开喉剑喷雾剂体内血浆药物化学成分及其确认方法

摘要

本发明涉及开喉剑喷雾剂体内血浆药物化学成分及其确认方法。一方面，本发明涉及确认开喉剑喷雾剂体内活性药物化学成分的方法，该方法包括如下操作：提供高分辨质谱仪和液相色谱仪、色谱条件和质谱条件，实验动物给药及取血，血浆样品的处理，血浆样品分析，从各种血浆中确定吸收入血原型药物成分和代谢成分，依据各种血浆中共有的吸收入血原型药物，确认该共有的吸收入血原型药物为血浆活性药物化学成分，所确认的血浆活性药物化学成分为三叶豆紫檀苷。还包括使用细胞实验方法确认进入细胞内的活性药物化学成分为三叶豆紫檀苷。所述开喉剑喷雾剂具有清热解毒、消肿止痛之功效，用于急、慢性咽喉炎，扁桃体炎，咽喉肿痛，口腔炎，牙龈肿痛等。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种用于口咽炎性疾病的中药组合物，本发明中药组合物为苗医药的开喉剑喷雾剂的中药制剂，其具有清热解毒、消肿止痛之功效；临床上可用于急、慢性咽喉炎，扁桃体炎，咽喉肿痛，口腔炎，牙龈肿痛；例如临床上可用于肺胃蕴热所致的咽喉肿痛，口干口苦，牙龈肿痛以及口腔溃疡，复发性口疮见以上证候者。本发明中药组合物尤其可用于小儿口咽炎性疾病。

背景技术

小儿年幼，脏腑娇嫩，为“稚阴稚阳”之体，其形气未充，腠理常疏，易感外邪，此外儿童对外界事物好奇心旺盛，易随手抓取身边物品放入口中。随着气候变化、环境污染等外界因素影响，家属稍不注意，就容易使儿童“病从口入”，《育婴家秘》曰：“小儿脏腑娇嫩，脾常不足，运化失司，极易发病。时行疫毒经口鼻而人，蕴郁肺脾，发于手足，上熏口咽，外透肌肤，发为疱疹。”儿科临床上口腔溃疡属于常见发病率较高的疾病，其是指口腔黏膜表面发生浅表性溃疡，发病原因大多是柯萨奇病毒、细菌感染、手足口病及复发性口疮等，患儿常表现出流涎、发热及哭闹等症状[张夫波,等.蒙脱石散联合开喉剑与冰硼散比较治疗小儿口腔溃疡的疗效分析[J].中国妇幼健康研究,2017,28(S1):495]，其中手足口病是由肠道病毒引起的急性发热出疹性传染病，好发于3岁以下的婴幼儿，主要表现为手足、臀部皮肤红色斑丘疹及小疱疹，口腔内黏膜散在小溃疡及小疱疹，可出现发热，伴食欲减退，甚至拒食或进食后呕吐，可通过亲密接触、呼吸道及消化道等途径传染。此外，小儿扁桃体炎和急性咽炎也是儿童常见的呼吸道感染性疾病,以婴幼儿作为主要发病人群,具有起病急,病情进展快等特点，临床主要表现为咽痛、发烧、咳嗽、咳痰、声嘶、吞咽困难等症状；小儿急性咽喉炎多发于6个月至3岁婴幼儿，全年均可发病，早期表现为咽部灼热、干燥，病情迁延后伴有疼痛，且疼痛感于咳嗽、吞咽时加重，容易进展为慢性咽喉炎[孙静,等.开喉剑喷雾剂(儿童型)治疗小儿急性咽炎和急性扁桃体炎的用法用量探讨[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(10):33-40；关晓娟,等.开喉剑喷雾剂联合克感利咽口服液治疗儿童急性扁桃体炎临床分析[J].新中医,2016,48(03):158-160]。

中药开喉剑喷雾剂是由贵州三力公司所生产的苗药复方制剂，内容物为浅棕色至棕色液体，味甜、微苦、微麻，具有薄荷的清凉感，其处方为：八爪金龙、山豆根、蝉蜕、薄荷脑。开喉剑喷雾剂具有清热解毒、消肿止痛等功效，临床主要用于急、慢性咽喉炎，扁桃体炎、咽喉肿痛、口腔炎、牙龈肿痛等。其中，八爪金龙收载至《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)，包含三个基原，分别为：朱砂根、百两金、红凉伞，后因朱砂根收载入2015、2020版《中国药典》，故2019版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中八爪金龙只收载百两金和红凉伞两个基原，由此开喉剑喷雾剂组方中的八爪金龙更名为朱砂根。

开喉剑喷雾剂通过喷雾给药方式直接作用于口腔黏膜，在病灶部位易形成最大药物浓度，具有生物利用度高、起效快、作用强等优点，且喷药后有薄荷的清凉感，避免了涂擦等方法引起患儿疼痛，提高了患儿的依从性[彭骞,等.蒲地蓝消炎口服液联合开喉剑喷雾剂治疗小儿手足口病疗效观察[J].中医药导报，2012，18(03):41-42]。

朱砂根为紫金牛科植物朱砂根的干燥根。秋、冬二季采挖，洗净，晒干。朱砂根性凉，味苦、辛，归肺、胃经，具有清热解毒，消肿散瘀，活血止痛，祛风除湿之功效，临床上常用于治疗急性咽炎、扁桃体炎、咽喉肿痛、风湿痹痛、跌打损伤等症，被苗族称为喉科良药。

山豆根药性苦寒有毒，归肺、胃经，具有清热解毒、消肿利咽的功效，用于火毒蕴结、咽喉肿痛、肺热咳嗽、乳蛾喉痹、口舌生疮等症[国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社，2020]，《开宝本草》中记载:“主解诸药毒、止痛、消疱肿毒”，《本草经疏》谓山豆根为解毒清热之上药；《本草求真》载“解咽喉肿痛第一要药”。

蝉蜕药性甘、寒，归肺、肝经，具有疏散风热、明目退翳、利咽透疹等功效，临床上多用于治疗风热感冒、咽痛音哑、高热惊厥、喉痒频咳等症[孟宪兰,等.蝉衣在儿科临床中的应用[J].吉林中医药,1997(02):18]。《本草纲目》中记载：“蝉，主疗皆一切风热证，古人用身，后人用蜕，大抵治脏府经络，当用蝉身；治皮肤疮疡风热，当用蝉蜕”。《本草衍义》中记录：“治目昏翳。又水煎壳汁，治小儿出疮疹不快”。《药性论》中也写道：“治小儿浑身壮热惊痫，兼能止渴”。

薄荷脑，也称薄荷醇，具有止痛、抗癌、抗炎等药理作用[杜渐.薄荷醇对LPS诱导的帕金森病模型的神经保护作用及其机制[D].吉林大学,2021.DOI:10.27162/d.cnki.gjlin.2021.005422]。

有研究表明开喉剑喷雾剂对变形杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等均有较好的临床疗效[高存娇.分析开喉剑喷雾剂治疗小儿急性咽喉炎的疗效[J].中国医学文摘(耳鼻咽喉科学),2022,37(01):72-73]，此外开喉剑喷雾剂还可与其他药物或治疗方法联用，除增强抗炎作用外，还可用于治疗小儿疱疹性咽峡炎[叶冰,等.喉咽清口服液联合开喉剑喷雾剂治疗小儿疱疹性咽峡炎的临床疗效及其安全性[J].临床合理用药杂志,2021,14(21):51-54]、喉源性咳嗽[宋晓,等.穴位贴敷配合开喉剑喷雾剂治疗儿童喉源性咳嗽疗效观察[J].实用中医药杂志,2015,31(08):775-776]等。

CN114200040A(申请号202111415900.9)公开一种开喉剑喷雾剂(儿童型)的含量测定方法，采用高效液相色谱法建立了测定开喉剑喷雾剂(儿童型)中苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷、马卡因含量，并以岩白菜素为内标物一测多评的含量测定方法。检测结果准确稳定，可用于开喉剑喷雾剂(儿童型)的质量控制；同时该发明可以降低检测成本和检测时间，减少工作量，提高效率，为开喉剑喷雾剂(儿童型)的质量标准提升奠定基础。然而该方法每一次测定的色谱运行时间长达70min，不同物质需要使用不同的检测波长为此需要在运行过程中切换检测波长，且计算需要采用相对校正因子这种麻烦的方法，该文献方法的效率和适用性是有待改进的。

然而，现有技术仍然需要有新的开喉剑喷雾剂，例如新的方法以控制开喉剑喷雾剂的质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种开喉剑喷雾剂，或者，本发明的目的在于提供一种对开喉剑喷雾剂进行质量控制的方法。已经出人预料的发现，通过本发明方法可以提供一种有效地对开喉剑喷雾剂进行质量检测，进而在药品的生产过程、贮运过程或使用过程中能够有效地检测开喉剑喷雾剂的化学质量。本发明基于此类发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种同时定量测定开喉剑喷雾剂多指标药效成分的方法，所述药效成分包括苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷。

根据本发明第一方面的方法，其包括如下操作：

(1)提供高效液相色谱仪，提供所述药效成分的对照品以及供试品；

(2)色谱条件：

使用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，

柱温25℃，

测定波长203nm，

流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸溶液(B)，流动相采用梯度洗脱，梯度如下表：

流速：1mL/min；

(3)制备对照品溶液：以40％甲醇作为溶剂分别配制苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷对照品的对照品溶液，其浓度分别为40～90μg/ml例如约65μg/ml、70～130μg/ml例如约100μg/ml、4～9μg/ml例如约6.5μg/ml；

(4)制备供试品溶液：精密吸取开喉剑喷雾剂2mL于10mL量瓶中，40％甲醇稀释至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得；

(5)测定：分别吸取供试品溶液和各种对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，根据对照品色谱图主峰的保留时间确定供试品溶液色谱图中各药效成分的保留时间，根据对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图中各药效成分的峰面积以及对照品溶液浓度计算供试品溶液中各药效成分的含量，并依据稀释倍数计算开喉剑喷雾剂中各药效成分含量。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(5)注入液相色谱仪时，进样量为5～50μL，例如10μL。

根据本发明第一方面的方法，其中色谱柱的填料粒径为5μm。

根据本发明第一方面的方法，其中色谱柱内径为4.6。

根据本发明第一方面的方法，其中色谱柱长为250mm。

根据本发明第一方面的方法，其中色谱柱为Welch Ultimate Plus C18品牌的规格为4.6×250mm，5μm的色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其使用对照品溶液测定，对照品溶液中的苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷分别在10～520μg/mL、10-510μg/mL、1～50μg/mL浓度范围内峰面积与浓度满足R

根据本发明第一方面的方法，其中供试品溶液进行连续6次进样测定，苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷三者6次测定的色谱峰面积的RSD均小于1％，尤其是小于0.5％。

根据本发明第一方面的方法，其中供试品溶液在室温下放置24小时，于0、2、4、8、12、24h后进样测定，苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷三者6次测定的色谱峰面积的RSD均小于1％，尤其是小于0.5％。

根据本发明第一方面的方法，其中同一批供试品的6个试样制备得到的供试品溶液分别进样测定，苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷三者6次测定的色谱峰面积的RSD均小于1％。

根据本发明第一方面的方法，其中所述流动相中，乙腈中还添加1.2％异丙醇和0.2％氯化铵。在本发明中，如未另外说明，对于％的含义，液体/液体混合物时％为体积/体积百分数，固体/液体混合物时％为质量/体积百分数，固体/固体混合物时％为质量/质量百分数。

根据本发明第一方面的方法，其中所述流动相中，0.1％甲酸溶液中还添加1.2％异丙醇和0.2％氯化铵。

根据本发明第一方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的处方为：朱砂根220～330g、山豆根220～330g、蝉蜕180～270g、薄荷脑0.8～1.2g，香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1～2.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第一方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的处方为：朱砂根250g、山豆根250g、蝉蜕200g、薄荷脑1g，菠萝香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第一方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的处方为：朱砂根313g、山豆根313g、蝉蜕250g、薄荷脑1g，杨梅香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠2.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第一方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的制法为：以上四味药材，除薄荷脑外，其余朱砂根等三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

进一步的，本发明第二方面提供了一种开喉剑喷雾剂，其处方为：朱砂根220～330g、山豆根220～330g、蝉蜕180～270g、薄荷脑0.8～1.2g，香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1～2.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第二方面的开喉剑喷雾剂，其处方为：朱砂根250g、山豆根250g、蝉蜕200g、薄荷脑1g，菠萝香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第二方面的开喉剑喷雾剂，其处方为：朱砂根313g、山豆根313g、蝉蜕250g、薄荷脑1g，杨梅香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠2.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第二方面的开喉剑喷雾剂，其制法为：以上四味药材，除薄荷脑外，其余朱砂根等三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

进一步的，本发明第三方面提供了确认开喉剑喷雾剂体内活性药物化学成分的方法，该方法包括如下操作：

(1)提供高分辨质谱仪和液相色谱仪，提供所述药效成分的对照品以及供试品，提供SD大鼠和比格犬；

(2)色谱条件：

使用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，

柱温30℃，

测定波长203nm，

流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸溶液(B)，流动相采用梯度洗脱，梯度如下表：

进样量2μL，流速：1mL/min；

(3)质谱条件

采用软电离电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为正/负离子，雾化气体为氮气，辅助气1为60PSI，辅助气2为60PSI，气帘气为35PSI，雾化温度设置为600℃(具体操作时，例如可以是，正/负离子模式下，设定一级质谱母离子扫描范围为100-1800Da，选取IDA设置响应值超过100cps的4个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为100-1800Da，开启动态背景扣除(Dynamic background subtraction，DBS)，数据采集所用软件为SCIEX OS 1.4版本)；

(4)实验动物给药及取血

四只健康SD大鼠及两只比格犬(例如置于湿度50％、温度25℃室内，自由进食、饮水饲养适应一周)，动物给药前12h禁食不禁水，随机分组并称重，按照人/动物换算给予0.545g药液/kg体重(大鼠口服灌胃给药，一只犬口服灌胃给药，一只犬口腔喷雾给药)，空白组给予相同体积生理盐水，分别于0h以及给药后0.5h、1h、2h用3％戊巴比妥溶液(1ml/kg)麻醉取血，大鼠取血2mL，比格犬取血5ml，取血后匀速摇动血浆采样器，使之与管内肝素钠混合防止凝血，在4℃条件下3500r/min离心10min收集上层血浆，按组分装成每EP管1ml血浆，置-80℃冰箱中储存备用；

(5)血浆样品的处理

取空白或给药后(冻存的或新鲜的)大鼠、比格犬血浆样品(冻存血浆预先至室温融化)，涡旋1min后取250μl于2.5ml EP管中，加入0.1％甲酸-乙腈(50：50)混合溶液750μl(该混合溶液中还添加有5％甲乙酮和1.2％硅酸钙(可过120目的细粉，预先混悬于该混合溶液中))，涡旋5min，然后在4℃条件下13000r/min离心5min，离心后将500μl上清液移至新EP管中，在氮气流下吹干，以初始比例流动相(乙腈：0.1％甲酸水溶液＝3：97)25μL复溶残渣后，涡旋1min，再超声5min，最后于4℃条件下13000r/min离心10min，取上清液置于进样小瓶，进行HPLC-Q-TOF MS测定；

(6)血浆样品分析

通过比对大鼠空白血浆、灌胃给药血浆以及比格犬空白血浆、口腔喷雾给药血浆、灌胃给药血浆色谱数据和质谱数据，依据该等色谱数据和质谱数据解析吸收入血的原型成分及代谢产物的离子碎片，对其进行结构鉴定；

(7)从大鼠血浆中确定吸收入血原型药物成分和代谢成分，从比格犬口腔喷雾血浆中确定吸收入血原型药物成分和代谢成分，从比格犬灌胃血浆中确定吸收入血原型药物成分和代谢成分，依据三种血浆中共有的吸收入血原型药物，确认该共有的吸收入血原型药物为血浆活性药物化学成分。

根据本发明第三方面的方法，其中所确认的血浆活性药物化学成分为三叶豆紫檀苷。

根据本发明第三方面的方法，其还进一步包括以下细胞实验操作步骤：

(8.1)提供CO

(8.2)溶液的配制

药液的配置：吸取开喉剑喷雾剂20μL于15ml离心管中，加入5％FBS完全培养基溶液至10mL，摇匀，0.22μm滤膜过滤除菌，配制成1402μg/ml的母液；从母液中吸取5mL于15mL离心管，加入5％FBS完全培养基溶液至10mL，摇匀，以此2倍量逐级稀释，共配制成1402、701、350.5μg/mL的药液，

10％FBS完全培养基溶液的配制：取一个50mL离心管，加入5mL FBS，再加入DMEM至刻度，最后加入500μL青霉素-链霉素溶液配制而成，放于4℃冰箱冷藏保存，

5％FBS完全培养基溶液的配制：取50mL离心管，加入2.5mL FBS，再加入DMEM至刻度，最后加入500μL青霉素-链霉素溶液配制而成，放于4℃冰箱冷藏保存，

细胞内外液样品制备：取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度约为2×10

(8.3)色谱和质谱测定

使用步骤(2)的色谱条件和步骤(3)的质谱条件，将上述得到的开喉剑喷雾剂的细胞内、外液进行色谱和质谱测定，对正、负离子模式下解析出的内外液成分的色谱数据和质谱数据，确认能够透过细胞膜的活性药物化学成分。

根据本发明第三方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的处方为：朱砂根220～330g、山豆根220～330g、蝉蜕180～270g、薄荷脑0.8～1.2g，香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1～2.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第三方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的处方为：朱砂根250g、山豆根250g、蝉蜕200g、薄荷脑1g，菠萝香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第三方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的处方为：朱砂根313g、山豆根313g、蝉蜕250g、薄荷脑1g，杨梅香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠2.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

根据本发明第三联单方面的方法，其中所述开喉剑喷雾剂的制法为：以上四味药材，除薄荷脑外，其余朱砂根等三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

开喉剑喷雾剂是贵州三力制药的产品。儿童型开喉剑喷雾剂的苗医功能主治为：旭嘎凯沓痂，泱安挡孟；陡：纳，蒙宁宫，蒙嘎宫昂，江杠房，水嘎果西；中医适应症为：清热解毒，消肿止痛。用于急、慢性咽喉炎，扁桃体炎，咽喉肿痛，口腔炎，牙龈肿痛。成人型开喉剑喷雾剂的苗医功能主治为：抬蒙蒙宋宫症；蒙嘎宫昂，来罗拉米；中医适应症为：清热解毒，消肿止痛。用于肺胃蕴热所致的咽喉肿痛，口干口苦，牙龈肿痛以及口腔溃疡，复发性口疮见以上证候者。

朱砂根为紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata Sims的干燥根。朱砂根中主要含有三萜皂苷类、香豆素类和其他类；其中皂苷结构类型主要为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，其苷元有2种类型：环氧醚和12-烯；香豆素类主要为岩白菜素；还含有一些其他类成分：紫金牛醌、无羁萜、β-谷甾醇、胡萝卜苦苷。

山豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根茎。山豆根中含有生物碱、皂苷、黄酮类及多糖等化合物等化学成分，它的主要药用成份为生物碱例如苦参碱、氧化苦参碱，以及黄酮类成分例如三叶豆紫檀苷。

本发明通过一种色谱条件同时测定三种药效成分，能够高效的对开喉剑喷雾剂进行质量检测。

附图说明

图1：苦参碱(保留时间t约9.1min)对照品色谱图。

图2：岩白菜素(保留时间t约19.2min)对照品色谱图。

图3：三叶豆紫檀苷(保留时间t约46.7min)对照品色谱图。

图4：开喉剑喷雾剂供试品色谱图，其中显示苦参碱(约9.1min)、岩白菜素(约19.2min)、三叶豆紫檀苷(约46.7min)三个色谱峰。

图5：阴性供试品溶液色谱图，其中未显示苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷三个色谱峰。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。在本发明中，如未特别指明，所用药材均为药材的干燥品，且符合药典规定。在本发明下面的实例中，各种物料的投料量均以重量份计，并且在实际投料时，每批次的全部物料总重量不少于5千克。

本发明下文制备中药组合物时，如未特别说明，所用原料药材和辅料均为同一批次。

处方：朱砂根250g、山豆根250g、蝉蜕200g、薄荷脑1g，菠萝香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml(儿童型)。

制法：朱砂根、山豆根、蝉蜕三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

处方：朱砂根313g、山豆根313g、蝉蜕250g、薄荷脑1g，杨梅香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠2.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml(成人型)。

制法：朱砂根、山豆根、蝉蜕三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

处方：朱砂根280g、山豆根280g、蝉蜕225g、薄荷脑1g，杨梅香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1.8g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

制法：朱砂根、山豆根、蝉蜕三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

处方：朱砂根220g、山豆根220g、蝉蜕180g、薄荷脑0.8g，杨梅香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠1.5g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

制法：朱砂根、山豆根、蝉蜕三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

处方：朱砂根330g、山豆根330g、蝉蜕270g、薄荷脑1.2g，杨梅香精5.5ml、柠檬酸1g、苯甲酸钠2g、乙醇20ml，水适量，制成1000ml。

制法：朱砂根、山豆根、蝉蜕三味加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑、苯甲酸钠、柠檬酸、菠萝香精、乙醇20ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至规定量，搅拌均匀，滤过，灌装，即得。

本申请的发明人在另外的研究中，已经发现，开喉剑喷雾剂血浆药物化学基础包括苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷等指标成分，显示这些指标成分为开喉剑喷雾剂的典型药效物质，本试验例通过使用HPLC法尝试同时测定上述三种指标成分，为快速有效的对开喉剑喷雾剂进行质量检测提供一种新的方法。

1.仪器与试剂

Waters e2695高效液相色谱仪(Waters公司)，电子天平SOP Secura 125-1CN(十万分之一，Sarlorius公司)。

乙腈、甲酸、甲醇、去离子水等均为符合测定用要求的市售产品。

2.试药

苦参碱(对照品，批号T22M10F88874，纯度≥98％)，岩白菜素(对照品，批号H14J10Z79791，纯度≥98％)，三叶豆紫檀苷(对照品，批号Y11J11H108216，纯度≥98％)，上述对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。

开喉剑喷雾剂由贵州三力制药股份有限公司提供(儿童型，批号：KHJ20190127、KHJ20190610、KHJ20190816)，或者由本发明实施例制得。

3.色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate Plus C18(4.6×250mm，5μm)，

柱温25℃，测定波长203nm，

流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸溶液(B)，流动相采用梯度洗脱，梯度如下表：

流速：1mL/min，进样量10μL。

4.对照品溶液的制备

分别称取适量苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷对照品于量瓶中，用40％甲醇定容，配制成浓度为0.5230mg/mL、1.0210mg/mL、0.1034mg/mL的储备液，过0.45μm微孔滤膜，得储备液，根据测定需要(例如预估供试品溶液的浓度并达到与其相当的浓度)使用相同溶剂将储备液稀释(例如稀释2～20倍，例如稀释5～15倍)制成对照品溶液。在配制对照品贮备液时溶液时，亦可配制比上述浓度更高的或者更低的浓度，例如上述三种物质的储备液浓度可以分别是0.2～1mg/mL、0.5～2mg/mL、0.02～0.5mg/mL。

5.供试品溶液的制备

精密吸取开喉剑喷雾剂(KHJ20190127)2mL于10mL量瓶中，40％甲醇稀释至刻度，过0.45μm微孔滤膜，即得。

6.阴性供试品溶液的制备

参照国家食品药品监督管理局颁布的开喉剑喷雾剂(儿童型)国家药品标准(WS-10132(ZD-0132)-2002)的方法制备无朱砂根且无山豆根的阴性供试品溶液：取蝉蜕20g加水6倍量水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10(50℃)的清膏，加入乙醇，使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20(80℃)的清膏，取薄荷脑0.1g、菠萝香精0.55ml、柠檬酸0.1g、苯甲酸钠0.1g，用乙醇2ml，搅拌溶解后，加入上述浸膏中，加水至100ml，搅拌均匀，滤过，即得无朱砂根且无山豆根的阴性供试品溶液。

7.专属性考察

将苦参碱对照品溶液、岩白菜素对照品溶液、三叶豆紫檀苷对照品溶液、开喉剑喷雾剂供试品溶液、阴性供试品溶液按上述色谱条件进行测定，色谱图见图1至5，图中横坐标为时间(min)，纵坐标为AU值，因图谱过度缩小，标尺未显示(5个图的标尺比例不尽相同)；但是横坐标作为定性依据，定量依据为另外从HPLC仪器提供的峰面积，因此纵坐标的标尺未显示并不影响本发明实施。

结果表明，阴性供试品溶液在苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷色谱峰位置处无相应峰出现，表明该色谱条件对三种成分的测定专属性较好。

8.方法学考察

8.1.线性关系考察

取上述三种对照品储备液，将各储备液逐级稀释，配制成苦参碱溶液0.5230、0.2615、0.1046、0.0523、0.0262、0.0105mg/mL，岩白菜素溶液0.5105、0.2042、0.1021、0.0511、0.0204、0.0102mg/mL，三叶豆紫檀苷溶液0.0517、0.0259、0.0103、0.0052、0.0026、0.0010mg/mL。按本试验例色谱条件进行测定，以这三种成分的峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)绘制线性曲线并分析，线性回归方程及系数见下表。

表：三种对照品线性回归方程及范围

结果表明，苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷分别在0.0105-0.5230mg/mL、0.0102-0.5105mg/mL、0.0010-0.0517mg/mL浓度范围的时候，其峰面积与浓度线性关系良好，可采用外标一点法对苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷进行含量测定。可以使用线性回归方程计算供试品中待测物质的含量，亦可使用适宜浓度的对照品溶液(例如与供试品中待测物质相当浓度的)按外标法计算供试品中待测物质的含量。

8.2.精密度试验

取本试验例制备供试品溶液，按本试验例的色谱条件进行连续6次进样测定，记录苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷色谱峰面积并计算RSD(％)，结果见下表。

表：KHJ精密度试验结果(n＝6)

结果表明，供试品溶液中此三种成分的RSD均在1％以下，表示在该色谱条件下仪器精密度良好。上表中的峰面积使用“8.1.线性关系考察”之线性回归方程计算时，y为峰面积，x为以μg/ml为单位的浓度，供试品溶液中苦参碱等三种成分计算的浓度分别为65.0μg/ml、106.1μg/ml、6.5μg/ml；依据喷雾剂稀释5倍制成供试品溶液进行HPLC测定，由此推算开喉剑喷雾剂(KHJ20190127)中苦参碱等三种成分计算的浓度分别为325.0μg/ml、530.5μg/ml、32.5μg/ml；下同。依据上述供试品溶液中测定的三种成分的浓度，在配制对照品溶液时，优其是以外标法计算含量时，对照品溶液中三种成分的浓度分别为40～90μg/ml例如约65μg/ml、70～130μg/ml例如约100μg/ml、4～9μg/ml例如约6.5μg/ml。当然如果供试品溶液的浓度在显著变化时亦可调整对照品溶液的浓度。

8.3.稳定性试验

取本试验例制备供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24h后，按本试验例的色谱条件进行测定，记录苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷色谱峰面积并计算RSD(％)，结果见下表。

表：KHJ稳定性试验结果

结果表明，供试品溶液中此三种成分的RSD均在1％以内，表明KHJ在24h内稳定。

8.4.重复性试验

分别从6瓶KHJ(KHJ20190127)中精密吸取2mL，按本试验例方法制备供试品溶液，用本试验的色谱条件进行测定，分别记录各供试品溶液中苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷的色谱峰面积并计算RSD(％)，结果见下表。

表：样品重复性试验结果(n＝6)

结果表明，各成分的RSD均在1％以内，表示供试品溶液在此色谱条件下重现性良好，符合含量测定要求。

8.5.加样回收率试验

精密吸取开喉剑喷雾剂(KHJ20190127)1mL于5mL量瓶中，加入本试验例所述0.0523mg/mL苦参碱溶液、0.1021mg/mL岩白菜素溶液及0.0052mg/mL三叶豆紫檀苷溶液各0.5mL，40％甲醇定容至刻度，过0.45μm滤膜即得加样50％供试品溶液，设平行n＝3。按上述操作分别加入1mL、1.5mL对照品溶液，制备加样100％、150％供试品溶液。按本试验例的色谱条件进行测定，记录苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷色谱峰面积并计算平均回收率及RSD(％)，结果见下表。

表：加样回收率试验结果

结果表明，苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷在此条件下的RSD均小于2％，符合方法学验证要求。

9.测定结果

对三批开喉剑喷雾剂KHJ20190127、KHJ20190610、KHJ20190816，以及本发明实施例1～5制备的五批开喉剑喷雾剂，测定其中苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷的含量，结果如下表。

表：组合物中的指标药效成分含量(μg/ml)

本试验例采用HPLC技术建立了开喉剑喷雾剂中多指标成分含量测定的方法，包括对苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷的含量测定，在一定的线性范围内，计算方法学中精密度、重复性、稳定性以及加样回收率的RSD均符合要求，表明该方法用于三种指标药效成分的同时测定是可行的。

在上文的试验例1测定各种供试品溶液时，发现在将供试品溶液注入液相色谱仪后，通常在初始测试时的柱压在80～90bar之间，然而在多次注射测试供试品溶液后柱压会逐渐增加，例如注射测试5个供试品溶液后柱压会增加到120～130bar之间，而在注射测试10个供试品溶液后柱压会增加到150～160bar之间，在注射测试15个供试品溶液后柱压会增加到210～220bar之间，柱压再继续增加是不可接受的；通过将柱子用流动相A/流动相B＝10/90比例的流动相反冲2小时后，可以使柱压回复到初始状态，但是这种操作在大样本量分析测试中是不可取的；已经发现在测试对照品溶液时不会出现这种柱压增加的现象，表明这种柱压增加是供试品溶液中的相关成分导致的。本发明人尝试使用其它品牌的C18柱(柱长、柱内径和填料粒度相同)，即Supelcoc C18色谱柱、安捷伦C18色谱柱、WatersC18色谱柱三种，照试验例1进行测试，结果亦发现随着测试进行柱压会有不可接受的升高，例如三种色谱柱在注射测试12个供试品溶液后柱压会分别增加到202～210bar、185～192bar、205～212bar之间。本发明人尝试在流动相A即乙腈和流动相B即0.1％甲酸溶液中均同时添加1.2％异丙醇和0.2％氯化铵，使得A和B中均含有相同浓度的两种添加剂，仍然照试验例1的梯度洗脱程序进行洗脱，保持其它操作条件不变，结果显示，在测试供试品溶液以及其它溶液时，初始柱压在80～90bar之间，在测试各种溶液30次以上后仍然保持在该柱压状态，例如在注射测试供试品溶液30次时柱压仍然在85～95bar之间，在注射测试供试品溶液50次时柱压仍然在92～97bar之间。进一步的，本发明人尝试在流动相A即乙腈和流动相B即0.1％甲酸溶液中均添加1.2％异丙醇，使得A和B中均含有相同浓度的该添加剂，仍然照试验例1的梯度洗脱程序进行洗脱，保持其它操作条件不变，结果显示，在测试供试品溶液以及其它溶液时，初始柱压在80～90bar之间，在测试供试品溶液时柱压仍然会逐渐增加，例如注射测试5个供试品溶液后柱压会增加到109～115bar之间，而在注射测试10个供试品溶液后柱压会增加到133～140bar之间，在注射测试15个供试品溶液后柱压会增加到160～168bar之间。进一步的，本发明人尝试在流动相A即乙腈和流动相B即0.1％甲酸溶液中均添加0.2％氯化铵，使得A和B中均含有相同浓度的该添加剂，仍然照试验例1的梯度洗脱程序进行洗脱，保持其它操作条件不变，结果显示，在测试供试品溶液以及其它溶液时，初始柱压在80～90bar之间，在测试供试品溶液时柱压仍然会逐渐增加，例如注射测试5个供试品溶液后柱压会增加到115～122bar之间，而在注射测试10个供试品溶液后柱压会增加到140～150bar之间，在注射测试15个供试品溶液后柱压会增加到180～190bar之间。据此可知在流动相中同时添加异丙醇和氯化铵二者能够避免在测试供试品溶液时的柱压增加的问题。

为此，在本试验例2中，除了在流动相A即乙腈和流动相B即0.1％甲酸溶液中均同时添加1.2％异丙醇和0.2％氯化铵外，其它操作条件均参照试验例1进行，各种测试液仍然使用试验例1配制的，各种试验的结果与试验例1基本相同，典型的结果如下：1)保留时间：苦参碱t约9.1min、岩白菜素t约19.1min、三叶豆紫檀苷t约46.5min，基本未变化；2)线性回归方程：苦参碱y＝21238x-44.457且R

上述在流动相中同时增补添加2种试剂的试验例2之HPLC法可用于开喉剑喷雾剂中多指标成分含量测定，包括对苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷的含量测定，具有优良的方法学性能。

中药及复方中有效物质需通过血液输送到靶点产生药理作用，因而给药后血浆含有的成分才是产生药效的物质基础。其组成包括中药复方所含有的原型成分以及代谢产物，通过给药后血中移行成分分析来确定体内直接作用的物质[杨方良,张晶,孙国祥,等.中药组方指纹图谱研究方法和思路[J].色谱,2016,34(07):715-725]。

传统实验方法大多为灌胃给药，开喉剑喷雾剂为口腔喷雾，直接作用于病灶，因此在灌胃给药的基础上增加了比格犬的口腔喷雾给药，本试验例通过HPLC-Q-TOF MS技术解析含药血浆中原型及代谢成分。

3.1材料与仪器

Sciex X500R QTOF(高分辨质谱仪，SCIEX)，Waters e2695液相色谱仪(安捷伦)，Welch Ulitimate Plus C18(月旭)，SQP Secura 125-1CN(十万分之一，Sarlorius)，BT25S电子天平(十万分之一，Sarlorius)，ST8R高速冷冻离心机(热电Thermo)，AS3120超声波提取仪(奥特塞恩斯)，G&G JJ600型电子天平(G&G公司)。

其它仪器和试剂是容易从市售途径获得的。

3.2药液制备

开喉剑喷雾剂(儿童型，批号20200415)由贵州三力制药公司提供。

3.3实验动物及RAW264.7细胞

SPF级SD雄性大鼠四只，体重为200±20g，购于斯贝福(北京)实验动物技术有限公司。比格犬雄性2只，体重分别为9.8kg、11.4kg，购于上海新冈实验动物场。

RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬白血病细胞)购于武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0190。

3.4药理实验方法

3.4.1色谱条件

色谱柱：Welch Ulitimate Plus C18(4.6×250mm，5μm)

流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)

进样量2μL，柱温30℃，流速：1mL/min，梯度洗脱见下表

3.4.2质谱条件

采用软电离电喷雾离子源(ESI)，扫描模式为正/负离子，雾化气体为氮气，辅助气1为60PSI，辅助气2为60PSI，气帘气为35PSI，雾化温度设置为600℃。正/负离子模式下，设定一级质谱母离子扫描范围为100-1800Da，选取IDA设置响应值超过100cps的4个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为100-1800Da，开启动态背景扣除(Dynamic backgroundsubtraction，DBS)，数据采集所用软件为SCIEX OS 1.4版本。

3.4.3实验动物给药及取血

四只健康SD大鼠及两只比格犬，置于湿度50％、温度25℃室内，自由进食、饮水饲养适应一周。动物给药前12h禁食不禁水，随机分组并称重，按照人/动物换算给予0.545g药液/kg体重(大鼠口服灌胃给药，一只犬口服灌胃给药，一只犬口腔喷雾给药)，空白组给予相同体积生理盐水，分别于给药后0.5h、1h、2h用3％戊巴比妥溶液(1ml/kg)麻醉取血，大鼠取血约2mL，比格犬取血约5ml，取血后匀速摇动血浆采样器，使之与管内肝素钠混合防止凝血，在4℃条件下3500r/min离心10min收集上层血浆，按组分装成每EP管1ml血浆，置-80℃冰箱中储存备用。

3.4.4血浆样品的处理

采用沉淀蛋白法处理血浆样品，取空白或给药后(冻存的或新鲜的)大鼠、比格犬血浆样品(冻存血浆预先至室温融化)，涡旋1min后取250μl于2.5ml EP管中，加入0.1％甲酸-乙腈(50：50)混合溶液750μl(该混合溶液中还添加有5％甲乙酮和1.2％硅酸钙(可过120目的细粉，预先混悬于该混合溶液中))，涡旋5min，然后在4℃条件下13000r/min离心5min，离心后将500μl上清液移至新EP管中，在氮气流下吹干，以初始比例流动相(乙腈：0.1％甲酸水溶液＝3：97)25μL复溶残渣后，涡旋1min，再超声5min，最后于4℃条件下13000r/min离心10min，取上清液置于进样小瓶，进行HPLC-Q-TOF MS测定。

3.5实验结果

3.5.1血浆样品分析

采用“3.4.4”方法处理大鼠及比格犬的血浆样品，在“3.4.1”、“3.4.2”条件下进样，通过比对大鼠空白血浆、灌胃给药血浆以及比格犬空白血浆、口腔喷雾给药血浆、灌胃给药血浆色谱数据和质谱数据，依据该等色谱数据和质谱数据解析吸收入血的原型成分及代谢产物的离子碎片，对其进行结构鉴定，大鼠及比格犬的空白血浆和给药血浆正、负离子模式结果见下表。

表：大鼠吸收入血原型及代谢成分LC-MS数据

表：比格犬口腔喷雾吸收入血原型及代谢成分LC-MS数据

表：比格犬灌胃吸收入血原型及代谢成分LC-MS数据

3.5.2血浆样品处理方法考察

试验3.5.2a：参照上文“3.4.4血浆样品的处理”的方法，取比格犬空白血浆5ml于EP管中，添加试验例1配制的苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷三种对照品储备液各100μl(三种物质添加量分别为52.3μg、102.1μg、10.34μg)，涡旋2min混合均匀，加入0.1％甲酸-乙腈(50：50)混合溶液15ml(该混合溶液中还添加有5％甲乙酮和1.2％硅酸钙(可过120目的细粉，预先混悬于该混合溶液中))，涡旋5min，然后在4℃条件下13000r/min离心5min，离心后将2ml上清液移至新EP管中，在氮气流下吹干，以初始比例流动相(乙腈：0.1％甲酸水溶液＝3：97)100μL复溶残渣后，涡旋1min，再超声5min，最后于4℃条件下13000r/min离心10min，取上清液置于进样小瓶，按照“3.4.1色谱条件”进行HPLC测定；另将苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷三种对照品储备液用初始比例流动相适当稀释后同法测定HPLC；计算三种化学物质经此空白血浆处理的回收率，平行处理测定5次，取平均值，结果回收率(n＝5)为94.6％，RSD＝2.27％。这表明处理血浆样品的方法具有相当高的回收率。参考“试验3.5.2a”的方法，不同的仅是混合溶液中未添加硅酸钙，同样测定的方法回收率(n＝5)为63.6％，RSD＝3.23％。参考“试验3.5.2a”的方法，不同的仅是混合溶液中未添加甲乙酮，同样测定的方法回收率(n＝5)为70.4％，RSD＝2.06％。参考“试验3.5.2a”的方法，不同的仅是混合溶液中未添加甲乙酮且未添加硅酸钙，同样测定的方法回收率(n＝5)为64.7％，RSD＝2.53％。这些结果表明，出人预料的发现，在处理血浆样品所用的溶剂中同时添加甲乙酮和硅酸钙可以显著提高方法的回收率。

3.6细胞实验方法

3.6.1材料与试剂

RAW246.7细胞(武汉普诺赛)，DMEM培养基(Gibco公司)，PBS缓冲液(hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，青霉素-链霉素溶液(武汉普诺赛)。

3.6.2实验仪器

SW-CJ-2FD超净台(安泰空气)，CO

3.6.3色谱条件：按照“3.4.1色谱条件”设置。

3.6.4质谱条件：按照“3.4.2质谱条件”设置。

3.7溶液的配制

3.7.1药液的配置

吸取开喉剑喷雾剂20μL于15ml离心管中，加入5％FBS完全培养基溶液至10mL，摇匀，0.22μm滤膜过滤除菌，配制成1402μg/ml的母液。从母液中吸取5mL于15mL离心管，加入5％FBS完全培养基溶液至10mL，摇匀，以此2倍量逐级稀释，共配制成1402、701、350.5μg/mL的药液。

3.7.2 10％FBS完全培养基溶液的配制

取一个50mL离心管，加入5mL FBS，再加入DMEM至刻度，最后加入500μL青霉素-链霉素溶液配制而成，放于4℃冰箱冷藏保存。

3.7.3 5％FBS完全培养基溶液的配制

取50mL离心管，加入2.5mL FBS，再加入DMEM至刻度，最后加入500μL青霉素-链霉素溶液配制而成，放于4℃冰箱冷藏保存。

3.8细胞内外液样品制备

取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度约为2×10

3.9实验结果

在上述色谱条件下得到开喉剑喷雾剂的细胞内外液色谱图和质谱图，依据所得色谱图和质谱图，对正、负离子模式下解析出的内外液成分，并用空白细胞内外液中的成分进行校正，最终得到三叶豆紫檀苷一种成分，结果见下表。

表：开喉剑喷雾剂细胞内外液LC-MS数据

3.10小结与讨论

本试验例3通过HPLC-Q-TOF MS技术，进一步解析大鼠、比格犬给药血浆中移行成分的正、负离子色谱图，通过比对给药血浆及空白血浆的色谱/质谱数据结果，分析开喉剑喷雾剂在血液中可能的移行成分，分析其质谱的裂解规律，最后在大鼠血浆中共鉴定得到10个吸收入血原型药物成分和9个代谢成分，原型成分包括是7,8-二羟基-4-甲基香豆素、三叶豆紫檀苷、N-乙酰多巴胺等，代谢成分有岩白菜素、七叶内酯等。在比格犬口腔喷雾血浆中鉴定得到2个吸收入血原型药物成分和9个代谢成分，原型成分包括7,8-二羟基-4-甲基香豆素、三叶豆紫檀苷，代谢成分有牡荆苷、氧化槐果碱等。在比格犬灌胃血浆中鉴定得到5个吸收入血原型药物成分和9个代谢成分，原型成分包括9α/14α-羟基苦参碱、三叶豆紫檀苷等，代谢成分有氧化苦参碱、氧化槐果碱等。同时对开喉剑喷雾剂细胞内外液色谱图进行解析，并用空白细胞内外液进行校正，推测其可能透过细胞膜产生药效的成分，最后在细胞内液中解析并确定的药效学基础物质成分为三叶豆紫檀苷。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。