用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂及薄层鉴别方法

摘要

本发明公开了用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂及薄层鉴别方法，属于药品检测技术领域。本发明将乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比20:(4～6):(2～4)混合作为展开剂，应用于桃红四物汤的薄层鉴别，使用一种展开剂，使用同一份样品制备供试品溶液，点样于同一块薄层板上，在同一个展开系统下展开，在一种检视条件下可同时鉴别桃红四物汤中白芍、桃仁、地黄和红花四个药味，在两种检视条件下可同时鉴别桃红四物汤中当归、川芎、白芍、桃仁、地黄和红花六个药味；该方法斑点清晰、分离度好、专属性强、背景无干扰、阴性对照无干扰、耐用性好；一次鉴别即可反映桃红四物汤的质量信息，鉴别更全面，更有利于控制桃红四物汤的质量，减少了试验次数，检验效率高。

说明书

技术领域

本发明涉及药品检测技术领域，具体为用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂及薄层鉴别方法。

背景技术

桃红四物汤出自清·柴得华的《妇科冰鉴》，是国家中医药管理局首批公布的百首经典名方之一，属于按古代经典名方目录管理的中药复方制剂。桃红四物汤由地黄、当归、白芍、川芎、桃仁和红花六味药组成，四物汤中熟地为君，甘温滋腻，善能滋补营血；当归为臣，味辛性温，主入血分，力能补血，又补中有行，《本草纲目》卷16谓其“和血”；芍药为佐，味酸性寒，养血敛阴，柔肝营。川芎辛温走窜，擅能活血行气，祛瘀止痛，配入熟地、白芍、当归之滋补药中，可使补而不滞，亦为佐药。桃红四物汤是在四物汤的基础上加桃仁、红花，偏重于活血化瘀；适用于血瘀诸症。

薄层鉴别方法是中药复方制剂质量标准中定性鉴别的主要手段。《中药新药研究的技术要求》中“中药复方制剂质量标准的起草说明”【鉴别】项下要求：“可根据处方组成及研究资料确定建立相应的鉴别项目，原则上处方各药味均应进行试验研究，根据试验情况，选择列入标准中”。目前，包括《中国药典》在内的中药复方制剂质量标准【鉴别】项的设置大多按鉴别药味分列，1个处方药味1个鉴别项，即1块薄层板，展开1次，鉴别1个处方药味。如采用薄层色谱鉴别方法对中药复方制剂处方药味实现基本覆盖，所需的试验次数往往较多【参考文献：关于中药新药复方制剂“整体鉴别”新模式的思考】。桃红四物汤由六味药组成，目前，文献报道的桃红四物汤的薄层鉴别方法最多只同时鉴别其中两至三味药，其他药味的薄层鉴别方法的供试品溶液一般不相同，完成桃红四物汤各药味的薄层色谱鉴别，至少需要制备3种或以上的不同供试品溶液、用3种不同的展开系统进行展开，费时费力。中国专利文献CN 107478749在2017年12月15日公开了一种桃红四物汤的药物制剂的检测方法，采用3套薄层色谱方法用于鉴别处方中的四味药材，第一套方法同时鉴别桃仁和白芍；第二套方法同时鉴别当归和川芎；第三套方法鉴别红花；且三套方法的供试品溶液制备方法、展开剂均不相同；中国专利文献CN105535237A在2016年5月4日公开了一种桃红四物汤配方颗粒的制备方法及其质量控制方法，其质量控制方法包括红外指纹图谱、薄层定性鉴别及HPLC含量测定，建立了完善的质量标准，采用薄层色谱的一测多评技术，结合红外光谱和色谱法进行质量控制，可有效控制复方颗粒的质量，但其只能实现对组方中白芍、当归、川芎3味饮片的同时检测，且供试品溶液的制备中需要先使用有机溶剂进行提取纯化。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂及薄层鉴别方法，将乙酸乙酯-甲醇-水按照特定的体积比混合作为展开剂，该展开剂不分层，混合后即可使用，不需要低温长时间放置后再使用；本申请提供的桃红四物汤薄层鉴别方法，该方法斑点清晰、分离度好、专属性强、背景无干扰、耐用性好；一次鉴别试验即可反映六个药味的质量信息，鉴别更全面，更有利于控制桃红四物汤的质量，且减少了薄层鉴别的试验次数，减少试剂用量，节省时间，提高了检验效率,解决了现有技术中需要制备多种供试品溶液、展开剂不同，检测麻烦的问题。

本发明提供一种用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂，所述展开剂由乙酸乙酯、甲醇和水组成，所述乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为20:(4～6):(2～4)。

本发明还提供一种同时鉴别桃红四物汤全方六味药材的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

S1、供试品溶液的制备：称取桃红四物汤组合物，加入溶剂稀释溶解，萃取，合并乙醚液，挥干，再加入甲醇溶解，得到醚层供试品溶液；水层溶液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水洗脱，弃去水液，继续用乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，得到水层供试品溶液；

S2、对照药材溶液的制备：精密称取桃仁、白芍、生地黄、红花，分别加入溶剂，加热回流提取，趁热过滤，滤液通过AB-8大孔吸附树脂柱，用氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水洗脱，弃去水液，继用乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，得桃仁、白芍、生地黄、红花对照药材溶液；另取当归、川芎对照药材，分别加入溶剂，加热回流提取，过滤，乙醚萃取，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解，即得当归、川芎对照药材溶液；

S3、对照品溶液的制备：取苦杏仁苷对照品、芍药苷对照品、地黄苷D对照品、羟基红花黄色素A对照品适量，加入甲醇制成混合对照品溶液1，取阿魏酸对照品、藁本内酯对照品适量，加入甲醇制成混合对照品溶液2；

S4、薄层色谱法进行检测：吸取步骤S1制备的供试品溶液、步骤S2制备的对照药材溶液和步骤S3制备的对照品溶液1-2，分别点于一块硅胶G板上，将乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比20:(4～6):(2～4)混合作为展开剂，展开，晾干，置紫外灯下检视，乙醚层供试品色谱中，在与阿魏酸对照品、藁本内酯对照品和当归、川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；水层供试品色谱中，在与羟基红花黄色素A对照品和红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

然后再喷于显色剂中，在105℃加热至斑点显色，水层供试品色谱中，在与苦杏仁苷对照品和桃仁对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与芍药苷对照品和白芍对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与地黄苷D对照品和地黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与羟基红花黄色素A对照品和红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

进一步的，所述步骤S1、S2中的氨水溶液体积浓度为4％。

进一步的，所述步骤S1中的乙醇洗脱的体积浓度为20％。

进一步的，所述步骤S1、S2中的溶剂为水。

进一步的，所述步骤S2中的乙醚萃取过程为：乙醚振摇提取2次，每次50ml。

进一步的，所述步骤S2中的过滤为用0.45um微孔滤膜过滤。

进一步的，所述步骤S3中的混合对照品溶液1、混合对照品溶液2的浓度为每1ml各含0.5mg对照品。

进一步的，所述步骤S4中的显色剂为用磷钼酸2g，加水20ml使溶解，再缓缓加入硫酸30ml，混匀，得到的磷钼酸硫酸溶液。

本发明还提供一种同时鉴别桃红四物汤中白芍、桃仁、地黄、红花四个药味的薄层鉴别方法，包括以下步骤：

S1、供试品溶液的制备：取供试品，置烧杯中，加水稀释或溶解，通过大孔吸附树脂柱，用水洗涤烧杯，洗液一并通过大孔吸附树脂柱，用氨溶液洗脱，弃去氨液，再用水洗脱，弃去水液，继续用20％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，作为供试品溶液；

S2、阴性样品的制备：分别称取相等饮片量的燀桃仁阴性样品、酒白芍阴性样品、酒地黄阴性样品和酒红花阴性样品，按步骤S1的供试品制备方法分别制备燀桃仁阴性供试品溶液、酒白芍阴性供试品溶液、酒地黄阴性供试品溶液和酒红花阴性供试品溶液；

S3、对照药材溶液的制备：另取山桃仁对照药材、白芍对照药材、生地黄对照药材、红花对照药材，分别加水，加热回流提取，趁热过滤，滤液按照步骤S1中的供试品溶液制备方法的“通过大孔吸附树脂柱”起，同法制成对照药材溶液；

S4、对照品溶液的制备：再取苦杏仁苷对照品、芍药苷对照品、地黄苷D对照品、羟基红花黄色素A对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；

S5、薄层色谱法进行检测：吸取供试品溶液、阴性供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，将乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比20:(4～6):(2～4)混合作为展开剂，展开，取出，立即喷以磷钼酸硫酸溶液，加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

本发明提供的薄层鉴别方法还可应用于检测桃红四物汤基准样品水煎液、桃红四物汤基准样品浓缩浸膏、桃红四物汤基准样品冻干粉、桃红四物汤制剂及其中间体提取液、浓缩液、喷干粉。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供的展开剂由乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比20:(4～6):(2～4)混合而成，该展开剂不分层，按比例混合后即可使用，不需要低温长时间放置后再使用，而且只需使用一种展开剂即可鉴别出桃红四物汤全方六味药材，减少了试剂用量，操作更加方便；

2、本发明提供的同时鉴别六味药材的方法是通过使用一份样品制备成两份供试品溶液，点样于同一块薄层板上，在同一个展开剂系统下展开，在两种检视条件下即可同时鉴别桃红四物汤全方六个药味；该方法斑点清晰、分离度好、专属性强、背景无干扰、阴性对照无干扰、耐用性好；一次鉴别试验即可反映六个药味的质量信息，鉴别更全面，更有利于反映其整体质量特征，且减少了薄层鉴别的试验次数，减少试剂用量，节省时间，提高了检验效率；

3、本发明提供的供试品溶液制备方法，直接用水为溶剂，稀释或溶解供试品后即可开始供试品溶液的制备，不需要先使用有机溶剂进行提取纯化，简化了供试品溶液的前处理方法；

4、中药复方制剂的薄层鉴别方法的供试品溶液制备方法通常比较复杂，提取步骤繁琐，费时费力，且不同药味的薄层鉴别方法的供试品溶液一般不相同，而本发明只需要进行一次样品的称量，对样品进行萃取处理后制备成两种供试品溶液，醚层供试品溶液用于当归和川芎的鉴别；水层供试品溶液用于白芍、桃仁、地黄、红花这四个药味的鉴别，不同的药味采用同一供试品溶液，大大提高了检测效率；

5.本发明在对照药材溶液制备中，先使用水而非有机溶剂进行加热回流提取，滤液再采用与桃红四物汤供试品溶液相同的方法进行处理，由于经典名方桃红四物汤的基准样品和制剂也是使用水为提取溶剂，采用水为溶剂进行对照药材的样品预处理，可使对照药材溶液和供试品溶液所含的成分种类基本相同，对照药材的TLC斑点与桃红四物汤中相应药味成分的斑点信息基本相同，进一步提高了鉴别结果判断的准确性；

6.本发明提供的同时鉴别桃红四物汤组合物中白芍、桃仁、地黄、红花四个药味的方法，是在同一薄层系统下，用一份供试品溶液、一个展开系统、一个显色剂，在相同的检视条件下，即可同时鉴别白芍、桃仁、地黄和红花这四味药，该方法斑点清晰、分离度好、专属性强、背景无干扰、阴性对照无干扰、耐用性好。

附图说明

图1为实施例1的薄层色谱板在显色前365nm灯下的荧光斑点，其中序号1-14分别为当归对照药材、川芎对照药材、混合对照2、样1乙醚层、样2乙醚层、样3乙醚层、地黄对照药材、红花对照药材、桃仁对照药材、白芍对照药材、混合对照、样1水层、样2水层和样3水层；

图2为实施例1的薄层色谱板显色后日光灯下的斑点，其中序号1-14分别为当归对照药材、川芎对照药材、混合对照品2、样1乙醚层、样2乙醚层、样3乙醚层、地黄对照药材、红花对照药材、桃仁对照药材、白芍对照药材、混合对照品1、样1水层、样2水层和样3水层；

图3为实施例2的薄层色谱板显色后日光灯下的斑点，其中板1为桃红四物汤燀桃仁、酒白芍薄层色谱专属性考察结果图，板2为酒地黄、酒红花薄层色谱专属性考察结果图；

图4为实施例3的薄层色谱板显色后日光灯下的斑点图；

图5为本发明的薄层鉴别方法的温度耐用性考察结果图；

图6为本发明的薄层鉴别方法的湿度耐用性考察结果图；

图7为本发明的薄层鉴别方法的薄层板耐用性考察结果图；

图8为不同展开剂考察结果图；

图9为不同显示剂考察结果图；

图10为不同供试品制备方法的考察结果图，从左到右分别为：H211202浓缩液(本专利供试品溶液制备方法)、H211202喷干粉(本专利供试品溶液制备方法)、对比例3的浓缩液(专利CN 107478749的供试品溶液制备方法)、对比例3的喷干粉(专利CN 107478749的供试品溶液制备方法)。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例中所用到的仪器信息：

ATS 4型自动点样仪(瑞士卡玛公司)；Visualizer 2自动成像仪(瑞士卡玛公司)；硅胶G薄层板(Merck、青岛海洋化工厂)；M MILLIPORE Synergy UV超纯水仪；HH-4恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；DB-XAB电热板(上海力辰邦西仪器科技有限公司)

实施例中的对照品和对照药材信息：

苦杏仁苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110820-201808)；

芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110736-202044)；

地黄苷D对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：7534)；

羟基红花黄色素A对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111637-201810)；

阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110773-201915)；

藁本内酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111737-201910)；

山桃仁对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121560-201302)；

白芍对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120905-201610)；

地黄(生地黄)对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121180-201506)；

红花对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120907-201713)；

当归对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120927-202118)；

川芎对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：120918-201813)；

桃红四物汤(自制3批样品，批号：TH210411H、TH210412H、TH210413H)；

桃红四物汤基准样品冻干粉(自制3批，批号：TH210415H、TH210425H、TH210506H)；

桃红四物汤浓缩液(自制2批：H211201浓缩液、H211202浓缩液)；

桃红四物汤喷干粉(自制2批：H211201喷干粉、H211202喷干粉)。

实施例1、同时鉴别桃红四物汤中白芍、桃仁、地黄、红花、当归、川芎六个味药材的薄层鉴别方法

S1、供试品溶液制备：

取桃红四物汤颗粒3.5g，加水40ml，加热使溶解，放冷，得桃红四物汤溶液(自制3批：批号：TH210411H、TH210412H、TH210413H)，然后转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，合并乙醚液，加入无水硫酸钠1g，滤过，挥干，残渣加2ml甲醇溶解，即得醚层供试品溶液；水层通过AB-8大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用30ml体积浓度为4％的氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用50ml体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，即得水层供试品溶液；

S2、对照品溶液的制备

混合对照品溶液1的制备：取苦杏仁苷对照品，芍药苷对照品，地黄苷D对照品，羟基红花黄色素A对照品适量，用甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合对照品溶液，混匀，即得混合对照品溶液1；

混合对照品溶液2的制备：取阿魏酸对照品，藁本内酯对照品适量，用甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合对照品溶液，混匀，即得混合对照品溶液2；

S3、对照药材溶液的制备

桃仁对照药材溶液的制备：取桃仁对照药材约0.5g,加沸水40ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用30ml积浓度为4％的氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用50ml体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解2ml，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得桃仁对照药材溶液；

白芍对照药材溶液的制备：取白芍对照药材约0.5g，加水40ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用30ml积浓度为4％的氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用50ml体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得白芍对照药材溶液；

地黄对照药材溶液的制备：取地黄对照药材约0.5g，加水40ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用30ml积浓度为4％的氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用50ml体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得地黄对照药材溶液；

红花对照药材溶液的制备：取红花对照药材约0.5g，加水40ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用30ml积浓度为4％的氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用50ml体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得红花对照药材溶液；

当归对照药材溶液的制备：取当归对照药材约0.5g，加水40ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，合并乙醚液，加入无水硫酸钠1g，滤过，挥干，残渣加甲醇2ml溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得当归对照药材溶液；

川芎对照药材溶液的制备，取川芎对照药材约0.5g，加水40ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，合并乙醚液，加入无水硫酸钠1g，滤过，挥干，残渣加甲醇2ml溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得川芎对照药材溶液；

S4、薄层色谱法检测

照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各20ul，对照品溶液10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，将乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比20：5：3混合作为展开剂，展开，晾干，先置紫外灯(365nm)下检视，乙醚层供试品色谱中，在与阿魏酸对照品、藁本内酯对照品和当归、川芎对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；水层供试品色谱中，在与羟基红花黄色素A对照品和红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，具体参见附图1；

再喷于磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g，加水20ml使溶解，再缓缓加入硫酸30ml，混匀，即得)，在105℃加热至斑点显色清晰，水层供试品色谱中，在与苦杏仁苷对照品和桃仁对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与芍药苷对照品和白芍对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与地黄苷D对照品和地黄对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与羟基红花黄色素A对照品和红花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，具体参见附图2。

实施例2、同时鉴别桃红四物汤白芍、桃仁、地黄、红花四个药味的薄层鉴别方法

S1、供试品溶液的制备：

取相当于总饮片量约5g(约相当于燀桃仁饮片0.45g，酒白芍饮片0.675g，酒地黄饮片1.375g，酒红花饮片0.5g)的桃红四物汤基准样品冻干粉(自制3批，批号：TH210415H、TH210425H、TH210506H)，置50ml烧杯中，加水10ml溶解，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用水10ml洗涤烧杯，洗液一并通过大孔吸附树脂柱，用30ml体积浓度为4％的氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用50ml体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，使其至2ml，作为供试品溶液；

S2、阴性样品的制备：

分别称取相当于步骤S1中相等饮片量的燀桃仁阴性样品、酒白芍阴性样品、酒地黄阴性样品和酒红花阴性样品，按步骤S1的方法分别制备燀桃仁阴性供试品溶液、酒白芍阴性供试品溶液、酒地黄阴性供试品溶液和酒红花阴性供试品溶液；

S3、对照药材溶液的制备：

另取山桃仁对照药材0.45g、白芍对照药材0.675g、生地黄对照药材0.5g、红花对照药材0.5g，分别加水20ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，按照实施例1的方法制成对照药材溶液；

S4、对照品溶液的制备：

再取苦杏仁苷对照品、芍药苷对照品、地黄苷D对照品、羟基红花黄色素A对照品适量，分别加甲醇制成每毫升含0.5mg的对照品溶液；

S5、薄层色谱法检测

按照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各15μl，由于阴性样品数量太多，点于两块相同的硅胶G薄层板【Merck的硅胶G板】上，将乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比20：5：3混合作为展开剂，同时在温度25℃、相对湿度74％的条件下展开，展距约17cm，取出，立即喷以磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g加水20ml使溶解，再缓缓加入硫酸30ml，混匀)，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，桃红四物汤供试品溶液中，有斑点可与苦杏仁苷对照品溶液的斑点相对应，并且该斑点也与山桃仁对照药材的相应斑点对应，燀桃仁阴性样品中无干扰，参见附图3中的B、C、D线框所示；桃红四物汤复方供试品溶液中，有斑点可与芍药苷对照品溶液的斑点相对应，且白芍对照药材中有两个斑点可与复方中的斑点相对应，其中之一为芍药苷，酒白芍阴性样品中对这两个斑点无干扰，参见附图3中的A线框所示；酒地黄和酒红花的阴性样品处无干扰，三批桃红四物汤基准样品冻干粉(TH210415H、TH210425H、TH210506H)供试品溶液在地黄苷D、羟基红花黄色素A以及生地黄对照药材、红花对照药材相应的位置上显相同颜色的斑点。

实施例3、同时鉴别桃红四物汤中白芍、桃仁、地黄、红花四个药味的薄层鉴别方法

S1、供试品溶液的制备：取相当于总饮片量约5g(约相当于燀桃仁饮片0.45g，酒白芍饮片0.675g，酒地黄饮片1.375g，酒红花饮片0.5g)的桃红四物汤浓缩液(自制2批：H211201浓缩液、H211202浓缩液)，置50ml烧杯中，加水稀释至10ml，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用水10ml洗涤烧杯，洗液一并通过大孔吸附树脂柱，用30ml体积浓度为4％的氨水溶液洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用50ml体积浓度为20％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，使其至2ml，作为供试品溶液；另取相当于总饮片量约5g(约相当于燀桃仁饮片0.45g，酒白芍饮片0.675g，酒地黄饮片1.375g，酒红花饮片0.5g)的桃红四物汤喷干粉(自制2批：H211201喷干粉、H211202喷干粉)，置50ml烧杯中，加水10ml溶解，自“通过AB-8型大孔吸附树脂柱”起同实施例1的供试品制备方法制备成供试品溶液；

S2、对照药材溶液的制备：另取山桃仁对照药材0.45g、白芍对照药材0.675g、生地黄对照药材0.5g、红花对照药材0.5g，分别加水20ml，加热回流提取1小时，趁热过滤，滤液自供试品溶液制备的“通过AB-8型大孔吸附树脂柱”起，同实施例1的对照药材溶液的制备方法制成对照药材溶液；

S3、对照品溶液的制备：再取苦杏仁苷对照品、芍药苷对照品、地黄苷D对照品、羟基红花黄色素A对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5mg的混合对照品溶液；

S4、薄层色谱法进行检测：照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板【Merck的硅胶G板】上，以体积比为20：5：3的乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液作为展开剂，在温度25℃、相对湿度74％的条件下展开，展距约17cm，取出，立即喷以磷钼酸硫酸溶液(磷钼酸2g，加水20ml使溶解，再缓缓加入硫酸30ml，混匀)，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，具体见附图4。

对比例1

按照实施例2的供试品制备方法制备桃红四物汤提取液3批、桃红四物汤浓缩液2批，桃红四物汤喷干粉4批，然后展开剂采用三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：水按照体积比15∶40∶22∶10混合，然后5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，按照实施例2的薄层鉴别方法进行鉴别桃仁这一个药味，得到薄层色谱图。

对比例2

本对比例使用体积百分比浓度为5％香草醛硫酸溶液为显色剂，然后按照实施例2的方法、步骤进行鉴别白芍、桃仁这两个药味，得到薄层色谱图。

对比例3

本对比例按照专利CN107478749A中的供试品溶液制备方法制备1批浓缩液和1批喷干粉供试品溶液，然后将实施例3制备的1批浓缩液、1批喷干粉和本对比例制备的1批浓缩液和1批喷干粉供试品溶液进行供试品溶液的薄层鉴别，得到薄层色谱图。

试验例、方法学考察

1、专属性考察

分析对比实施例1-3得到的色谱图，参见附图1、2、3、4可知，本发明提供的用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂及薄层鉴别方法，无论是同时鉴别全方六味药材，还是同时鉴别白芍、桃仁、地黄、红花四味药材，得到的色谱图都斑点清晰、分离度好、专属性强、阴性对照无干扰，而且对桃红四物汤基准样品冻干粉、桃红四物汤制剂(如颗粒)及其中间体(提取液、浓缩液、喷干粉)等的检测都斑点清晰、分离度好、专属性强。

2、耐用性考察

(1)除在温度4℃、相对湿度74％的条件下展开外，其他操作与实施例2相同，得到的2块薄层板参见附图5，可知，在相同高相对湿度(RH：74％)条件下，低温(4℃)和室温(25℃)均不影响薄层色谱的斑点清晰度、分离度和专属性，表明本发明提供的薄层鉴别方法的温度耐用性较好；

(2)除在温度25℃、相对湿度25％的条件下展开外，其他操作与实施例2相同，得到的2块薄层板色谱图参见附图6，可知，在相同室温(25℃)条件下，低相对湿度(RH：25％)和高相对湿度(RH：74％)均不影响薄层色谱的斑点清晰度、专属性和分离度，表明本发明提供的薄层鉴别方法的湿度耐用性较好；

(3)除了使用青岛海洋化工厂的硅胶G板进行展开外，其他操作与实施例2相同，得到的2块薄层板色谱图参见附图7，可知，使用青岛海洋化工厂的硅胶G板进行展开时，斑点虽然略有扩散，但不影响结果的判断，说明本发明提供的薄层鉴别方法的耐用性较好。

3、展开剂的考察

分析对比例1的得到的薄层色谱图，参见图8可知，对比例1的展开剂采用三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比15∶40∶22∶10混合，然后5～10℃放置12小时的下层溶液为展开剂，与本发明的展开剂不一样，进行鉴别桃仁这一个药味，得到的薄层板会出现波浪型图谱，斑点展开距离有差异，会影响判断，说明只有使用本申请提供的用于桃红四物汤薄层鉴别方法的展开剂，结合本申请的薄层鉴别方法，得到的薄层色谱图才斑点清晰，专属性强。

4、显色剂的考察

分析对比例2得到的薄层色谱图，参见附图9可知，对比例2使用浓度为5％香草醛硫酸溶液为显色剂时来鉴别白芍、桃仁2个药味，发现在105℃加热时会因为薄层板加热不均匀导致斑点颜色不同或斑点不够清晰，影响判断，所以只有使用本申请中的磷钼酸硫酸溶液显色剂，结合本申请的薄层鉴别方法，得到的薄层色谱图才会斑点颜色显色稳定、清晰。

5、供试品制备方法的考察

分析对比例3得到的薄层色谱图，见附图10可知，对比例3按照CN107478749A中的供试品溶液制备方法，得到的斑点不够清晰；而本专利提供的供试品溶液制备方法不需要先用甲醇超声提取待测物，直接用水为溶剂，稀释或溶解供试品后即可开始供试品溶液的制备，不需要先使用有机溶剂进行提取纯化，前处理方法简化了，斑点更清晰，且背景无干扰。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。