一种用于羊粪高温堆肥的复合菌剂及其应用

摘要

本发明提供一种用于羊粪高温堆肥的复合菌剂及其应用，复合菌剂包括福氏芽胞杆菌(Bacillus fordii)FJAT‑51578和热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT‑51579；所述福氏芽胞杆菌(Bacillus fordii)FJAT‑51578，于2022年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24392；所述热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT‑51579，于2022年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24393。本发明能够促进堆肥快速升温，促进堆肥进程，同时可显著提高堆肥中碱解氮和有效磷的含量，提升堆肥的营养价值。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种用于羊粪高温堆肥的复合菌剂及其应用。

【背景技术】

化肥的施用提高了作物产量，但长期过量施用化肥导致作物营养利用率低，土壤酸化板结等，不仅造成资源浪费，还带来严重的农业面源污染问题。优化施肥方式，合理施用有机肥，是解决之一现状的有效方式。有机肥部分替代化肥有效促进化肥减量增效，降低农田营养素流失，改善土壤质量，提升土壤肥力，提高作物产量。

堆肥是养殖粪污处理的主要技术之一，是连接畜牧业和种植业的关键环节，具有重要的生态意义。堆肥将养殖废弃物转化为有机肥，解决粪污处理不当造成的环境污染，生产的有机肥作为肥料为作物提高营养物质，实现资源的循环利用。微生物堆肥是利用特定功能微生物发酵畜禽粪污、农作物秸秆等，生产有机肥。微生物肥料一种环境友好型生物肥料，能够有效提高氮肥和磷肥的利用率，促进植物生长，改善土壤质量。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种用于羊粪高温堆肥的复合菌剂及其应用，所述复合菌剂能够促进堆肥快速升温，促进堆肥进程，同时可显著提高堆肥中碱解氮和有效磷的含量，提升堆肥的营养价值。

本发明是这样实现的：

一种用于羊粪高温堆肥的复合菌剂，所述复合菌剂包括福氏芽胞杆菌(Bacillusfordii)FJAT-51578和热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT-51579；

所述福氏芽胞杆菌(Bacillus fordii)FJAT-51578，于2022年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24392，该菌株的16SrRNA序列如SEQ ID NO.1；

所述热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT-51579，于2022年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24393，该菌株的16S rRNA序列如SEQ IDNO.2。

进一步地，所述复合菌剂是由福氏芽胞杆菌(Bacillus fordii)FJAT-51578和热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT-51579两种菌株发酵液，按照1:1-0.8(V/V)的比例混合而成。

进一步地，所述复合菌剂应用于畜禽粪便的堆肥。

本发明具有如下优点：

本发明的复合菌剂中具有耐高温热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillusthermosphaericus)FJAT-51579和福氏芽胞杆菌(Bacillusfordii)FJAT-51578，该复合菌剂能够促进堆肥快速升温，最优可实现第二天温度即升高至65℃并达到82℃高温，促进堆肥进程，同时可显著提高堆肥中碱解氮和有效磷的含量，提升堆肥的营养价值。利用该复合菌剂处理畜禽粪便促进堆体升温，可实现畜禽粪便的高效转化。

【具体实施方式】

本发明涉及一种应用于羊粪高温堆肥的复合菌剂，所述复合菌剂包括福氏芽胞杆菌(Bacillus fordii)FJAT-51578和热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillusthermosphaericus)FJAT-51579；

所述福氏芽胞杆菌(Bacillus fordii)FJAT-51578，于2022年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24392，该菌株的16SrRNA序列如SEQ ID NO.1；

所述热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT-51579，于2022年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24393，该菌株的16S rRNA序列如SEQ IDNO.2。

所述复合菌剂是由福氏芽胞杆菌(Bacillus fordii)FJAT-51578和热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT-51579两种菌株发酵液，按照1:1-0.8(V/V)的比例混合而成。

所述复合菌剂用于畜禽粪便的堆肥。

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：菌株FJAT-51578和FJAT-51579的分离和鉴定

(1)菌株的分离：从福建宁德高温堆肥系统收集堆肥样本，称取样品10g，按10

(2)菌株的生理生化测定：采用API 20E对菌株进行生理生化测定。将菌株FJAT-51578和FJAT-51579在LB固体培养基上活化后，挑取单菌落转接于LB液体培养基中，55℃、170rpm振荡培养48h，获得菌悬液。API 20E测定：用量程为1000μL的枪，将菌悬液加入到API20E试剂条各微量小管内，在试验精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢和脲素小杯内加入矿物油以形成厌氧环境。盖上培养盒，于35℃培养24h后，参考说明表判读其结果。

结果如下：FJAT-51578能够利用邻硝基苯-半乳糖苷、柠檬酸盐、甘露糖、肌醇、蔗糖、苦杏仁苷和阿拉伯糖，精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和脲酶反应阳性，其余都为阴性反应(具体结果见下表1)。FJAT-51579能够利用邻硝基苯-半乳糖苷、柠檬酸盐、葡萄糖、甘露糖、肌醇、苦杏仁苷和阿拉伯糖，精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、和鸟氨酸脱羧酶反应阳性，产生硫化氢，其余都为阴性反应(具体结果见下表2)。

表1菌株FJAT-51578的API 20E试验结果

表2菌株FJAT-51579的API 20E试验结果

注：“+”为阳性反应,“-”为阴性反应

(3)菌株的16S rRNA测定：采用细菌通用16S rRNA对菌株FJAT-51578和FJAT-51579进行分子鉴定。具体步骤如下：

a、菌株活化：用接种环将菌株FJAT-51578和FJAT-51579分别划线于LB固体培养基上，置于55℃恒温培养箱中培养2d；

b、制备种子液：将步骤a所获得的菌株FJAT-51578和FJAT-51579的单菌落分别接种于20mL的LB液体培养基中，55℃、170r/min振荡培养24h，得种子液；

c、基因组DNA的提取：

①取种子液1mL于已灭菌的1.5mL离心管中，1mL的细胞悬液在8000g下离心2min。弃去上清液以后，用400μL STE Buffer(100mM NaCl，10mM Tris/HCl，1mM EDTA，pH 8.0)冲洗细胞两次。然后在8000g下离心2min，弃去上清。

②用200μLTE Buffer(10mM Tris-HCl,1mM EDTA，pH 8.0)悬浮菌体，然后用100μLTris-saturatedphenol(pH 8.0)加到离心管中，涡旋混合60s。

③接着在4℃下用13000g离心5min以从有机相中分离出水相，然后取160μL上清液转移到干净的1.5mLEP管中。

④加40μL的TE Buffer到EP管中，然后用100μL氯仿混合，在4℃，13000g离心5min。用氯仿提取的方法纯化裂解液直到没有白色的界面出现；这个过程要重复两到三遍。

⑤取160μL上清液到干净的1.5mLEP管中，再加40μLTE和5μL的RNase(10mg/ml)并在37℃下放置10min，以分解RNA。

⑥接着将100μL的氯仿加到离心管中，混合后，在4℃下13000g离心5min。

⑦再将100μL的上清液转移到干净的1.5mL EP管中，获得细菌DNA。

d、PCR鉴定：分别以提取所获得的菌株FJAT-51578和FJAT-51579的基因组DNA为模板，利用16S rRNA通用引物27F(5′-GAG TTTGAT CCT GGC TCA G-3′，如SEQ ID NO.3所示)和1492R(5′-ACG GCTACCTTG TTA CGACTT-3′，如SEQ ID NO.4所示)进行PCR反应；

PCR反应体系(25μL)：ddH

PCR反应程序为：95℃预变性5min；接着95℃变性30s，55℃退火60s，72℃复性90s，30个循环；最后72℃延伸10min；

PCR产物的检测：将PCR产物点样于1.5％的琼脂糖凝胶(含染料GV-1)，以100bpDNA Ladder Marker作为标准分子量，80V电压、1倍TAE缓冲液中电泳40min，用凝胶成像系统观察结果。

测序：将PCR产物送至铂尚生物技术有限公司进行测序。

16S rRNA序列(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)分析：将所得序列在细菌序列比对网站EZtaxon-e.ezbiocloud.net上进行序列比对分析后，初步判断得出该菌株的分类地位。

结果如下：FJAT-51578的16S rRNA基因序列长度为1009bp，与NCBI基因库序列比对结果显示与福氏芽孢杆菌(Bacillus fordii)同源性达99.33％。FJAT-51579的16S rRNA基因序列长度为1421bp，与NCBI基因库序列比对结果显示与热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)同源性达99.43％。综上，分离得到的菌株FJAT-51578命名为福氏芽孢杆菌(Bacillus fordii)FJAT-51578；分离得到的菌株FJAT-51579命名为热球状尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus)FJAT-51579。

实施例2：菌株FJAT-51578和FJAT-51579复合菌剂的制备

a、菌株活化：将菌株FJAT-51578和FJAT-51579分别在LB固体培养基55℃-60℃下活化培养12-48h；

b、种子液制备：将步骤a所获得的活化菌株FJAT-51578和FJAT-51579的单菌落分别接种于200mL的LB液体培养基中，55℃-60℃、170r/min振荡培养24h，得种子液；

c、发酵液制备：将步骤b获得的种子液按照1％-5％的体积比分别添加至LB培养基中进行扩大培养，温度为55℃-60℃，170-180r/min振荡培养24-48h，获得发酵液；

d、堆肥接种菌剂制备：将步骤c所获得的菌株FJAT-51578和FJAT-51579的发酵液，按照1:1-0.8(V/V)的比例混合，制备成复合菌株发酵液。将上述复合菌株发酵液按照1.0-1.5:10(V/V)添加至麸皮中，获得堆肥接种菌剂，其中的活菌数大于10

e、堆肥：将步骤d获得的堆肥接种菌剂，按照0.1％-0.5％(V/V)的添加量混合入堆肥原料。堆肥原料为羊粪和鸡粪的混合物，调整堆料含水量至45％-60％，进行静态堆肥，15-20天结束堆肥。

所述LB培养基成分为：胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeast extract)5g，氯化钠(NaCl)10g，固体培养基另加15-20g琼脂粉；加双蒸水至1000mL,用5mol/LNaOH调pH至7.2，121℃灭菌30min。

实施例3：堆肥接种菌剂的应用与效果

(1)以质量比为3:1的羊粪和鸡粪为堆肥原料，添加0.1％-0.5％FJAT-51578和FJAT-51579的堆肥接种菌剂，进行堆置静态发酵，此为接菌处理组。另设对照，加入合作社自制菌剂(主要成分为枯草芽孢杆菌和可溶性淀粉，其中枯草芽孢杆菌达5×10

接菌处理组第二天温度即升高至60℃，最高温度达80℃；对照组在第二天温度升至45℃，在第四天达到72℃。接菌处理组持续的高温能够有效杀灭堆料中的虫卵，达到无害化效果。

(2)以质量比为2:1的羊粪和鸡粪为堆肥原料，添加0.1％-0.5％FJAT-51578和FJAT-51579的堆肥接种菌剂，进行堆置静态发酵，此为接菌处理组。另设对照，加入合作社自制菌剂(主要成分为枯草芽孢杆菌和可溶性淀粉，其中枯草芽孢杆菌达5×10

接菌处理组第二天温度即升高至62℃，最高温度达80℃；对照组在第二天温度升至46℃，在第四天达到70℃。接菌处理组持续的高温能够有效杀灭堆料中的虫卵，达到无害化效果。

(3)以质量比为1:1的羊粪和鸡粪为堆肥原料，添加0.1％-0.5％FJAT-51578和FJAT-51579的堆肥接种菌剂，进行堆置静态发酵，此为接菌处理组。另设对照，加入合作社自制菌剂(主要成分为枯草芽孢杆菌和可溶性淀粉，其中枯草芽孢杆菌达5×10

接菌处理组第二天温度即升高至65℃，最高温度达82℃；对照组在第二天温度升至50℃，在第四天达到75℃。接菌处理组持续的高温能够有效杀灭堆料中的虫卵，达到无害化效果。

(4)堆肥结束后接菌处理和对照组的成分分析如下表3所示，从中可知添加FJAT-51578和FJAT-51579的堆肥接种菌剂能够有效提高堆肥的碱解氮和有效磷的含量。接菌处理组的C/N显示堆肥已经达到腐熟状态，说明添加0.1％-0.5％的FJAT-51578和FJAT-51579的堆肥接种菌剂能够促进堆肥有机物的降解。

表3堆肥营养素分析

(4)称取10g各组堆肥结束后的样本，加入100mL蒸馏水，震荡1h，混匀，获得堆肥浸提液。培养皿中铺设无菌滤纸，加入3mL浸提液，每个培养皿中放置10颗辣椒种子，置于25℃，黑暗培养7d。辣椒种子发芽率实验结果如下表4所示，从表中可知接种复合菌剂的堆肥发芽指数都为95％以上，高于对照组的80％，说明接种本发明提供的堆肥接种菌剂有利于降低堆肥的生物毒性，促进堆肥的腐熟。

表4发芽率实验结果

(4)对照组和接菌处理组细菌分布具有明显差异。以质量比为3:1的羊粪和鸡粪为堆肥原料进行堆肥的对照组和接菌处理组为例，两组的堆肥细菌群落分布特性如下表5所示，从中可以看出接菌处理组中的糖单孢菌、链霉菌、热裂孢菌、长孢菌、和高温放线菌的相对含量显著高于对照组，可促进堆肥有机质的降解和转化，提升堆肥转化效率。

表5堆肥细菌群落分布特性

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 福建省农业科学院农业生物资源研究所

<120> 一种用于羊粪高温堆肥的复合菌剂及其应用

<130> 100

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1009

<212> DNA

<213> （Bacillus fordii）

<400> 1

tggggtgtgc tataatgcaa gtcgagcgga tgaagagagc ttgctctctg gaatcagcgg 60

cggacgggtg agtaacacgt gggcaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc 120

ggggctaata ccggataact tcttttcccg catggggaga ggttgaaaga cggttatgct 180

gtcacttaca gatgggcccg cggcgcatta gctagttggt ggggtaacgg cctaccaagg 240

cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300

gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360

acgccgcgtg agtgacgaag gccttcgggt cgtaaaactc tgttatcagg gaagaacaag 420

catcgtttaa ctgacggtgc catgacggta cctgaccaga aagccacggc taactacgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg 540

cgcgcaggcg gcttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt 600

ggaaactggg aggcttgagt gcagaagagg agagcggaat tccacgtgta gcggtgaaat 660

gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctc tctggtctgt aactgacgct 720

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ctggccggcc tggagaagat cttcccttcg ggacagggtg acagtggtg 1009

<210> 2

<211> 1421

<212> DNA

<213> （Ureibacillus thermosphaericus）

<400> 2

tgcagtcgag cgaaccaatt gaaagcctag ctttcatgag gttagcggcg gacgggtgag 60

taacacgtgg gtaacctgcc ctatagactg ggataactcg cggaaacgcg tgctaatacc 120

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tggctgcacc ttgacggtac cttactagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540

tctcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc ttaaccgggg agggtcattg gaaactggga 600

gacttgagtg caggagaggg aagcggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagagata 660

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gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

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gctatggaga catagccttc ccttcgggga cagcggtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020

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tgcaggctgc aactcgcctg catgaagccg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320

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acccgaagtc ggtgaggtaa cccttcggag ccagccgccg a 1421

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gagtttgatc ctggctcag 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

acggctacct tgttacgact t 21