一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法

摘要

本发明公开了一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，包括以下步骤：构建亚细胞定位载体pCAMBIA2300‑GFP和其重组载体，将亚细胞定位载体pCAMBIA2300‑GFP和其重组载体、辅助质粒P19分别转入三株EHA105农杆菌菌株中；摇菌；悬浮；抽真空侵染；叶片培养；荧光观察。本发明建立了一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，具有周期短、成本低、易操作、不受基因型限制等优点，能够快速高效地将外源基因在百合叶片中瞬时表达，为百合基因功能研究提供了重要的技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于生物信息技术领域，具体涉及一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法。

背景技术

亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。蛋白质作为基因功能的主要执行者，需要在正确的亚细胞区隔中定位方可正常发挥功能，以维持生物体内多种复杂的生化过程有序高效进行。因此，蛋白质的亚细胞定位与其功能密切相关，是研究蛋白质生物学功能的基础，对功能基因组学和蛋白质组学具有重要的意义。

目前，研究植物蛋白质亚细胞定位的方法主要有：融合报告基因定位法、免疫组织化学定位法，共分离标记酶辅助定位法，蛋白质组学定位法和生物信息学预测定位。其中融合报告基因定位法因其容易操作，试验周期相对较短，可以应用于活体的实时定位和动态研究等特点在植物蛋白质亚细胞定位中广泛应用。融合报告基因定位是将目的蛋白基因与易于检测的报告基因进行融合，构建融合表达载体，表达融合蛋白，然后借助报告基因表达产物的特征来定位目的蛋白。目前，报告基因就其表达产物而言，以绿色荧光蛋白(GFP)的应用最为广泛。

百合是百合科百合属多年生鳞茎类球根花卉，其花型花色多样，具有极高的观赏、食用和药用价值，被誉为“球根花卉之王”。目前，百合上关于基因功能研究中，亚细胞定位多采用农杆菌侵染烟草叶片、拟南芥原生质体及基因枪轰击洋葱表皮等方法，未建立百合自身的亚细胞定位体系。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提出一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

提供一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，包括以下步骤：

S1、构建亚细胞定位载体pCAMBIA2300-GFP和其重组载体，将亚细胞定位载体pCAMBIA2300-GFP和其重组载体、辅助质粒P19分别转入三株EHA105农杆菌菌株中；

S2、分别挑取转入载体/质粒后的单菌株加入三个1mL含50mg/Lkan和25mg/Lrif的YEB液体培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养；以农杆菌菌液与YEB液体培养基体积比1：100的比例，将过夜培养后的农杆菌菌液加入20mL含50mg/L kan和25mg/L rif的YEB液体培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养；

S3、将经过两次过夜培养后的三个YEB液体培养基中的农杆菌菌液经3000rpm离心5min后去上清，分别以侵染液进行悬浮，将载体菌液与辅助质粒菌液以1：1混合，28℃黑暗孵育2-4h，得到孵育好的侵染液；

S4、取百合茎尖处幼嫩叶片，取合适大小的纱布，叶片底部放一块干净的鹅卵石，将叶片和鹅卵石包裹起来，放入50mL烧杯中，加入孵育好的侵染液；抽真空，之后将叶片置于无菌水中清洗3-4次；

S5、培养皿中垫入5张滤纸，以10％的蔗糖溶液浸湿，将清洗后的百合叶片正面朝上摆入培养皿中，并以10％的蔗糖溶液喷施；22℃黑暗培养1d，见光培养1-2d；将叶片放入青霉素小瓶中，加入10μg/mL的DAPI溶液，用注射器进行抽气，直至叶片沉入瓶底，于37℃黑暗孵育20min，1×PBS清洗4-5次；

S6、用镊子轻轻刮去百合叶片叶肉组织，获得叶片下表皮，将其制片后在激光共聚焦显微镜下，分别以488nm和340nm激发波长观察GFP和DAPI信号。

进一步地：S1中，将辅助质粒P19转入EHA105农杆菌菌株的具体步骤为：

S1-1、取2μL辅助质粒P19，加到50μL冰水混合状态的EHA105农杆菌菌株的感受态细胞中，冰上静置30min；

S1-2、于液氮中速冻2min，转入37℃水浴锅中进行热激5min；

S1-3、热激后加入700μL无抗YEB液体培养基中，于28℃摇床200rpm复苏3h；

S1-4、3000rpm离心2min，吸去600μL上清后吹打混匀，取100μL涂布于含50mg/Lkan和25mg/Lrif抗性的YEB平板上，28℃倒置培养2d。

进一步地：S3中，以含10mM MES的侵染液和含10mM MgCl

进一步地：S4中，以-80Kpa进行抽真空5min，放气5min，重复抽真空、放气3次。

本发明的有益效果为：

1.本发明建立了一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，具有周期短、成本低、易操作、不受基因型限制等优点，能够快速高效地将外源基因在百合叶片中瞬时表达，为百合基因功能研究提供了重要的技术支撑。

2.本发明改良叶片抽真空的方式，利用物理沉降使叶片完全浸没于侵染液中，并减少放气时间，能够确保所有叶片被充分侵染，极大提高了转化效率(接近100％)。此外，本发明转化周期短，转化后48h即可检测，更快速高效。

附图说明

图1为卷丹LlWOX9和LlWOX11的亚细胞定位图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例

一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，包括以下步骤：

(1)载体、质粒转入农杆菌

克隆卷丹珠芽形成基因LlWOX9和LlWOX11的全长序列，构建其重组载体pCAMBIA2300-LlWOX9-GFP和pCAMBIA2300-LlWOX11-GFP。将亚细胞定位空载体(pCAMBIA2300-GFP)、重组载体(pCAMBIA2300-LlWOX9-GFP和pCAMBIA2300-LlWOX11-GFP)和辅助质粒P19分别转入四株EHA105农杆菌菌株中。EHA105农杆菌菌株(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，货号：ZK294)。

具体地说，将pCAMBIA2300-GFP、pCAMBIA2300-LlWOX9-GFP、pCAMBIA2300-LlWOX11-GFP和辅助质粒P19分别转入EHA105农杆菌菌株的具体步骤如下：取2μL质粒，加到50μL冰水混合状态的EHA105感受态细胞中，冰上静置30min；之后于液氮中速冻2min，迅速转入37℃水浴锅中进行热激5min；热激后加入700μL无抗YEB液体培养基，于28℃摇床200rpm复苏3h；3000rpm离心2min，吸去600μL上清后吹打混匀，取100μL涂布于含50mg/Lkan和25mg/Lrif抗性的YEB平板上，28℃倒置培养2d。

(2)摇菌

分别挑取转入质粒/载体后的农杆菌单菌株加入四个1mL含50mg/Lkan和25mg/Lrif的YEB液体培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养。之后以农杆菌菌液与YEB液体培养基体积比1：100的比例，将过夜培养后的农杆菌菌液加入20mL含50mg/Lkan和25mg/Lrif的YEB液体培养基中，28℃摇床200rpm过夜培养。

(3)悬浮

将上述含空载体(pCAMBIA2300-GFP)、重组载体(pCAMBIA2300-LlWOX9-GFP和pCAMBIA2300-LlWOX11-GFP)和辅助质粒P19的农杆菌菌液经3000rpm离心5min后去上清，分别以侵染液(含10mM MES、10mM MgCl

(4)抽真空侵染

取百合茎尖处幼嫩叶片，取合适大小的纱布，叶片底部放一块干净的鹅卵石，将叶片并包裹起来(防止叶片漂浮)，放入50mL烧杯中，加入孵育好的侵染液。以-80Kpa进行抽真空5min，放气5min，重复抽真空、放气3次。之后将叶片置于无菌水中清洗3-4次。

(5)叶片培养

培养皿中垫入5张滤纸，以10％的蔗糖溶液浸湿，将清洗后的叶片正面朝上摆入培养皿中，并以10％的蔗糖溶液喷施。22℃黑暗培养1d，见光培养1-2d。将叶片放入青霉素小瓶中，加入10μg/mL的DAPI溶液，用注射器进行抽气，直至叶片沉入瓶底，于37℃黑暗孵育20min，1×PBS清洗4-5次。

(6)荧光观察

由于百合叶片较厚，可用镊子轻轻刮去叶肉组织，获得叶片下表皮。制片后在激光共聚焦显微镜下，分别以488nm和340nm激发波长观察GFP和DAPI信号。结果表明：LlWOX9和LlWOX11均为核定位。

参照图1，A-D：空载体pCAMBIA2300-GFP在卷丹叶片中瞬时表达，A：GFP荧光场、B：DAPI荧光场、C：明场、D：明场与荧光场叠加；E-H：载体pCAMBIA2300-LlWOX9-GFP在卷丹叶片瞬时表达，E：GFP荧光场、F：DAPI荧光场、G：明场、H：明场与荧光场叠加；I-L：载体pCAMBIA2300-LlWOX11-GFP在卷丹叶片瞬时表达，I：GFP荧光场、J：DAPI荧光场、K：明场、L：明场与荧光场叠加

本发明建立了一种利用百合叶片检测亚细胞定位的方法，具有周期短、成本低、易操作、不受基因型限制等优点，能够快速高效地将外源基因在百合叶片中瞬时表达，为百合基因功能研究提供了重要的技术支撑。

本发明改良叶片抽真空的方式，利用物理沉降使叶片完全浸没于侵染液中，并减少放气时间，能够确保所有叶片被充分侵染，极大提高了转化效率(接近100％)。此外，本发明转化周期短，转化后48h即可检测，更快速高效。

于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。