Ambra1在乳腺癌化疗药物紫杉醇研制中的应用

摘要

本发明公开了Ambra1在乳腺癌化疗药物紫杉醇研制中的应用，提出了Ambra1蛋白在乳腺癌MDA‑MB‑231和MCF‑7细胞中的作用机制，并提供了Ambra1与化疗药物紫杉醇敏感性的相关性；最终将Ambra1应用于紫杉醇化疗药物研制中，提高乳腺癌MDA‑MB‑231和MCF‑7细胞药物敏感性，增强化疗疗效。

说明书

技术领域

本发明属于药物研制技术领域，具体涉及Ambra1降低乳腺癌细胞敏感性在紫杉醇化疗药物研制中的应用。

背景技术

化疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分，但约40％可手术和80％不可手术的患者对化疗药物并不敏感。影响化疗药物敏感性的因素众多，虽已取得重大进展，仍没有完全阐明。诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物抗肿瘤的主要机制，因此凋亡机制的破坏将影响细胞对化疗药物的敏感性。

紫杉醇(paclitaxel,PTX)是乳腺癌化疗最有效的药物之一，但乳腺癌细胞对PTX的敏感性将影响其疗效和患者预后；参与肿瘤细胞化疗敏感性调控的因素众多，相关机制仍没有完全阐明；Ambra1(Autophagy/Beclin 1regulator 1,Ambra1)是一种促自噬蛋白，同时参与凋亡的调控，是细胞凋亡和自噬相互转换的关键因子；该蛋白在乳腺癌中的表达明显增高，能够通过抑制凋亡降低乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性；

目前，Ambra1调控凋亡的机制尚未完全阐明，研究Ambra1调控乳腺癌细胞的凋亡机制，以及与乳腺癌细胞化疗药物PTX敏感性的相关机制，有助于在乳腺癌化疗药物的研制中提供新的途径和思路。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出了Ambra1蛋白在乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中的作用机制，并提供了Ambra1与化疗药物PTX敏感性的相关性；最终将Ambra1应用于紫杉醇化疗药物研制中，提高乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞药物敏感性，增强化疗疗效；

为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

Ambra1在乳腺癌化疗药物—紫杉醇制备研制中的应用；

优选的，所述Ambra1在乳腺癌中呈现高表达，抑制乳腺癌细胞凋亡，降低乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性；通过降低Ambra1在乳腺癌中的表达，提高乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性；

优选的，所述Ambra1通过Akt/pAkt磷酸化Bad抑制PTX诱导的乳腺癌细胞凋亡，从而降低乳腺癌细胞对PTX的敏感性；

优选的，所述乳腺癌细胞为MDA-MB-231和MCF-7。

本发明的有益效果是：

通过本发明提供的Ambra1蛋白在乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中的作用机制以及Ambra1与化疗药物PTX敏感性的相关性；将其应用于乳腺癌化疗药物PTX的制备研制中，提高乳腺癌细胞对PTX的敏感性，增强化疗疗效；为化疗药物紫杉醇药物研制的药性提升提供新的途径和思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的蛋白质印迹法检测MCF-7和MDA-MB-231细胞中Ambra1蛋白表达水平(A)，CCK-8法和FCM法检测MCF-7和MDA-MB-231细胞存活率(B)和凋亡(C)；

图2是本发明的蛋白质印迹法检测MCF-7和MDA-MB-231细胞中Akt、pAkt(A)和Bad、pBad

图3是本发明的蛋白质印迹法检测MCF-7和MDA-MB-231细胞中Akt、pAkt、Bad和pBad

图4是本发明的CCK-8法和FCM法检测MCF-7和MDA-MB-231细胞存活率(A)和凋亡率(B)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

Ambra1在乳腺癌化疗药物—紫杉醇制备研制中的应用；

优选的，所述Ambra1在乳腺癌中呈现高表达，抑制乳腺癌细胞凋亡，降低乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性；通过降低Ambra1在乳腺癌中的表达，提高乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性；

优选的，所述Ambra1通过Akt/pAkt磷酸化Bad抑制PTX诱导的乳腺癌细胞凋亡，从而降低乳腺癌细胞对PTX的敏感性；

优选的，所述乳腺癌细胞为MDA-MB-231和MCF-7。

实施例2

1.1、实验细胞、试剂、仪器

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；

DMEM和L15培养液购自美国HyClone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；PTX购自美国百时美施贵宝制药公司；GSK690693(GSK)购自美国MCE公司；Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔抗人Akt多克隆抗体和兔抗人pAkt单克隆抗体均购自英国Abcam公司；兔抗人Ambra1多克隆抗体，小鼠抗人Bad单克隆抗体，小鼠抗人pBad

XDS-100倒置相差显微镜为上海蔡康光学仪器有限公司产品；3110型细胞培养箱及Multiskan

1.2、慢病毒Ambra1表达载体(OE)瞬时感染MDA-MB-231和MCF-7细胞

MDA-MB-231细胞培养于L15培养液中，MCF-7细胞培养于DMEM培养液中，2种培养液内均加入10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；置于恒温37℃，CO

将5×10

1.3、CCK-8法检测Ambra1高表达对MDA-MB-231和MCF-7细胞存活率的影响

收集对数生长期的MDA-MB-231和MCF-7细胞或已感染OE或Empty的细胞，接种于96孔板(n＝5×103/孔)，培养48h后，各组分别给予或不给予3.0nM的PTX，避光培养24h。每组设置5个复孔，以不加PTX的作为对照组，只加培养液的作为空白对照。各组细胞换液，轻轻吸弃原培养基，加入100μl培养液-CCK8混合液(90μl无血清培养基+10μl CCK8溶液)，37℃避光孵育1h。酶标仪波长450nm处检测各组OD值，并计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝[(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)]×100％。

1.4、FCM法检测Ambra1高表达对MDA-MB-231和MCF-7细胞凋亡的影响

Annexin V-PE/7-AAD试剂盒测细胞凋亡。收集对数生长期的MDA-MB-231和MCF-7细胞或已感染OE或Empty的细胞，接种于6孔板(n＝5×105/孔)，培养48h后，各组分别给予或不给予3.0nM的PTX，避光培养24h。每组设置3个复孔。随后，按照试剂盒说明，特定时间胰酶消化细胞，Annexin V-PE和7-AAD染色细胞，FCM法检测细胞凋亡。

1.5、蛋白质印迹法检测细胞内Ambra1蛋白表达

收集对数生长期的感染了OE或Empty的细胞，接种于6孔板(n＝5×105/孔)，培养48h后，加入蛋白裂解液后冰上放置30min，然后12000rpm 4℃离心10min，取上清液加入蛋白电泳上样缓存液，100℃沸水浴处理10min，冷却至室温后上样，上样量为每组10μL；12％SDS-PAGE分离蛋白，用湿电转移法将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，用含5％脱脂奶的TBST溶液室温封闭处理1h，分别加入一抗[兔抗人Ambra1多克隆抗体(体积稀释比例为1∶500)和小鼠抗人GAPDH(内参照)单克隆抗体(体积稀释比例为1∶2000)]置于摇床上4℃反应过夜，用1×TBST洗膜3次，5min/次，加入二抗[羊抗兔或羊抗小鼠IgG(体积稀释比例为1∶2000)]置于摇床上室温孵育1h；二抗孵育结束后，1×TBST洗膜3次，5min/次，最后进行电化学发光显影，用Image J软件分析蛋白条带灰度。以目的条带与内参照GAPDH条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达水平。

1.6、蛋白质印迹法检测Ambra1高表达对Akt、pAkt、Bad和pBads136蛋白表达的影响

收集对数生长期的感染了OE或Empty的细胞，接种于6孔板(n＝5×105/孔)，培养48h后，蛋白质印迹法分别检测Akt、pAkt、Bad和pBads136蛋白表达(实验流程及方法同1.5节)。加入一抗为兔抗人Akt多克隆抗体(体积稀释比例为1∶500)，兔抗人pAkt单克隆抗体(体积稀释比例为1∶1000)，小鼠抗人Bad单克隆抗体(体积稀释比例为1∶1000)，小鼠抗人pBads136单克隆抗体(体积稀释比例为1∶1000)。

1.7、qRT-PCR检测Ambra1高表达对AKT mRNA表达的影响

收集对数生长期的感染了OE或Empty的细胞，接种于6孔板(n＝5×105/孔)，培养48h后，qRT-PCR检测AKT mRNA。以TRIzol reagent(上海捷瑞生物工程有限公司)提取总RNA(按照试剂盒说明书操作)。Promega M-MLV试剂盒进行逆转录，随后进行qRT-PCR反应。反应条件为：95.0℃预变性10.0min；95.0℃变性10s，60.0℃退火20s。共40个循环。数据以2—△△Ct进行计算。引物序列AKT，F：TCTTTGCCGGTATCGTGT，R：TGTCATCTTGGTCAGGTGGT；GAPDH，F：TGACTTCAACAGCGACACCCA，R：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。以AKT mRNA表达量与内参GAPDHmRNA表达量的比值表示AKT mRNA相对表达量。

1.8、GSK690693(GSK)对Ambra1高表达引起的MDA-MB-231和MCF-7细胞Bad磷酸化及对PTX敏感性的影响

1.8.1、GSK对Akt、pAkt、Bad和pBads136蛋白表达的影响

收集对数生长期的MDA-MB-231和MCF-7细胞或已感染OE或Empty的相应细胞，分别接种于6孔板(n＝5×105/孔)，同时给予或不给予1.0nM的GSK处理48h后，蛋白质印迹法分别检测Akt、pAkt、Bad和pBads136蛋白表达(实验流程及方法同1.6节)；

1.8.2、GSK对细胞存活率和凋亡的影响

收集对数生长期的MDA-MB-231和MCF-7细胞或已感染OE或Empty的相应细胞，分别接种于96孔板(n＝5×103/孔)或6孔板(n＝5×105/孔)，同时给予或不给予1.0nM的GSK处理48h后，再被3.0nM的PTX处理24h，CCK-8法(96孔板)检测细胞存活率(实验流程及方法同1.3节)，FCM法(6孔板)检测细胞凋亡(实验流程及方法同1.4节)；

1.9、统计学方法

所有实验均独立重复3次，结果以

2、结果

2.1、Ambra1高表达降低乳腺癌细胞对PTX的敏感性

Ambra1在乳腺癌中的表达明显高于正常乳腺组织。为了研究Ambra1高表达对乳腺癌细胞化疗敏感性的影响，本研究中将Ambra1表达载体(OE)分别转入乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞，使Ambra1蛋白过表达。随后细胞再分别被3.0nM PTX处理24h后，CCK-8法和FCM法分别检测Ambra1高表达对细胞存活率和凋亡的影响。

蛋白质印迹法检测结果(图1A)显示，MCF-7和MDA-MB-231细胞转入OE 48h后，Ambra1蛋白表达明显增高。CCK-8法检测结果(图1B)显示，PTX+OE组细胞的存活率均明显高于PTX单独处理组(P值均＜0.05)。FCM法检测结果(图1C)显示，PTX+OE组细胞的凋亡均明显低于PTX单独处理组(P值均＜0.05)。因此，Ambra1的高表达抑制了PTX诱导的乳腺癌细胞的凋亡，从而降低了细胞对PTX的敏感性。

2.2、Ambra1高表达导致Akt/pAkt表达增加，并促使Bad磷酸化

为了探索Ambra1抑制PTX诱导的乳腺癌细胞凋亡的机制，我们检测了Ambra1对Akt/pAkt表达的影响。在OE或Empty转染MCF-7和MDA-MB-231细胞48h后，蛋白质印迹法检测结果(图2A)显示，Ambra1的高表达(OE)使得Akt和pAkt蛋白表达均明显增高(P值均＜0.05)。相应地，qRT-PCR结果(图2B)显示，OE也使得细胞内AKT基因的mRNA表达明显增高(P值均＜0.05)。因此，Ambra1的高表达促使Akt和pAkt的表达。

Bad是Akt/pAkt的靶蛋白，是一个促凋亡蛋白，但在ser136位点被pAkt磷酸化后Bad则发挥抗凋亡的作用。因此，我们采用蛋白质印迹法检测了Ambra1高表达(OE)是否也对Bad和pBad

2.3、Ambra1诱导的Bad磷酸化是pAkt依赖性的

为了进一步明确Ambra1高表达引起MCF-7和MDA-MB-231细胞内pBad

蛋白质印迹法结果(图3)显示，GSK对MCF-7和MDA-MB-231细胞内Akt及Bad表达均没有显著影响(P值均＞0.05)。但，GSK显著降低了OE所致的pAkt表达的增高(P值均＜0.05)。与此同时，GSK也显著降低了OE所致的pBad

2.4、Bad磷酸化在Ambra1调控乳腺癌细胞对PTX敏感性中具有重要作用

为了研究pBad

CCK-8结果(图4A)显示，与PTX+OE组相比，PTX+OE+GSK组细胞的存活率明显降低(P值均＜0.05)。FCM结果(图4B)显示，与PTX+OE组相比，PTX+OE+GSK组细胞的凋亡则明显增高(P值均＜0.05)。因此，GSK抑制pBad

3、结果分析

本发明中，我们通过Ambra1慢病毒表达载体(OE)使Ambra1蛋白在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中高表达。结果发现，Ambra1的高表达使PTX诱导的细胞凋亡明显减少，而细胞存活率则明显提高，细胞对药物的敏感性降低。同时，Ambra1的高表达引起细胞内的AKTmRNA明显升高，相应的Akt及pAkt蛋白表达也显著增高。伴随着pAkt的增高，细胞内Bad磷酸化也明显增加(pBad

综上，在乳腺癌细胞中Ambra1可以通过Akt/pAkt磷酸化Bad，抑制PTX诱导的细胞凋亡，从而降低细胞对药物的敏感性。因此，Ambra1可以作为乳腺癌治疗的一个潜在靶点。