一种同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的试剂盒，所述引物组、探针组及试剂盒可实现一次反应同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA，是目前少见的同时检测两种衣原体的试剂盒，效率高、特异性强，为临床检验提供辅助诊断的依据；通过本技术方案的公开，可以为非典型性病原体的鉴别诊断提供新的手段。

说明书

技术领域

本发明属于病原微生物分子生物学领域，具体涉及一种同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的试剂盒及其应用。

背景技术

衣原体(chlamydia)是一组极小的，非运动性的，专在细胞内生长的微生物。衣原体可分为4种，即肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体和牛衣原体。衣原体为革兰阴性病原体，是一类能通过细菌滤器、在细胞内寄生、有独特发育周期的原核细胞性微生物。衣原体是一种比细菌小但比病毒大的生物，是专性细胞内寄生的、近似细菌与病毒的病原体，具有两相生活环。它没有合成高能化合物ATP、GTP的能力，必须由宿主细胞提供，因而成为能量寄生物，多呈球状、堆状，有细胞壁，有细胞膜，属原核细胞，一般寄生在动物细胞内。目前区分为沙眼、肺炎、鹦鹉与家畜等四种衣原体。

肺炎衣原体是一种病原体，该病原体引起非典型性肺炎，同时还可导致支气管炎、咽炎、鼻窦炎、中耳炎、虹膜炎、心肌炎、心内膜炎、脑膜炎、结节性红斑等疾病，也是艾滋病、白血病的激发感染的重要病原菌之一。另外流行病学和病原学研究认为，肺炎衣原体感染与心血管疾病也有一定的相关性，其中最常见的为肺炎衣原体引起的呼吸道感染。临床表现多不典型，通常以咽痛和声音嘶哑起病，数日至七天后可出现咳嗽，同时还可伴有低热，白细胞计数大多正常，血沉增快，胸片可显示单侧节段性肺炎，甚至病变广泛者可波及双肺也可伴有胸膜炎或胸腔积液。

沙眼衣原体除可导致沙眼外，还是公认的性传播疾病的传染源之一。在非淋菌性尿道炎中，几乎一半是由沙眼衣原体传染造成的。它还可以引起尿道综合征和性病性淋巴肉芽肿、男性尿道炎、附睾炎、女性不育、子宫颈炎、盆腔炎等。新生儿通过产道感染可引起新生儿眼炎或新生儿肺炎。沙眼衣原体还可引起成人肺炎，对孕妇危害也较大，可造成宫外孕、流产、死胎、绒毛膜羊膜炎、早产等。

多年来，世界各地的医院及实验室均常规使用病原体分离培养法、免疫学检查等方法对衣原体进行检测，但这些检测方法都存在许多难以克服的缺陷。传统的衣原体分离方法操作步骤繁琐，条件要求较高，检测周期长，实验安全性和结果准确性相对难以保证；免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验，该法具有直观、技术成熟、特异性好的优点，但耗时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值。

近年来，分子生物学技术如实时荧光PCR技术等的引入，很大程度上改善了检测和鉴定病原体的现状。特别是多重荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR技术基础上发展出的多重联检，能够在同一个反应管中实现多个基因序列的扩增和特异性检测，在临床应用中，可同时检测并区分沙眼衣原体和肺炎衣原体，有利于精确判断病情，实现疾病的早期、快速、精准治疗。多重PCR技术的成功实施需要解决以下几个关键技术问题：(1)由于需要使用多组引物/探针组合，设计时需要避免不同引物/探针之间互相产生交联。(2)避免每组引物/探针对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性结果。(3)每种扩增子的最佳扩增条件不同，需要优化反应条件，保证在单一扩增条件下各扩增子都能成功扩增。(4)需要有内对照作为参考以排除来自核酸提取等方面的干扰。

目前市面上可同时检测并区分沙眼衣原体和肺炎衣原体的PCR法检测的产品，需要使用3对引物探针组进行检测以及保证检测准确性和特异性，本发明仅使用一对引物探针组便可实现肺炎衣原体和沙眼衣原体的检测，简化操作、节约成本的同时也保证了检测准确性和特异性。

发明内容

为解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种引物探针组，即肺炎衣原体和沙眼衣原体标志物的引物及探针，该引物探针组可以同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA。

本发明的第二个目的是提供一种可以同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的试剂盒；以缓解现有技术中存在的对衣原体的检测特异性不强的技术问题。

本发明的第三个目的是提供上述可以同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的引物探针组在检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA试剂盒中的应用。

本发明提供的引物探针组合在制备用于检测肺炎衣原体和沙眼衣原体试剂盒中的应用，可以缓解现有技术中存在的对衣原体诊断研究尚有不足的技术问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种引物探针组，所述引物探针组用于同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA，包含可以同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的引物探针组；

其中，肺炎衣原体和沙眼衣原体的引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，肺炎衣原体和沙眼衣原体的探针序列如SEQ IDNO.3所示。

进一步地，所述引物探针组还包括管家基因(IC)(BH)引物对和探针，管家基因(IC)(BH)引物对包括序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物，探针序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述肺炎衣原体和沙眼衣原体探针的5’端标记有FAM发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；管家基因探针的5’端标记有CY5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。

本发明还提供了一种同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的试剂盒，包括上述的引物探针组、缓冲液、dNTPs、MgCl

进一步地，所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。引物指肺炎衣原体和沙眼衣原体的引物对和管家基因引物对；探针指肺炎衣原体和沙眼衣原体的探针和管家基因探针。

进一步地，所述的试剂盒的检测样本为咽拭子。

本发明还提供了如上所述的引物探针组在同时检测肺炎衣原体和沙眼衣原体DNA的试剂盒中的应用。

本发明的有益效果为：

1.本发明所使用探针为沙眼衣原体和肺炎衣原体共通区段，特异性较高。

2.本发明只使用一种探针，相比传统衣原体检测试剂盒，减少了试剂盒的组分，简化操作，节约成本。

3.本发明具有灵敏度高、特异性好等优点，能够有效避免出现假阳性、假阴性等问题。

附图说明

图1为引物探针组性能验证回算肺炎衣原体标准曲线图；

图2为引物探针组性能验证回算沙眼衣原体标准曲线图；

图3为肺炎衣原体经试剂盒提取后的QPCR扩增曲线图；

图4为沙眼衣原体经试剂盒提取后的QPCR扩增曲线图；

图5为特异性实验QPCR扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

该试剂盒由引物探针混合液、RT-PCR buffer、混合酶液、阳性质控品和无RNase水组成；RT-PCR buffer包括PCR缓冲液、dATP、dUTP、dCTP、dGTP和MgCl

肺炎衣原体和沙眼衣原体引物对包括序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，肺炎衣原体和沙眼衣原体探针序列如SEQ ID NO.3所示。

管家基因(IC)(BH)引物对包括序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和序列如SEQID NO.5所示的下游引物，管家基因探针序列如SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.1：5’ATTTCCGATTGCAATATGGAAGAAG 3’；

SEQ ID NO.2：5’CTGTGCTGATGCGTCTCAAAGA 3’；

SEQ ID NO.3：5’FAM-CGTTTTGATGTCAATGTCTCCGTACGC-BHQ1 3’；

SEQ ID NO.4：5’TCTGGCACCACACCTTCTACAA 3’；

SEQ ID NO.5：5’GGATAGCACAGCCTGGATAGCA 3’；

SEQ ID NO.6：5’FAM-AGGAGCACCCCGTGCTGCTGAC-BHQ2 3’。

所述引物在扩增体系中的终浓度为100-1000nM；所述探针在扩增体系中的终浓度为50-500nM。

该试剂盒的反应体系为30μL，具体为：核酸模板7μL、RT-PCR buffer20μL、混合酶液1μL和引物探针混合液2μL。

试剂盒的操作和结果判定

(1)将样品提取模板、无RNase水、阳性质控品各7μL分别加入不同的PCR反应管中，并向各管中加入RT-PCR buffer 20μL、Hot Start Taq酶1μL和引物探针混合液2μL，配成体系，盖好管盖，放入荧光定量PCR仪中进行荧光PCR检测。

(2)设置仪器中的PCR扩增反应的条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s；60℃退火30s；40个循环。

(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和Ct值对检测结果进行分析。

(4)有效性判定：

无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤38，否则实验视为无效；

(5)结果判读：

样本检测孔Ct值为Undet或40，该样本结果判断为阴性，样本DNA/RNA提取失败、待测样本中不含DNA/RNA或含量低于检测限；

样本检测孔Ct值≤38，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测孔Ct值为38-40，需要复检一次，如果Ct值仍为38-40，则判断为阴性。

引物探针性能验证：

分别检测肺炎衣原体及沙眼衣原体阳性样本，将样本5倍梯度稀释5个浓度；

浓度分别为1×10

肺炎衣原体扩增效率可达84.38％，沙眼衣原体扩增效率可达94.19％；

扩增效率计算公式为：扩增效率＝(10^(-1/K)-1)*100％，其中K为图1、2中斜率。

实验后回算标准曲线图见图1、2。

根据图1、2可知引物探针的标准曲线R

灵敏度验证：

本试剂盒检测灵敏度高，可检测出1×10

特异性验证：

分别检测6份衣原体阴性样本(另外一种病毒阳性结果)，实验结果表明本试剂盒对于沙眼衣原体和肺炎衣原体的检测特异性强，不与其他病原体的核酸发生交叉反应，检测6份临床常见的样本，结果见图5。

表1为灵敏度验证实验的数据统计汇总，由此实验可看出本试剂盒的检测下限能够达到5×10

表2为特异性验证实验的数据统计汇总，由此实验可看出本试剂盒特异性很好。

表1灵敏度

表2特异性

需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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