分别置于不同所述测试液体质量浓度梯度下的培养容器内，经每个浓度梯度重复测试，观察记录每一所述培养容器中的轮虫情况。

作为本发明的一种优选方案，所述养殖容器中含有采用EPA配方的培养液和饵料，所述饵料为以HB-4培养基培养的斜生栅藻、离心浓缩后、每天投喂1.0×10

作为本发明的一种优选方案，所述养殖容器培育环境条件为温度25℃、光照强度130lx、昼长比L∶D＝14h∶10h。

作为本发明的一种优选方案，所述测试液体采用蒸馏水配置1.0g/L 的母液，并置于4℃冰箱中备用。

作为本发明的一种优选方案，所述培养容器中含有6个不同浓度梯度的所述测试液体，分别为31.25mg/L、62.5mg/L、125mg/L、250mg/L、 500mg/L和1000mg/L，另设一个未添加所述测试液体的培养容器。

作为本发明的一种优选方案，每一所述培养容器中放入5mL的所述测试液体和密度为1.0×10

作为本发明的一种优选方案，所述培养容器中含有6个不同浓度梯度的所述测试液体，分别为0mg/L、0.5mg/L、1.5mg/L、4.5mg/L、13.5mg/L 和40.5mg/L，另设一个未添加所述测试液体的培养容器。

作为本发明的一种优选方案，每一所述培养容器中放入5mL的所述测试液体和密度为1.0×10

作为本发明的一种优选方案，所述培养容器中含有6个不同浓度梯度的所述测试液体，分别为0mg/L、0.5mg/L、1.5mg/L、4.5mg/L、13.5mg/L 和40.5mg/L，另设一个未添加所述测试液体的培养容器。

作为本发明的一种优选方案，每一所述培养容器中放入10mL的所述测试液体和密度为1.0×10

综上所述，本发明具有如下有益效果：能够得知不同浓度的头孢氨苄对轮虫的摄食行为和种群动态的影响，同时，能够获知水体污染物对轮虫种群动态的生态毒理学效应。从而人工能够依据测得的水生态数据，及时有效地使用及管理水生态中抗生素，使水生态系统保持相应的平衡，并为头孢类抗生素的准确安全使用提供科学指导。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的急慢性毒性测定方法的流程示意图。

图2为本发明的萼花臂尾轮虫死亡率和头孢氨苄浓度间关系示意图。

图3为本发明的萼花臂尾轮虫摄食率和头孢氨苄浓度间关系示意图。

图4为本发明的不同头孢氨苄浓度下萼花臂尾轮虫的种群密度示意图。

图5为本发明的不同头孢氨苄浓度下萼花臂尾轮虫的种群增长参数 ABCDEF示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所用萼花臂尾轮虫为采自安徽省芜湖市镜湖，实验所用的头孢氨苄购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

本发明实施例，如图1所示，为一种头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的急慢性毒性测定方法，包括以下步骤：

S100、轮虫的培养，先采集萼花臂尾轮虫，进行单克隆并将幼体置于养殖容器中培养。

上述养殖容器中含有采用EPA配方的培养液和饵料，饵料为以HB-4培养基培养的斜生栅藻、离心浓缩后、每天投喂1.0×10

S200、测试液的配置，选用纯度为≥98％的头孢氨苄，经按母液稀释法配置，实验前用蒸馏水配置1.0g/L的母液，置于4℃冰箱中备用。实验时用EPA将其配制成所需浓度的测试液体。

S300、轮虫的测试，选取养殖容器中的轮虫，分别置于不同测试液体质量浓度梯度下的培养容器内，经每个浓度梯度重复测试，观察记录每一培养容器中的轮虫情况。

具体地，轮虫的急性毒性实验，先选取养殖容器中10只龄长为＜4h 的轮虫，分别置于不同测试液体质量浓度梯度下的培养容器内，具体为 31.25mg/L、62.5mg/L、125mg/L、250mg/L、500mg/L和1000mg/L，另设一个未添加测试液体的培养容器作为对照组。

上述每一个培养容器中，放入5mL的所述测试液体和密度为1.0×10

在25℃和光照强度130lx条件下，当头孢氨苄浓度为31.25mg/L时有 1只轮虫死亡，而在1000mg/L时开始出现全部轮虫死亡，死亡率和头孢氨苄浓度间关系见图2，其中，y表示死亡率，x表示头孢氨苄浓度以10为底的对数；采用概率单位法求得头孢氨苄对萼花臂尾轮虫幼体的24hLC50 值为144.11mg/L，其95％的置信限为112.851-191.862mg/L。

轮虫的摄食实验，先选取养殖容器中10只龄长为＜4h的轮虫，分别置于不同测试液体质量浓度梯度下的培养容器内，具体为0mg/L、0.5mg/L、 1.5mg/L、4.5mg/L、13.5mg/L和40.5mg/L，另设一个未添加测试液体的培养容器作为对照组。

上述每一个培养容器中，放入5mL的所述测试液体和密度为1.0×10

如图3所示，通过该实验分析，本数据符合正态分布P＝0.2＞0.05，且方差齐性检验合格P＝0.61＞0.05，可以使用单因素方差分析，单因素方差分析表明，头孢氨苄浓度对萼花臂尾轮虫的摄食率具有显著影响P＜0.05。多重比较结果表明，除了1.5mg/L和4.5mg/L浓度组之间没有显著差异外，其它各浓度组之间均显著不同，随着测试液浓度的升高，轮虫的摄食率受到了显著抑制。

轮虫的种群增长实验，先选取养殖容器中10只龄长为＜4h的轮虫，分别置于不同测试液体质量浓度梯度下的培养容器内，具体为0mg/L、0.5 mg/L、1.5mg/L、4.5mg/L、13.5mg/L和40.5mg/L，另设一个未添加测试液体的培养容器作为对照组。

上述每一个培养容器中，放入10mL的所述测试液体和密度为1.0× 10

不同浓度头孢氨苄下，萼花臂尾轮虫的种群密度变化如图4所示。各浓度下，萼花臂尾轮虫种群密度随着时间的推移逐渐增加，1.5-40.5mg/L 实验组在第15d达到最大密度，而对照组和0.5mg/L实验组分别在第16d 和17d达到种群最大密度。单因素方差分析和多重比较结果表明，当头孢氨苄浓度为0.5mg/L时，萼花臂尾轮虫种群最大密度与对照组无显著差异。

如图5所示，由于受头孢氨苄的影响，1.5-40.5mg/L处理组的种群密度在实验后期下降速度比对照组更快，因此在平均种群密度中头孢氨苄处理组显著减小P＜0.05，但1.5mg/L、4.5mg/L和13.5mg/L三个处理组间无显著差异，而40.5mg/L的头孢氨苄使轮虫平均种群密度降至最低，如图 5-B。

此外，1.5mg/L及以上浓度的头孢氨苄显著抑制了萼花臂尾轮虫的种群增长率，随着头孢氨苄浓度的增加，轮虫种群增长率逐渐减小，但是1.5 mg/L和4.5mg/L两者间无显著差异，而4.5mg/L、13.5mg/L和40.5mg/L 三个头孢氨苄浓度间也未见显著差异，如图5-C。

对轮虫后代产量单因素方差分析，结果显示：当浓度≥1.5mg/L时，后代产量被显著抑制P＜0.05，而1.5mg/L、4.5mg/L和13.5mg/L实验组之间无明显差异，40.5mg/L实验组比前述低浓度组均显著减小P＜0.01，如图5-E。

对轮虫休眠卵结果分析表明，0.5mg/L头孢氨苄处理组与对照组无显著差异，当头孢氨苄浓度≥1.5mg/L时，休眠卵产量显著提高，且13.5mg/L 处理组的休眠卵显著最高，如图5-D。

当浓度≥4.5mg/L时，轮虫种群平均混交率显著提高P＜0.05，但在 13.5mg/L时，种群具有最高混交率0.1973±0.0254，如图5-F。

由休眠卵产量和混交率结果可知，头孢氨苄对萼花臂尾轮虫的有性生殖产生了显著影响。

上述实验利用高倍显微镜对藻细胞进行了计数，根据下述方程计算轮虫的摄食率，具体方程如下：

G＝v/n×(lnC

其中G是摄食率，V是实验溶液的体积，t是摄食时间，n为每个实验组轮虫数量，C

种群增长率：r＝(lnN

其中，N

以下是对图5中定义的解释：

最大种群密度：实验过程中，单位体积萼花臂尾轮虫种群所能达到的最大密度。

休眠卵产量：10mL培养液中的轮虫每天所产的休眠卵总数。

后代产量：单位时间和单位体积内，萼花臂尾轮虫种群产生总后代数，参照Snell&Hoff等的方法，通过计算总雌体增长曲线与X轴间的面积求得。

平均混交率：种群中混交雌体占总雌体的比值。

本发明实施例中，浮游动物的摄食行为常常受到环境因子的影响，尤其是环境中的残留污染物，头孢氨苄浓度对萼花臂尾轮虫的摄食率具有显著影响，随着测试液浓度的升高，轮虫的摄食率受到了明显抑制。

在本发明实施例中，我们发现在高浓度头孢氨苄处理下，轮虫的摄食率明显降低，这是由于头孢氨苄抑制了轮虫蛋白磷酸酶的活性，进而影响轮虫的神经系统及其游泳行为，最终导致轮虫的摄食行为受到抑制。在头孢氨苄处理下，轮虫的游泳速度可能保持不变，而是由于轮虫口器上纤毛的运动速度受抗生素的抑制作用，最终导致轮虫的摄食行为受阻。

在本发明实施例中，头孢氨苄浓度对萼花臂尾轮虫的种群密度、种群增长率、休眠卵产量和后代数均具有显著影响。随着头孢氨苄浓度的增加≥1.5mg/L，轮虫的最大种群密度、平均种群密度、种群增长率和后代产量均比对照组和0.5mg/L处理组显著减小，但1.5mg/L-40.5mg/L处理组间的各最大种群密度无显著差异；1.5mg/L、4.5mg/L和13.5mg/L三个处理组间的平均种群密度和后代产量均无显著差异，而这两个种群参数在 40.5mg/L头孢氨苄浓度下降至最低。此外，1.5mg/L及以上浓度的头孢氨苄显著抑制了萼花臂尾轮虫的种群增长率，随着抗生素浓度的增加，轮虫种群增长率逐渐减小，但是1.5mg/L和4.5mg/L两者间无显著差异，而 4.5mg/L、13.5mg/L和40.5mg/L三个头孢氨苄浓度间也未见显著差异。可见，头孢氨苄对萼花臂尾轮虫种群密度及种群增长率具有显著抑制作用，其通过缩短萼花臂尾轮虫寿命，降低其生殖率，进而导致萼花臂尾轮虫种群增长率以及种群密度发生改变，是轮虫携带非混交卵个体数目减少，进而抑制了种群繁殖力。

在本发明实施例中，对轮虫休眠卵产量分析表明，0.5mg/L头孢氨苄处理组与对照组无显著差异，当头孢氨苄浓度≥1.5mg/L时，休眠卵产量显著提高，且13.5mg/L处理组的休眠卵显著最高；当浓度≥4.5mg/L时，轮虫种群平均混交率显著提高，同样是在13.5mg/L时，种群具有最高混交率。由休眠卵产量和混交率结果可知，头孢氨苄显著提高了萼花臂尾轮虫的有性生殖，但最高浓度下40.5mg/L的头孢氨苄浓度造成轮虫存活率极低，因此有性生殖率有所下降。

随着环境毒物浓度的增加，轮虫总雌体生产量被逐渐抑制，而其混交率却显著提高，由此提高了单位体积内形成产休眠卵的混交雌体生产量，但随着浓度的进一步增加，高死亡率降低了产休眠卵的混交雌体生产量。

在本发明实施例中，能够得知不同浓度的头孢氨苄对轮虫的摄食行为和种群动态的影响，同时，能够获知水体污染物对轮虫种群动态的生态毒理学效应。从而人工能够依据测得的水生态数据，及时有效地使用及管理水生态中抗生素，使水生态系统保持相应的平衡，并为头孢类抗生素的准确安全使用提供科学指导。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。