一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法

摘要

本发明涉及一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法，包括：按6‑8％的接种量，向发酵罐A中的发酵培养基A中接种阿维链霉菌种子液A后，进行发酵培养；当发酵罐A中，阿维链霉菌发酵培养30‑40h，按体积分数1.5‑5％，向其中补入发酵罐B中处于产素期的阿维菌素发酵液，然后发酵罐A继续培养至总时间为350‑360时，放罐，即可。本发明能够缩短阿维链霉菌发酵的稳定期，延长其产素期，提高阿维菌素的发酵效价。

说明书

技术领域

本发明涉及阿维菌素的发酵技术领域，具体涉及一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法。

背景技术

阿维菌素是阿维链霉菌在含有碳源、氮源、无机盐和微量元素的培养基中通气搅拌、深层发酵产生的一组十六元大环内酯结构的多组分生物杀虫杀螨剂。在其发酵液含有的8种组分中，B1a组分杀虫效果最佳，是商品化阿维菌素的主要组分。业内将B1a的含量作为衡量发酵效价高低的指标。

通过对阿维链霉菌发酵动力学的研究表明：阿维链霉菌的发酵过程需要经历生长繁殖期、稳定期、产素期和衰老期，属于非生长偶联型。而阿维菌素是阿维链霉菌生长繁殖到一定阶段才会开始合成，这在发酵效价上，则表现为前期发酵效价增长较慢，中后期增长相对较快；具体来说，就是：在阿维菌素发酵效价增长的过程中，发酵培养100h～放罐的这段时间段里，发酵效价增长迅速，增长率达20～25μɡ/(mL·h)，且成线性增长；而在发酵培养100h之前的这段时间段里，发酵效价增长则相对较慢。这就限制了发酵的最终效价，以及发酵时间；因此，研发一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法，缩短阿维链霉菌的稳定期，延长了产素期，对于提高阿维菌素的发酵效价显得至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法，其能够缩短阿维链霉菌发酵的稳定期，延长其产素期，提高阿维菌素的发酵效价。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法，包括：

按6-8％的接种量，向发酵罐A中的发酵培养基A中接种阿维链霉菌种子液A后，进行发酵培养；

当发酵罐A中，阿维链霉菌发酵培养30-40h，按体积分数1.5-5％，向其中补入发酵罐B中处于产素期的阿维菌素发酵液，然后发酵罐A继续培养至总时间为350-360时，放罐，即可。

进一步的，优选为按体积分数1.5-2.5％，向发酵罐A中补入处于产素期的阿维菌素发酵液的量。

进一步的，所述发酵罐A中，阿维链霉菌培养至30-40h时，处于稳定期，菌丝成球良好。

进一步的，所述处于产素期的阿维菌素发酵液中，阿维菌素B1a的效价为1000～3000μɡ/mL，菌丝体体积分数40％～50％、糖质量浓度100～150ɡ/L、蛋白质15～18ɡ/L。

进一步的，所述处于产素期的阿维菌素发酵液的培养时间为100-200h。

进一步的，在向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维菌素发酵液前，还需：按6-8％的接种量，向发酵罐B的发酵培养基B中接种阿维链霉菌种子液B，并进行发酵培养；

更进一步的，在向发酵罐A和发酵罐B中接种阿维链霉菌种子液前，需要分别向2个种子罐的种子培养基中接种阿维链霉菌，然后分别发酵培养50-60h，制备成阿维链霉菌种子液A和阿维链霉菌种子液B。

更进一步的，2个种子罐中的种子培养基相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉25ɡ/L、黄豆饼粉6ɡ/L、花生饼粉6ɡ/L、酵母粉3ɡ/L、酵母膏3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂3ɡ/L、氯化钴0.022ɡ/L、余量水；灭菌温度120～123℃、灭菌时间30min；

2个种子罐的发酵条件相同，均为：温度28～29℃、风量0.5～1m

更进一步的，发酵培养基A与发酵培养基B相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉174ɡ/L、黄豆饼粉21ɡ/L、酵母粉10ɡ/L、轻质碳酸钙1.6ɡ/L、玉米浆3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂4.3ɡ/L、淀粉酶：淀粉＝0.00025；灭菌温度121～123℃、灭菌时间30min.、90℃淀粉糖化45min；

发酵罐A和发酵罐B的发酵条件相同，均为：温度27～28℃、风量0.5～0.7m

进一步的，在向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维链霉菌发酵液后，还需立即将发酵罐A中的阿维链霉菌发酵液回补于发酵罐B中，发酵罐A向发酵罐B的回补体积等于发酵罐B向发酵罐A的补液体积。

进一步的，当发酵罐A发酵培养至250h后，按体积分数1-2％，向发酵罐A中补入补料培养基，所述补料培养基为糖液。

与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：

1、本发明通过在发酵前期补入适量的产素期发酵液，利用产素期发酵液中含有的具有次级代谢能力的菌丝体诱导阿维链霉菌生物合成阿维菌素，使阿维菌素发酵过程中的起始效价增加了0.3～0.5倍，达到300～400μɡ/m，放罐效价提高了10％～13％，达到7055μɡ/mL；此外，产素期发酵液中还含有生物合成阿维菌素所需的各种酶和启动因子，有益于缩短稳定期，延长产素期。

2、本发明严格控制产素期发酵液的补入量为小于2.5％，避免因补入量过多导致前期效价增长过快，后期效价增长过慢，从而导致的最终发酵效价不理想的问题。此外，当产素期发酵液的补入量稍大时，本发明还通过补入糖液培养基，来解决发酵后期效价增长过慢的问题。

附图说明

图1为本发明实施例1中阿维菌素发酵效价随时间的线性回归图；

图2为本发明实施例2中阿维菌素发酵效价随时间的线性回归图；

图3为本发明实施例3中阿维菌素发酵效价随时间的线性回归图；

图4为本发明对比例1中阿维菌素发酵效价随时间的线性回归图；

图5为本发明对比例2中阿维菌素发酵效价随时间的线性回归图；

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行进一步详细的叙述。

实施例1

一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法，包括如下步骤：

步骤1：制备种子液

分别向种子罐A的种子培养基和种子罐B的种子培养基中接种阿维链霉菌，然后分别发酵培养50-60h，制备成阿维链霉菌种子液A和阿维链霉菌种子液B；种子罐B的接种时间早于种子罐A115h；

2个种子罐中的种子培养基相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉25ɡ/L、黄豆饼粉6ɡ/L、花生饼粉6ɡ/L、酵母粉3ɡ/L、酵母膏3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂3ɡ/L、氯化钴0.022ɡ/L、余量水；计料体积8～9m

2个种子罐的发酵条件相同，均为：温度28～29℃、风量0.5～1m

步骤2：发酵

按6-8％的接种量，向发酵罐B中的发酵培养基B中接种阿维链霉菌种子液B，进行发酵培养；

按6-8％的接种量，向发酵罐A中的发酵培养基A中接种阿维链霉菌种子液A，进行发酵培养；

发酵培养基A与发酵培养基B相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉174ɡ/L、黄豆饼粉21ɡ/L、酵母粉10ɡ/L、轻质碳酸钙1.6ɡ/L、玉米浆3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂4.3ɡ/L、淀粉酶；淀粉酶的加入量为玉米淀粉重量的0.00025倍；计料体积91～93m

发酵罐A和发酵罐B的发酵条件相同，均为：温度27～28℃、风量0.5～0.7m

步骤3：补液诱导：

当发酵罐A中，发酵培养33h，处于稳定期时，此时，发酵罐B正好培养了148h，处于产素期(效价为2236μɡ/mL，菌丝体体积分数46％，糖质量浓度120ɡ/L、蛋白质16ɡ/L)；此时，按体积分数2％，向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维菌素发酵液2m

其中，在向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维链霉菌发酵液后，还需立即将发酵罐A中的阿维链霉菌发酵液回补于发酵罐B中，然后发酵罐B继续后继的发酵操作，直至放罐；发酵罐A向发酵罐B的回补体积等于发酵罐B向发酵罐A的补液体积。

发酵过程中，补入产素期阿维链霉菌发酵液B后，按生产作业计划每隔24小时测定一次发酵罐A的发酵效价，结果见表1，并绘制52h后效价随时间的线性回归图，见图1。

表1

本实施例发酵过程中，培养30-33h时为稳定期，总时长为3h；培养34-352h时为产素期，总时长为318h；发酵罐A的培养总时长为352h，放罐效价为7055μɡ/mL。

从上述数据可知：向发酵罐A中补入产素期发酵液B后，发酵罐A中的发酵效价呈线性增长(斜率k＝22.467，R

实施例2：

一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法，包括如下步骤：

步骤1：制备种子液

分别向种子罐A的种子培养基和种子罐B的种子培养基中接种阿维链霉菌，然后分别发酵培养50-60h，制备成阿维链霉菌种子液A和阿维链霉菌种子液B；种子罐B的接种时间早于种子罐A125h；

2个种子罐中的种子培养基相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉25ɡ/L、黄豆饼粉6ɡ/L、花生饼粉6ɡ/L、酵母粉3ɡ/L、酵母膏3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂3ɡ/L、氯化钴0.022ɡ/L、余量水；计料体积8～9m

2个种子罐的发酵条件相同，均为：温度28～29℃、风量0.5～1m

步骤2：发酵

按6-8％的接种量，向发酵罐B中的发酵培养基B中接种阿维链霉菌种子液B，进行发酵培养；

按6-8％的接种量，向发酵罐A中的发酵培养基A中接种阿维链霉菌种子液A，进行发酵培养；

发酵培养基A与发酵培养基B相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉174ɡ/L、黄豆饼粉21ɡ/L、酵母粉10ɡ/L、轻质碳酸钙1.6ɡ/L、玉米浆3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂4.3ɡ/L、淀粉酶；淀粉酶的加入量为玉米淀粉重量的0.00025倍；计料体积91～93m

发酵罐A和发酵罐B的发酵条件相同，均为：温度27～28℃、风量0.5～0.7m

步骤3：补液诱导：

当发酵罐A中，发酵培养31h，处于稳定期时，此时，发酵罐B正好培养了156h，处于产素期(效价为2364μɡ/mL，菌丝体体积分数45％，糖质量浓度116ɡ/L、蛋白质16ɡ/L)；此时，按体积分数5％，向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维菌素发酵液5m

其中，在向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维链霉菌发酵液后，还需立即将发酵罐A中的阿维链霉菌发酵液回补于发酵罐B中，然后发酵罐B继续后继的发酵操作，直至放罐；发酵罐A向发酵罐B的回补体积等于发酵罐B向发酵罐A的补液体积。

发酵过程中，补入产素期阿维链霉菌发酵液B后，按生产作业计划每隔24小时测定一次发酵罐A的发酵效价，结果见表2，并绘制55h后效价随时间的线性回归图，见图2。

表2

本实施例发酵过程中，培养30-31h时为稳定期，总时长为1h；培养32-357h时为产素期，总时长为325h；发酵罐A的培养总时长为357h，放罐效价为6659μɡ/mL。

从上述数据可知：向发酵罐A中补入体积分数5％处于产素期的阿维链霉菌发酵液B后，在发酵罐A发酵培养100h前，效价增长较快，即103小时达到1507μɡ/mL，但在247h以后，发酵效价增长较慢(k＝20.739、R

实施例3

一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法，包括如下步骤：

步骤1：制备种子液

分别向种子罐A的种子培养基和种子罐B的种子培养基中接种阿维链霉菌，然后分别发酵培养50-60h，制备成阿维链霉菌种子液A和阿维链霉菌种子液B；种子罐B的接种时间早于种子罐A108h；

2个种子罐中的种子培养基相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉25ɡ/L、黄豆饼粉6ɡ/L、花生饼粉6ɡ/L、酵母粉3ɡ/L、酵母膏3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂3ɡ/L、氯化钴0.022ɡ/L、余量水；计料体积8～9m

2个种子罐的发酵条件相同，均为：温度28～29℃、风量0.5～1m

步骤2：发酵

按6-8％的接种量，向发酵罐B中的发酵培养基B中接种阿维链霉菌种子液B，进行发酵培养；

按6-8％的接种量，向发酵罐A中的发酵培养基A中接种阿维链霉菌种子液A，进行发酵培养；

发酵培养基A与发酵培养基B相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉174ɡ/L、黄豆饼粉21ɡ/L、酵母粉10ɡ/L、轻质碳酸钙1.6ɡ/L、玉米浆3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂4.3ɡ/L、淀粉酶；淀粉酶的加入量为玉米淀粉重量的0.00025倍；计料体积91～93m

发酵罐A和发酵罐B的发酵条件相同，均为：温度27～28℃、风量0.5～0.7m

步骤3：补液诱导：

当发酵罐A中，阿维链霉菌发酵培养31h，处于稳定期时，此时，发酵罐B正好培养了139h，处于产素期(效价为2176μɡ/mL，菌丝体体积分数47％，糖质量浓度118ɡ/L、蛋白质16ɡ/L)；此时，按体积分数5％，向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维菌素发酵液5m

步骤4：中后期补糖

补糖培养基：取淀粉1吨，淀粉酶0.5公斤，消泡剂20公斤，水2立方米；灭菌温度121～123℃，灭菌时间30min.，降温28～30℃至备用；其中，补糖培养基灭菌前加热至90℃，并于90℃淀粉糖化45min；

发酵罐A培养245小时，将上述补糖培养基一次性补入发酵罐A中，继续培养至总时间为357小时，放罐，即可。

其中，在向发酵罐A中补入发酵罐B中处于产素期的阿维链霉菌发酵液后，还需立即将发酵罐A中的阿维链霉菌发酵液回补于发酵罐B中，然后发酵罐B继续后继的发酵操作，直至放罐；发酵罐A向发酵罐B的回补体积等于发酵罐B向发酵罐A的补液体积。

发酵过程中，补入产素期阿维链霉菌发酵液B后，按生产作业计划每隔24小时测定一次发酵罐A的发酵效价，结果见表3，并绘制51h后效价随时间的线性回归图，见图3。

表3

本实施例发酵过程中，培养30-31h时为稳定期，总时长为1h；培养32-357h时为产素期，总时长为325h；发酵罐A的培养总时长为357h，放罐效价为7479μɡ/mL。

从上述数据可知：向发酵罐A中补入体积分数5％处于产素期的阿维链霉菌发酵液B后，在发酵罐A发酵培养100h前，效价增长较快，即99小时达到1330μɡ/mL，但在245h补入1吨淀粉水解液后，发酵效价仍快速增长，放罐效价达7479μɡ/mL。发酵全程效价增长率(k)达24.024μɡ/mL,即高于实施例2(k＝20.739)，又高于实施例1(k＝22.467)。

对比例1：

一种阿维菌素发酵方法，包括如下步骤：

步骤1：制备种子液

向种子罐的种子培养基中接种阿维链霉菌，然后发酵培养50-60h，制备成阿维链霉菌种子液；

种子培养基包括如下浓度的各原料：玉米淀粉25ɡ/L、黄豆饼粉6ɡ/L、花生饼粉6ɡ/L、酵母粉3ɡ/L、酵母膏3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂3ɡ/L、氯化钴0.022ɡ/L、余量水；计料体积8～9m

种子罐的发酵条件为：温度28～29℃、风量0.5～1m

步骤2：发酵

按6-8％的接种量，向发酵罐中的发酵培养基中接种阿维链霉菌种子液，进行发酵培养355h，放罐；

发酵培养基包括如下浓度的各原料：玉米淀粉174ɡ/L、黄豆饼粉21ɡ/L、酵母粉10ɡ/L、轻质碳酸钙1.6ɡ/L、玉米浆3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂4.3ɡ/L、淀粉酶；淀粉酶的加入量为玉米淀粉重量的0.00025倍；计料体积91～93m

发酵罐的发酵条件为：温度27～28℃、风量0.5～0.7m

发酵过程中，按生产作业计划每隔24小时测定一次发酵罐的发酵效价，结果见表4，并绘制100h后的效价随时间变化的回归曲线图，见图4。

表4

本对比例的发酵过程中，培养0-30h时为菌丝生长繁殖期，此期间没有阿维菌素的合成，培养30-54h时为稳定期，总时长为24h；培养54-355h时为产素期，总时长为301h；发酵罐A的培养总时长为355h，放罐效价为6334μɡ/mL。发酵进入稳定期，稳定一段时间后逐步开始阿维菌素的生物合成，但合成速度缓慢，至102h发酵效价906μɡ/mL；此后的发酵效价进入线性(y＝21.85x-1333.1、R

对比例2：

一种阿维菌素发酵方法，包括如下步骤：

步骤1：制备种子液

分别向种子罐A的种子培养基和种子罐B的种子培养基中接种阿维链霉菌，然后分别发酵培养50-60h，制备成阿维链霉菌种子液A和阿维链霉菌种子液B；种子罐B的接种时间早于种子罐A125h；

2个种子罐中的种子培养基相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉25ɡ/L、黄豆饼粉6ɡ/L、花生饼粉6ɡ/L、酵母粉3ɡ/L、酵母膏3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂3ɡ/L、氯化钴0.022ɡ/L、余量水；计料体积8～9m

2个种子罐的发酵条件相同，均为：温度28～29℃、风量0.5～1m

步骤2：发酵

按6-8％的接种量，向发酵罐B中的发酵培养基B中接种阿维链霉菌种子液B，进行发酵培养；

按6-8％的接种量，向发酵罐A中的发酵培养基A中接种阿维链霉菌种子液A，进行发酵培养；

发酵培养基A与发酵培养基B相同，均包括如下浓度的各原料：玉米淀粉174ɡ/L、黄豆饼粉21ɡ/L、酵母粉10ɡ/L、轻质碳酸钙1.6ɡ/L、玉米浆3ɡ/L、固体碱0.3ɡ/L、消泡剂4.3ɡ/L淀粉酶；淀粉酶的加入量为玉米淀粉重量的0.00025倍；计料体积91～93m

发酵罐A和发酵罐B的发酵条件相同，均为：温度27～28℃、风量0.5～0.7m

步骤3：灭活菌丝体

种子罐C清洗，空罐灭菌(123～125℃、灭菌时间30min.)后，将冷凝水压出，降温至29～30℃、备用。

将发酵罐B中培养至137h，处于产素期(效价2065μɡ/mL，菌丝体体积分数45％，糖浓度115ɡ/L，蛋白质16ɡ/L)发酵液压入上述备用的种子罐C中2m

步骤4：补液

在发酵罐A发酵培养33h，处于稳定期时，将上述备用的种子罐C中2m

发酵过程中，按照生产作业计划，每隔24小时取样测定一次发酵罐的发酵效价，结果见表5，并绘制100h后的效价随时间变化的线性回归图，见图5。

表5

数据显示，31h效价为0μɡ/mL，56h效价289μɡ/mL，80h效价587μɡ/mL，104h效价1065μɡ/mL，前期效价增长不明显，说明其发酵过程仍存在一定时间段的稳定期。补入发酵液中的各种酶和启动因子，对促进阿维链霉菌由初级代谢向次级代谢转化的影响有限；因此可以说明本发明实施例1-3中，起到缩短稳定期作用的因素并非是因为在稳定期补入了发酵液中除菌丝体之外的其他物质比如酶和启动因子，因此，可以说明：本发明在发酵培养至稳定期时，补入产素期菌丝体，对诱导阿维链霉菌缩短稳定期，快速生物合成阿维菌素有着关键作用，这也是生命体的魅力之所在。

本对比例的发酵过程中，培养0-30h时为菌丝生长繁殖期，此期间没有阿维菌素的合成，培养30-56h时为稳定期，总时长为26h；培养56-357h时为产素期，总时长为301h；发酵罐A的培养总时长为357h，放罐效价为6613μɡ/mL。104h发酵效价1065μɡ/mL，此后的发酵效价进入线性(y＝21.799x-1132.7.1、R

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。