东北刺人参不定根提取物在制备治疗和/或预防酒精肝药物中的应用

摘要

本发明公开了东北刺人参不定根提取物在制备治疗和/或预防酒精肝药物中的应用。东北刺人参不定根提取物的纯化通过大孔吸附树脂提取分离，获得所述东北刺人参不定根提取物以及通过HPLC对提取物含量检测。该东北刺人参不定根提取物可以显著保护酒精造成的肝脏损伤，肝脏坏死程度明显减少，能够显著降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，通过调控Keap1‑Nrf2信号通路减少酒精引起肝脏氧化应激，并且能够调控铁死亡信号通路相关基因抑制铁死亡减少脂质积聚，从而保护肝脏，减轻肝损伤。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，确切的说是东北刺人参不定根提取物在制备治疗和/或预防酒精肝药物中的应用。

背景技术

酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至进展为肝癌。由于我国的酒文化历史悠久，又由于不良的生活习惯和饮食习惯导致当代患ALD的患者比例日益增加，90％的高危饮酒患者发生肝脂肪变性，20％的高危饮酒患者发生酒精性肝炎；3％～10％的酒精性肝炎患者进展为肝硬化。临床上，由于不同的饮酒时间和饮酒量所反映的临床表现也有所不同，所以难以选择合适的治疗方案。

ALD的机制也是分不同阶段的，目前认为氧化应激和内毒素是ALD的主要环节，酒精进入肝脏后，肝脏代谢功能紊乱，酒精过多摄入会影响脂质代谢的正常功能，引起脂质积聚，诱发脂肪肝。脂质的过度积累后，会引发脂质过氧化，诱发铁死亡，在脂肪肝的基础上肝脏会发生炎症、坏死以及纤维化，最终发展为肝硬化。所以针对ALD复杂的机制，药物治疗的选择目前还未有专一性的特效药，目前临床上有美多他辛、联苯双酯和水飞蓟素等均有一定的治疗作用，但治疗机制单一并不能对抗不同阶段的ALD患者，且具有许多副作用。

中药具有多成分多靶点的特点，无论是单味药还是复方药均能发挥从多个角度预防或治疗疾病的作用，且具有安全性较高，毒副作用小的优点。东北刺人参(Oplopanaxelatus Nakai)，五加科刺人参属植物，是我国长白山特有植物资源之一，为国家二级野生保护植物，其药用价值极高，含有多种有效成分，如皂苷、多糖和挥发油等，也称为长白山区的“木本人参”。目前有关东北刺人参的文献报道大部分为药效成分和药理研究，临床应用相对很少，所以，进一步对其资源的有效开发利用具有重要意义。且由于东北刺人参野生资源较少，人工栽培目前也不稳定，更是为东北刺人参的资源开发带来了难度。由于东北刺人参的野生资源宝贵，栽培材料时间较长，所以寻找一种可替代植物资源更有利于东北刺人参的开发利用。生物反应器是植物组织培养的一种高效的可控的新型培养技术，可以短时间大量产出实验材料，目前已有相关文献报道了生物反应器培养出的东北刺人参不定根提取物具有良好的抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌活性，但还未发现东北刺人参提取物在预防酒精肝的文献及应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种东北刺人参不定根提取物在制备治疗和/或预防酒精肝药物中的应用。

本发明利用小鼠酒精肝模型，首次探讨了东北刺人参不定根提取物在酒精性肝病的肝保护机制，研究发现不定根提取物的保肝机制可能是通过抑制酒精引起的氧化应激和脂质代谢发挥作用的。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现：

东北刺人参不定根提取物在制备治疗和/或预防酒精肝药物中的应用。

所述的酒精肝为酒精性肝病。

所述的药物为能够调控Keap1-Nrf2信号通路相关基因表达的药物。

优选的，所述的Keap1-Nrf2信号通路相关基因为Keap1、Hmox1和Gclc。

优选的，所述的药物是通过调控Keap1-Nrf2信号通路相关基因来治疗和/或预防酒精肝的。

所述的药物为能够调控铁死亡信号通路相关基因表达的药物。

优选的，所述的铁死亡信号通路相关基因为Acsl4和Ptgs2。

优选的，所述的药物是通过调控铁死亡信号通路相关基因来治疗和/或预防酒精肝的。

所述的药物为能够调节血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的药物。

所述的药物为能够调节脂质代谢紊乱的药物。

所述的药物为能够调节血清中甘油三酯和总胆固醇的药物。

所述的药物为能够改善肝细胞脂肪变性的药物。

所述的药物为能够缓解酒精性脂肪肝中气泡性现象和炎性浸润症状的药物。

一种治疗和/或预防酒精肝药物，包括东北刺人参不定根提取物。

所述的东北刺人参不定根提取物包括但不限于东北刺人参不定根乙醇粗提物、东北刺人参不定根水洗脱组分、东北刺人参不定根50％乙醇洗脱组分和东北刺人参不定根95％乙醇洗脱组分中的至少一种；优选为东北刺人参不定根50％乙醇洗脱组分。

所述的药物选自以下的剂型：片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射剂。

所述的药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料或载体。

所述的药物为解酒保肝药物和/或保健品。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点和有益效果：

(1)东北刺人参不定根提取物的毒副作用很低，且对肝脏不会造成药物性损伤，所以与其他用于酒精性肝病的药物相比，不会在预防或治疗的过程中对肝脏造成二次损伤。

(2)通过进一步的实验研究发现，东北刺人参不定根提取物处理后，酒精肝小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平显著降低，并明显减轻酒精引起的肝脏病理损伤。

(3)由于东北刺人参具有良好的抗氧化作用，而酒精性肝病的发病机制中，氧化应激反应也是较为重要的一环，东北刺人参不定根提取物能显著调节小鼠肝脏中的Keap1-Nrf2信号通路相关基因表达(Keap1、Hmox1和Gclc)以及抑制铁死亡相关基因(Acsl4和Ptgs2)，减少肝脏中酒精引起的脂质代谢紊乱和铁死亡，所以东北刺人参不定根提取物在预防酒精性肝损伤具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为东北刺人参不定根提取物HPLC结果图，其中(a)为绿原酸和异绿原酸A标准品HPLC结果图；(b)为东北刺人参不定根50％乙醇洗脱提取物的绿原酸和异绿原酸A的HPLC结果图。

图2为东北刺人参不定根提取物在酒精肝模型中小鼠血清的谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量检测结果图，其中(a)为谷丙转氨酶结果图；(b)为谷草转氨酶结果图。

图3为东北刺人参不定根提取物对酒精肝模型小鼠肝脏病理损伤的影响。

图4为东北刺人参不定根提取物在酒精肝模型中对小鼠肝脏Keap1-Nrf2相关基因表达的影响结果图，其中(a)为Keap1基因表达结果图；(b)为Hmox1基因表达结果图；(c)为Gclc基因表达结果图。

图5为东北刺人参不定根提取物在酒精肝模型中对小鼠肝脏铁死亡相关基因表达的影响结果图，其中(a)为Acsl4基因表达结果图；(b)为Ptgs2基因表达结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1

东北刺人参不定根提取物的制备

将东北刺人参不定根干品浸泡于体积百分比为75％乙醇中(1:10g/mL)，60℃冷凝回流1h后，抽滤，收集滤液，残渣再次进行冷凝回流重复2次，将滤液合并，在45℃条件下减压干燥即得不定根乙醇提取物干品。

之后进一步对不定根乙醇提取物进行纯化，纯化使用的大孔吸附树脂为HPD-722型树脂，不定根乙醇提取物干品的质量与树脂体积的比例为1:10g/mL；所述洗脱使用的洗脱剂为50％乙醇溶液，洗脱剂体积为3BV，即得到纯化的东北刺人参不定根50％乙醇洗脱组分，洗脱液通过旋转蒸发仪于37℃挥干溶剂直至提取物质量恒定无乙醇气味后即得东北刺人参不定根50％乙醇洗脱组分样品。利用HPLC检测样品，并与标准品比对，计算得到样品中的绿原酸含量与异绿原酸A的含量。

实施例2

东北刺人参不定根提取物在小鼠酒精肝模型中的保肝作用研究

实验材料

采用实施例2中纯化的东北刺人参不定根50％乙醇洗脱组分作为主要研究样品，探究东北刺人参不定根是否在酒精肝模型中具有干预作用。

实验方法

首先构建小鼠酒精肝模型，将12周雌性C57BL/6小鼠(购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)随机分为空白对照组、损伤模型组和药物干预组，每组6只。空白对照组的小鼠喂养专门的液体对照饲料(购于南通特洛菲饲料科技有限公司，TP4030C)，并每天灌胃生理盐水做空白对照，共喂养15天，最后一天给予麦芽糊精溶液灌胃后9h牺牲小鼠；损伤模型组的小鼠喂养专门的液体酒精饲料(购于南通特洛菲饲料科技有限公司，TP4030D)，并每天灌胃生理盐水做空白对照，共喂养15天，最后一天给予5％的乙醇溶液灌胃后9h牺牲小鼠；药物干预组的小鼠喂养专门的酒精肝酒精饲料，并每天灌胃实施例1中的东北刺人参提取物(100mg/kg)，共喂养15天，最后一天给予5％的乙醇溶液灌胃后9h牺牲小鼠。牺牲小鼠后，留存血清和肝脏样本用于后续实验。

使用商用试剂盒检测血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量，确定东北刺人参提取物在酒精肝模型中肝脏损伤变化。

使用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa)从小鼠肝脏中提取总RNA，使用Prime ScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)去除基因组DNA和反转录得到cDNA产物，之后设计Keap1-Nrf2信号通路相关基因Keap1、Hmox1和Gclc的引物，使用TB Green

所使用的引物模板为：

Keap1-F：TGCCCCTGTGGTCAAAGTG

Keap1-R：GGTTCGGTTACCGTCCTGC

Hmox1-F：AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA

Hmox1-R：GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA

Gclc-F：GGGGTGACGAGGTGGAGTA

Gclc-R：GTTGGGGTTTGTCCTCTCCC

Acsl4-F：CTCACCATTATATTGCTGCCTGT

Acsl4-R：TCTCTTTGCCATAGCGTTTTTCT

Ptgs2-F：TGAGCAACTATTCCAAACCAGC

Ptgs2-R：GCACGTAGTCTTCGATCACTATC

实验结果

(1)与绿原酸和异绿原酸A的标准品进行对照，发现东北刺人参不定根提取物(50％乙醇洗脱组分样品)的绿原酸含量和异绿原酸A含量较高，结果发现东北刺人参不定根提取物的提取率为32.4％，其中绿原酸含量为125.3mg/g，异绿原酸A含量为30.1mg/g(图1)。

(2)在酒精肝模型中，不定根提取物处理组的小鼠血清中的谷丙转氨酶含量和谷草转氨酶含量均显著低于酒精损伤组(图2)。小鼠肝脏病理结果也同样展示了酒精肝损伤的结果，经过酒精处理后的小鼠肝脏出现明显的气泡样的肝细胞脂肪变性现象，而不定根提取物处理后，脂肪变性现象有所缓解，炎性浸润现象也显著减少(图3)。说明不定根处理后会降低小鼠肝脏损伤，保护肝脏，减少脂质积累。

(3)在小鼠酒精肝实验结果中，与酒精损伤组相比，不定根提取物处理组的小鼠肝脏中的Keap1-Nrf2信号通路相关基因(Keap1、Hmox1和Gclc)表达水平显著降低(图4)。说明不定根提取物会通过调控Keap1-Nrf2信号通路减少酒精对小鼠肝脏造成的氧化应激，减轻肝损伤。

(4)在RT-PCR实验结果中，与酒精损伤相比，不定根提取物处理组的小鼠肝脏的铁死亡信号通路相关基因(Acsl4和Ptgs2)显著被抑制(图5)。说明不定根提取物会通过抑制肝脏细胞的铁死亡，减轻脂质积聚，减轻肝脏损伤。

本发明制备的东北刺人参不定根提取物可以降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是临床上检验肝功能常用的参考指标，一般情况下，肝脏受到损伤后，血清中的转氨酶含量显著升高，而在不定根提取物处理后，转氨酶水平显著低于酒精损伤组，说明不定根提取物可以减轻肝脏的损伤，保护肝脏；在肝脏病理的结果中可以直观的发现酒精损伤引起的炎性反应和大泡性或大泡性为主伴小泡性的混合性肝细胞脂肪变性，而在不定根提取物处理后，气泡性现象和炎性浸润均有所减少，说明不定根可以有效改善酒精肝的损伤情况。

进一步的对不定根提取物改善酒精性肝损伤的机制进行的研究，关于酒精引起的肝脏损伤机制研究目前有很多方向，其中酒精摄入之后会影响肝脏Ⅱ相代谢酶(例如CYP2E1等)的正常活性及抗氧化蛋白酶(例如过氧化氢酶和过氧化物酶等)的活性引起氧化应激反应，肝脏Ⅱ相代谢酶及抗氧化蛋白酶均为Keap-Nrf2信号通路的下游蛋白酶，所以对小鼠肝脏中的Keap1-Nrf2的相关基因表达进行检测。结果发现，酒精处理之后肝脏中的Keap1、Hmox1和Gclc表达水平均显著升高，而在不定根提取物处理后相关基因表达显著下降，说明不定根提取物可以通过调控Keap1-Nrf2信号通路减少酒精引起的肝脏氧化应激反应，保护肝脏。

此外，铁死亡相关的基因和途径已被证实与肝脏疾病有关，肝脏受到酒精伤害后，代谢功能紊乱会导致肝脏中的脂质积聚，其中的原因也包括肝脏中铁死亡的发生。为了验证不定根提取物能否调控铁死亡相关途径，我们进一步检测了铁死亡相关基因的表达情况。结果如图5所示，经过不定根提取物处理后，铁死亡相关基因Acsl4和Ptgs2的表达显著降低，证明东北刺人参不定根提取物可以通过抑制铁死亡的发生达到减轻脂质积聚，减轻酒精引起的肝损伤的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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