一种控制油菜特异花序特征的基因、分子标记及应用

摘要

本发明为一种控制油菜特异花序特征的基因、分子标记及应用，属于油菜基因工程领域，具体涉及一种控制油菜株高和主花序长度等株型的基因、分子标记及其应用。本发明通过图位克隆的方法克隆了一个控制油菜株型的基因BnaA10.PA，该基因位于油菜基因组的A10染色体上，编码一个磷脂酰肌醇转移蛋白，其野生型等位基因序列如SEQ ID NO：1所示，突变的等位基因序列如SEQ ID NO：4所示，该突变体基因可以显著降低油菜株高以及主花序长度。本发明所述的BnaA10.PA突变等位基因在改良油菜品种(自交系)株型的同时，可以增加单株产量。本发明还开发出相关的分子标记引物V5和V8，可用于油菜株型改良过程中的辅助选择。

说明书

技术领域

本发明属于油菜基因工程领域，具体涉及一种控制油菜株高及主花序长度的基因、分子标记及应用。本发明中所述的基因BnaA10.PA位于油菜A10染色体上，控制着油菜株高及主花序长度等重要株型相关性状。本发明公开了 BnaA10.PA基因的图位克隆和油菜株型改良中的应用前景，本发明还涉及了基于该基因突变位点分子标记V5和V8的开发及应用。

背景技术

株高是作物重要的农艺性状之一，直接影响作物抗倒性和丰产潜力。因此，育种工作者十分重视株高基因的研究与利用。然而，杂种优势的广泛利用，促进了作物株高整体增加，其提高了倒伏的风险。倒伏不仅降低油菜产量及菜籽品质，而且不利于机械化收获而增加收获成本。株高过高不耐肥、易倒伏、不适宜机械化收获，严重影响产量和品质，倒伏后果粒数下降17.5％，种子产量、含油量下降10％～30％(最高达50％以上)，严重影响油菜产业规模化发展。因此，矮杆或半矮杆的甘蓝型油菜新材料、新品种选育已成为油菜育种工作者的重要育种目标。

近年来，研究者创制或发现了“10D130”“92I1096”“矮源1号”“B192”、“Ds-1和Ds-2”等10多份矮杆或半矮杆油菜突变材料，但存在植株过矮，或冬前长势弱、自交不亲和、病害严重、结实率低，生产力低等缺点，至今还没有理想的矮秆油菜品种在全国大面积推广应用。因此，创制具有株高中等、矮杆或半矮杆突变体新材料，是培育矮杆油菜品种的关键，也是目前油菜矮秆育种的重要技术瓶颈。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种从油菜突变体DW871中克隆的新基因BnaA10.PA，该基因编码一个磷脂酰肌醇转移蛋白。

为了解决上述技术瓶颈，本发明的目的在于提供一种同时调控油菜株高、主花序长度等株型的基因BnaA10.PA。该基因的野生型等位基因序列如SEQIDNo.1 所示，其CDS序列如SEQIDNo.2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如 SEQIDNo.3所示。该基因在突变体DW871中的突变等位基因序列如SEQIDNo.4 所示，其CDS序列如SEQIDNo.5所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如 SEQIDNo.6所示。

本发明另一个目的在于提供了一种基于BnaA10.PA基因设计的分子标记V5 和V8引物。针对野生型和突变的等位基因差异，设计基因标记引物，通过分子标记辅助选择的办法，可以方便准确的鉴定含有突变等位基因的油菜品系。

本发明的最后一个目的在于提供了一种调控油菜株高基因BnaA10.PA以及其分子标记引物在油菜株型遗传改良中的应用。其在降低油菜品种(自交系)的株高同时增加产量。

本发明的技术方案如下所述：

一、调控油菜株高基因DW871的图位克隆，其具体实施步骤如下所述：

(1)从配制的甘蓝型油菜隐性核不育三系杂交组合5824CA×5771RF1代发现1株矮杆突变株，经过4年自交纯化，育成甘蓝型油菜特异型矮杆直立株型材料DW871，该品系具有生长势强，育苗移栽平均株高139.1cm，直播株高 100.8cm；植株总叶数多、节间短、木质部较厚、分枝位低、株型紧凑、抗倒性特强等特点，是适宜机械化或轻简化种植的中矮杆甘蓝型油菜新种质，具有较高的利用价值和广阔的应用前景。

(2)以矮秆直立株型突变体DW871、高杆自交系G5663为父母本，通过构建正反交F

(3)在分离群体中分别取30个极端高杆单株和30个极端矮秆单株混成高杆池和矮杆池，提取混池DNA进行Illumina测序。通过ED方法关联分析将控制矮杆的基因BnaA10.PA定位于A10染色体11.00Mb～17.39Mb之间，总长度为 6.39Mb，共包含1,405个基因，其中非同义突变SNP位点的基因共201个。

(4)通过重测序数据在候选区段A10染色体11.00Mb～17.39Mb范围内开发了16个InDel标记(标记名称V1，V2……V16)，利用高矮秆Bulk检测这16 个InDel标记发现其均与高矮秆性状连锁；利用16个标记对一个包含138个单株的F2群体(2019-2020年，武汉)进行基因分型，结合株高表型，进一步将矮杆候选基因定位于V5和V8两个标记之间，对应参考基因组A10染色体 15.70～16.05Mb。同时标记V5和V8可作为株高基因BnaA10.PA的紧密连锁分子标记，用于分子标记辅助选择育种。

(5)测序发现矮秆突变体DW871只在候选区间内BnaA10g30290D基因内存在ACC碱基缺失，该突变导致其编码蛋白质的第21位氨基酸(T)缺失。该基因编码一个磷脂酰肌醇转移蛋白，在主要油菜茎秆中表达。野生型扩增的基因序列为SEQNo.1，其对应的CDS序列和蛋白质序列为SEQNo.2-3；突变体DW871 扩增出来的基因序列为SEQNo.4，其对应的CDS序列和蛋白质序列为 SEQNo.5-6。

二、基于BnaA10.PA基因连锁的分子标记制备，其具体实施步骤如下所述：

(1)通过重测序数据在候选区段A10染色体11.00Mb～17.39Mb范围内开发了16个InDel标记，标记命名V1，V2……V16，利用高矮秆Bulk检测这16个InDel标记发现其均与高矮秆性状连锁；其中V5和V8两个标记与目标基因紧密连锁。定位结果显示矮杆候选基因定位于V5和V8两个标记之间，对应参考基因组A10染色体15.70～16.05Mb。标记V5和V8引物核苷酸序列如下所示：

V5-F:TCCTAAACCGAACCTGTT(SEQIDNo.7)

V5-R:GCTGCCTCTCTGTCTGAATT(SEQIDNo.8)

V8-F:CGGTTTATGTATATCAGTTGTGG(SEQIDNo.9)

V8-R:TCAACAAATGACAACAACGTGA(SEQIDNo.10)

(2)用V5和V8引物扩增油菜品种、突变体DW871及高世代不同株高油菜个体的基因组DNA，对PCR产物通过PAGE电泳分析。结果表明V5和V8 引物记可以清晰的区分出野生、突变及杂合的等位基因型，均为共显性标记、并具有可靠和实用的特点。

三、利用BnaA10.PA基因以及其分子标记引物在油菜株型遗传改良中的应用，其具体实施步骤如下所述：

(1)以DW871为供体、高杆油菜为受体，通过回交转育、分子标记辅助选择已获得完全稳定的2个不同组合来源后代的共3个矮秆新品系，在育苗移栽，亩植8000株条件下，实测各品系的株高。

(2)结果显示回交转育后代株高降低明显，同时，不同来源与同一来源的不同品系之间均表现较大差异，3个品系群体的平均株高变幅达80.1～135.7m。初步证实该基因在油菜株型遗传改良中具有较大应用前景。

本发明的有益效果为：

(1)本发明在油菜中鉴定、克隆并验证了一个控制株高、主花序长度等株型的基因BnaA10.PA，该基因编码一个磷脂酰肌醇转移蛋白。

(2)该基因突变后导致油菜株高降低、分枝位低、株型紧凑、抗倒性特强等特点，为油菜株型改良提供了新的变异位点。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

序列表SEQIDNQ.1是本发明克隆的野生型BnaA10.PA的基因序列

序列表SEQIDNQ.2是本发明克隆的野生型BnaA10.PA的CDS序列

序列表SEQIDNQ.3是本发明克隆的野生型BnaA10.PA的氨基酸序列

序列表SEQIDNQ.4是本发明克隆的BnaA10.PA突变后的基因序列

序列表SEQIDNQ.5是本发明克隆的BnaA10.PA突变后的CDS序列

序列表SEQIDNQ.6是本发明克隆的BnaA10.PA突变后的氨基酸序列

序列表SEQIDNQ.7和SEQIDNQ.8是本发明制备的分子标记V5引物的核苷酸序列。

序列表SEQIDNQ.9和SEQIDNQ.10是本发明制备的分子标记V8引物的核苷酸序列。

附图说明

图1、本发明中矮秆突变体资源DW871的选育过程。

图2、矮秆突变体资源DW871和高杆油菜主花序及株高的的表型描述。

图中标记说明：a：DW871(左)与HW871(右)的花序差异；b：HW871(左) 与DW871(右)植株性状形态

图3、矮秆突变体DW871株高性状的遗传分析。

图中标记说明：左：矮秆突变体DW871、高杆G5663构建的F

图4、BnaA10.PA基因的BSA分析。

图5、BnaA10.PA基因的精细定位。

图6、BnaA10.PA基因紧密连锁的分子标记V5和V8的开发及检测。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施例，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：突变体DW871的选育及表型鉴定

(1)20世纪90年代，华中农业大学孟金陵老师用甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥杂交，育成新型甘蓝型油菜黄籽双低品系940。1994年，课题组从孟金陵老师处获得该新品系，并与中双2号、湘油13进行复合杂交育成“5771R”；2007年，用自有隐性核不育系5824A为母本，与5771R杂交配制形成隐性核不育三系杂交新组合ZH117；2008年，从ZH117群体中发现1株矮杆紧凑株型的突变株，后经过4代自交纯合，于2012年育成较为稳定遗传的甘蓝型油菜矮杆新材料，命名为“DW871”(图1)。

(2)在贵州省思南县塘头镇贵州省农科院油菜所试验地种植矮杆油菜 DW871、和不同高杆油菜品系用于观察表型。每年每个材料3个重复，每重复 10行，每行16株(双株留苗)，行距0.40m，株距0.33m。育苗移栽实验中，高杆品系HW871株高达207.80cm，而矮杆油菜DW871株高平均值为139.10cm(图 2)。直播试验中矮秆油菜DW871株高平均为100.80cm。矮杆油菜DW871具有植株总叶数多，节间短，木质部较厚，抗倒性特强，分枝位低，株型紧凑，一次有效枝多，果枝挺直，着果密度达1.8cm以上，丰产性与同源高杆系相当。收获指数达0.37，较同源高杆系提高0.10。株高的降低主要是由于分枝位降低，节间距和主花序长度减小等因素导致的。

实施例2：株高基因BnaA10.PA的图位克隆

(1)将突变体DW871(株高100.80cm)与具有正常株高的油菜品系G5663 (株高189.50cm)正反交获得F

结果显示，F

(2)在分离群体中分别取30个极端高杆单株和30个极端矮秆单株混成高杆池和矮杆池，提取混池DNA进行Illumina测序。通过ED方法关联分析将控制矮杆的基因BnaA10.PA定位于A10染色体11.00Mb～17.39Mb之间(图4)，总长度为6.39Mb，共包含1,405个基因，其中非同义突变SNP位点的基因共201 个。

通过重测序数据在候选区段A10染色体11.00Mb～17.39Mb范围内开发了16 个InDel标记(标记名称V1，V2……V16)，利用高矮秆Bulk检测这16个InDel 标记发现其均与高矮秆性状连锁；利用16个标记对一个包含138个单株的F2 群体(2019-2020年，武汉)进行基因分型，结合株高表型，进一步将矮杆候选基因定位于V5和V8两个标记之间(图5)，对应参考基因组A10染色体 15.70～16.05Mb。同时标记V5和V8可作为株高基因BnaA10.PA的紧密连锁分子标记，用于分子标记辅助选择育种。

(3)测序发现矮秆突变体DW871只在候选区间内BnaA10g30290D基因内存在ACC碱基缺失，该突变导致其编码蛋白质的第21位氨基酸(T)缺失。该基因编码一个磷脂酰肌醇转移蛋白，在主要油菜茎秆中表达。野生型扩增的基因序列为SEQNo.1，其对应的CDS序列和蛋白质序列为SEQNo.2-3；突变体DW871 扩增出来的基因序列为SEQNo.4，其对应的CDS序列和蛋白质序列为SEQNo.5-6。

实施例3：株高基因BnaA10.PA紧密连锁分子标记的开发及检测

(1)通过重测序数据在候选区段A10染色体11.00Mb～17.39Mb范围内开发了 16个InDel标记，标记命名V1，V2……V16，利用高矮秆Bulk检测这16个InDel标记发现其均与高矮秆性状连锁；其中V5和V8两个标记与目标基因紧密连锁。定位结果显示矮杆候选基因定位于V5和V8两个标记之间，对应参考基因组A10染色体15.70～16.05Mb。标记V5和V8引物核苷酸序列如下所示：

V5-F:TCCTAAACCGAACCTGTT(SEQIDNo.7)

V5-R:GCTGCCTCTCTGTCTGAATT(SEQIDNo.8)

V8-F:CGGTTTATGTATATCAGTTGTGG(SEQIDNo.9)

V8-R:TCAACAAATGACAACAACGTGA(SEQIDNo.10)

(2)标记V5和V8的检测方法如下：

首先进行PCR反应，20μlPCR体系包括：75ngDNA模板、2μl10×Taqbuffer、 1.6μlMgCl

(3)利用标记V5和V8对两个亲本DW871和G5663的基因组DNA进行基因型分析，结果表明该标记在两个亲本之间表现出很好的多态性(图6)。其中V5标记在高杆G5663中扩增出现较小片段、在矮秆DW871中扩增出现较大片段；V8标记在高杆G5663中扩增出现较大片段、在矮秆DW871中扩增出现较小片段，同时利用这两个标记对回交高世代群体中不同株高单株的基因组 DNA进行基因型分析，发现所有高株单株的带型与高杆油菜G5663的带型一致，矮株单株的带型或与矮秆DW871一致或为杂合(两条带)。该结果表明标记与株高完全共分离(图6)且均为共显性标记。因此，标记V5和V8可用于分子标记辅助改良油菜株型。

实施例4：基因BnaA10.PA以及连锁标记V5和V8在油菜株型改良中的应用

(1)以矮秆突变体DW871为供体、高杆油菜为受体，通过杂交、回交转育、分子标记辅助选择已获得完全稳定的2个不同组合来源后代的共3个矮秆新品系，在育苗移栽，亩植8000株条件下，实测各品系的株高如表1所示。

表1、回交选育的3个矮秆油菜新品系的株高表现。

表1

(2)结果显示回交转育后代株高降低明显，如将6R株高从201.6cm降至 126.2-135.7cm，将5711R的株高从189.50cm降至80.1cm。同时，不同来源与同一来源的不同品系之间均表现较大差异，3个品系群体的平均株高变幅达 80.1～135.7m。初步证实该基因在油菜株型遗传改良中具有较大应用前景。

序列表

<110> 贵州省农业科学院

<120> 一种控制油菜特异花序特征的基因、分子标记及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1010

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 1

atgtcgagaa tcgcgattct tcctcttctc ctcgtcttct caacgattgc acgagccacc 60

accgatgtcc aatactgtgg tacctttgac actcttccgt ctctcctttg tgacggctct 120

tgttgttgtt aaagtttgat tctttttagc ttttcacttg taattgattg tttcgtagtg 180

tcaaagtttc gatttttatt ttgttctggg gagctctctg ccttgatagt gtgatgtatt 240

tgttaattgc agaggagaat gcagagtatg aagtgaaagt gaaagaggtt aatatatcgc 300

ccaaccctat agctcgaggc gagccagcta cttttaccat ctctgccacc acaggttact 360

tcttttttac tttacattac tgtctgtaac tcttttactt ttttatattg ataccaatga 420

tggaaagatg tttcctttgt gatgataatg aatgtgttag ttatgataga gattagagag 480

agacaatgtg aatgcttctg aggttgtagc ttagcttctt actagattct caatgagtcc 540

gtttatgata tttgtttttt ttttaataaa gggcgtggga ttacgggtgg gaagctggtg 600

attgaagtta catactttgg atggcacatt cactccgaga ctcatgacct ttgctctgag 660

actacttgtc ctgttgaaac cggagatttc ttggttgcac attctcaagt tcttcctggt 720

tacactcctc ctgtaagttc tattcgcttt tgtggttcaa gctgttctgt ttgaagcatc 780

tcttgcaatc atagcggatg tcttaggctt agtttggtag tattgagcaa tacatagaga 840

gatattagat gacaagtttg aatgtgtgtg acaaagtcta ctcttttatt ttatctttat 900

agggttcata ctcgctgcaa atgaagatgc tggatgctca aaagaaggag ctaacgtgca 960

tcaaattctc catagacatt ggatccgtac catctgtggc cgacatgtag 1010

<210> 2

<211> 450

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 2

atgtcgagaa tcgcgattct tcctcttctc ctcgtcttct caacgattgc acgagccacc 60

accgatgtcc aatactgtga ggagaatgca gagtatgaag tgaaagtgaa agaggttaat 120

atatcgccca accctatagc tcgaggcgag ccagctactt ttaccatctc tgccaccaca 180

gggcgtggga ttacgggtgg gaagctggtg attgaagtta catactttgg atggcacatt 240

cactccgaga ctcatgacct ttgctctgag actacttgtc ctgttgaaac cggagatttc 300

ttggttgcac attctcaagt tcttcctggt tacactcctc ctggttcata ctcgctgcaa 360

atgaagatgc tggatgctca aaagaaggag ctaacgtgca tcaaattctc catagacatt 420

ggatccgtac catctgtggc cgacatgtag 450

<210> 3

<211> 149

<212> PRT

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 3

Met Ser Arg Ile Ala Ile Leu Pro Leu Leu Leu Val Phe Ser Thr Ile

1 5 10 15

Ala Arg Ala Thr Thr Asp Val Gln Tyr Cys Glu Glu Asn Ala Glu Tyr

20 25 30

Glu Val Lys Val Lys Glu Val Asn Ile Ser Pro Asn Pro Ile Ala Arg

35 40 45

Gly Glu Pro Ala Thr Phe Thr Ile Ser Ala Thr Thr Gly Arg Gly Ile

50 55 60

Thr Gly Gly Lys Leu Val Ile Glu Val Thr Tyr Phe Gly Trp His Ile

65 70 75 80

His Ser Glu Thr His Asp Leu Cys Ser Glu Thr Thr Cys Pro Val Glu

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Leu Val Ala His Ser Gln Val Leu Pro Gly Tyr Thr

100 105 110

Pro Pro Gly Ser Tyr Ser Leu Gln Met Lys Met Leu Asp Ala Gln Lys

115 120 125

Lys Glu Leu Thr Cys Ile Lys Phe Ser Ile Asp Ile Gly Ser Val Pro

130 135 140

Ser Val Ala Asp Met

145

<210> 4

<211> 1007

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 4

atgtcgagaa tcgcgattct tcctcttctc ctcgtcttct caacgattgc acgagccacc 60

gatgtccaat actgtggtac ctttgacact cttccgtctc tcctttgtga cggctcttgt 120

tgttgttaaa gtttgattct ttttagcttt tcacttgtaa ttgattgttt cgtagtgtca 180

aagtttcgat ttttattttg ttctggggag ctctctgcct tgatagtgtg atgtatttgt 240

taattgcaga ggagaatgca gagtatgaag tgaaagtgaa agaggttaat atatcgccca 300

accctatagc tcgaggcgag ccagctactt ttaccatctc tgccaccaca ggttacttct 360

tttttacttt acattactgt ctgtaactct tttacttttt tatattgata ccaatgatgg 420

aaagatgttt cctttgtgat gataatgaat gtgttagtta tgatagagat tagagagaga 480

caatgtgaat gcttctgagg ttgtagctta gcttcttact agattctcaa tgagtccgtt 540

tatgatattt gttttttttt taataaaggg cgtgggatta cgggtgggaa gctggtgatt 600

gaagttacat actttggatg gcacattcac tccgagactc atgacctttg ctctgagact 660

acttgtcctg ttgaaaccgg agatttcttg gttgcacatt ctcaagttct tcctggttac 720

actcctcctg taagttctat tcgcttttgt ggttcaagct gttctgtttg aagcatctct 780

tgcaatcata gcggatgtct taggcttagt ttggtagtat tgagcaatac atagagagat 840

attagatgac aagtttgaat gtgtgtgaca aagtctactc ttttatttta tctttatagg 900

gttcatactc gctgcaaatg aagatgctgg atgctcaaaa gaaggagcta acgtgcatca 960

aattctccat agacattgga tccgtaccat ctgtggccga catgtag 1007

<210> 5

<211> 447

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 5

atgtcgagaa tcgcgattct tcctcttctc ctcgtcttct caacgattgc acgagccacc 60

gatgtccaat actgtgagga gaatgcagag tatgaagtga aagtgaaaga ggttaatata 120

tcgcccaacc ctatagctcg aggcgagcca gctactttta ccatctctgc caccacaggg 180

cgtgggatta cgggtgggaa gctggtgatt gaagttacat actttggatg gcacattcac 240

tccgagactc atgacctttg ctctgagact acttgtcctg ttgaaaccgg agatttcttg 300

gttgcacatt ctcaagttct tcctggttac actcctcctg gttcatactc gctgcaaatg 360

aagatgctgg atgctcaaaa gaaggagcta acgtgcatca aattctccat agacattgga 420

tccgtaccat ctgtggccga catgtag 447

<210> 6

<211> 148

<212> PRT

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 6

Met Ser Arg Ile Ala Ile Leu Pro Leu Leu Leu Val Phe Ser Thr Ile

1 5 10 15

Ala Arg Ala Thr Asp Val Gln Tyr Cys Glu Glu Asn Ala Glu Tyr Glu

20 25 30

Val Lys Val Lys Glu Val Asn Ile Ser Pro Asn Pro Ile Ala Arg Gly

35 40 45

Glu Pro Ala Thr Phe Thr Ile Ser Ala Thr Thr Gly Arg Gly Ile Thr

50 55 60

Gly Gly Lys Leu Val Ile Glu Val Thr Tyr Phe Gly Trp His Ile His

65 70 75 80

Ser Glu Thr His Asp Leu Cys Ser Glu Thr Thr Cys Pro Val Glu Thr

85 90 95

Gly Asp Phe Leu Val Ala His Ser Gln Val Leu Pro Gly Tyr Thr Pro

100 105 110

Pro Gly Ser Tyr Ser Leu Gln Met Lys Met Leu Asp Ala Gln Lys Lys

115 120 125

Glu Leu Thr Cys Ile Lys Phe Ser Ile Asp Ile Gly Ser Val Pro Ser

130 135 140

Val Ala Asp Met

145

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 7

tcctaaaccg aacctgtt 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 8

gctgcctctc tgtctgaatt 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 9

cggtttatgt atatcagttg tgg 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica campestris L)

<400> 10

tcaacaaatg acaacaacgt ga 22