一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球

摘要

本发明公开了一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球，属于蛋白制备领域。融合碳端的重组蛛丝蛋白由8个重复核心序列和碳端序列组成，重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。为了实现重组蛛丝蛋白的简易表达，本发明将该重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT克隆在载体pCold I上，实现了无需克隆甘氨酸‑tRNA的编码序列就能成功诱导表达了重组蛛丝蛋白，并提供了纯化载体pCold I上重组蛛丝蛋白的方法。本发明提供的基于重组蛛丝蛋白的载药微球，相比于现有的载药微球，毒性更小，载药率和释放率更高，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白制备技术领域，具体涉及一种重组蛛丝蛋白，特别是涉及一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球。

背景技术

蜘蛛种类繁多，达4万多种，广泛分布于世界各地。不同种类的蜘蛛分泌不同数量和种类的蛋白，有的种类的蜘蛛可产生多种蛋白质，如主壶腺蛛丝蛋白(major ampullatespidroin,MaSp)和次壶腺蛛丝蛋白(minor ampullate spidroin,MiSp)等。主壶腺蛛丝蛋白MaSp由两部分组成：MaSp1和MaSp2。蛛丝蛋白的肽链在组成和结构上存在共有的特征，即都有重复的GGX(甘氨酸区)、聚(A)/聚(GA)(聚丙氨酸)区、间隔区和非重复碳端和氮端，氮端的作用是抑制蛛丝蛋白溶液在未纺丝之前凝聚，而碳端的作用是影响蛛丝的存储状态和组装状态的切换，控制蛋白在离子溶液中的溶解性和纤维成形性，促进β-折叠的形成，进而影响蛋白的二级结构影响蛋白的纤维结构，因此碳端对蛋白的性能影响较大。目前的研究报道最多可表达MaSp1的4个重复序列融合碳端的蛋白，不能表达更多重复核心序列的蛋白。

蛛丝蛋白因其序列中含有多重复的GGX(甘氨酸区)和GPGXX(脯氨酸区)，多重复的重组蛛丝蛋白的表达非常依赖于宿主合成转运RNA的数量，因此在表达时对氨基酸G(甘氨酸)及其对应的tRNA(转运RNA)需求大量极大，但宿主合成甘氨酸和tRNA的资源有限，故而大大限制了目的蛋白在宿主中的表达，导致其表达量较低甚至不表达。文献显示在pET系列载体如pET28、pET32等能成功表达多重复核心序列的通用手段是：在克隆阶段引入可翻译甘氨酸-tRNA的序列，同时降低诱导温度和转速，让蛋白缓慢地表达。但其构建复杂，需要在多个载体中多次操作。同时，翻译转运tRNA会消耗培养基中的营养，导致诱导表达体积大，纯化难度大。此外，多重复的重组蛛丝蛋白的诱导表达依赖于甘氨酸-tRNA，因此，需要寻找一种能够简易表达的重组蛛丝蛋白。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球，解决现有重组蛛丝蛋白诱导表达复杂的问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种融合碳端的重组蛛丝蛋白，所述融合碳端的重组蛛丝蛋白由一个碳端序列和一个或多个核心序列组成，所述核心序列如SEQ.ID.NO.1所示，碳端序列如SEQ.ID.NO.2所示。

优选地，所述融合碳端的重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，由8个重复核心序列和1个碳端序列组成，编码所述融合碳端的重组蛛丝蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

本发明还公开了上述一种融合碳端的重组蛛丝蛋白的制备方法，具体步骤如下：对pET载体上的核心序列通过酶切和连接，将含有一个碳端序列的片段和含有一个或多个核心序列的片段连接并转移至pCold I上，孵育、转化、诱导表达并纯化，制得融合碳端的重组蛛丝蛋白；

其中，当核心序列为多个时，需要对核心序列进行核心序列倍增处理。

优选地，转移时在pET载体和pCold I的共同限制性内切酶的酶切位点进行酶切。

优选地，所述纯化包括粗分离和柱纯化，粗分离包括超声、离心和热变性步骤。

进一步优选地，热变性的温度为30℃-60℃，时间为30min。

进一步优选地，热变性的温度为40℃或50℃，热变性后的离心力为20000g。

本发明还公开了上述一种融合碳端的重组蛛丝蛋白在制备生物材料中的应用。

本发明还公开了一种载药微球，所述载药微球由上述融合碳端的重组蛛丝蛋白溶于磷酸钾缓冲液中制得。

优选地，所述磷酸钾缓冲液的pH值为7。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种融合碳端的重组蛛丝蛋白，由重复核心序列和碳端序列组成，通过碳端序列的作用能够影响蛛丝的存储状态和组装状态的切换，控制蛋白在离子溶液中的溶解性和纤维成形性，促进β-折叠的形成，影响蛋白的二级结构，进而影响蛋白的纤维结构，多个重复核心序列相比于现有的重组蛛丝蛋白，表达更多的重复核心序列能够使表达更简易。该重组蛛丝蛋白能够应用于生物材料制备领域，具有很好的应用前景。

本发明提供的一种融合碳端的重组蛛丝蛋白的制备方法，不同于现有技术中的在pET系列载体上，引入可翻译甘氨酸-tRNA的序列，同时降低诱导温度和转速，让蛋白缓慢地表达的复杂方法，本方法将重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT克隆在载体上，再将MaSp2(8R)+CT片段转移至pCold I上，孵育、转化、诱导表达并纯化，制得融合碳端的重组蛛丝蛋白，通过将目的片段转移至pCold I上，解决了现有蛋白制备过程中需要多个载体中多次操作、翻译需要转运tRNA，依赖于甘氨酸-tRNA或甘氨酸/丙氨酰—tRNA的问题，能够实现无需克隆甘氨酸-tRNA的编码序列就成功诱导表达重组蛛丝蛋白，该制备方法简单易操作，制得的蛋白含量高。

本发明提供的一种载药微球，相比于现有的载药微球，毒性更小，载药率可达75％，高于现有技术的40％-60％，释放率中，能够释放加载药物的83％，高于现有技术的60％，载药率和释放率更高，同时，该载药微球的制备方法简单，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明的载体pCold I构建融合碳端的重组蛛丝蛋白的电泳图；其中，图A为pColdⅠ的双酶切电泳图(从左到右依次为1kb plus(marker)、pCold I和pCold I-NdeⅠ+HindⅢ)，图B是pColdⅠ的双酶切和单酶切产物对比图(从左到右依次为1kb plus(marker)、pCold I-HindⅢ和pCold I-NdeⅠ+HindⅢ)，图C是MaSp2(8R)+CT双酶切电泳图(从左到右依次为marker、MaSp2(8R)-NdeⅠ+HindⅢ和MaSp2(8R)+CT-NdeⅠ)，图D为MaSp2(8R)+CT双酶切回收电泳图(依次是1kb plus(marker)、MaSp2(8R)+CT-NdeⅠ+HindⅢ(1343/5304)和MaSp2(8R)+CT-NdeⅠ+HindⅢ)；

图2为本发明的pCold I上的融合碳端的重组蛛丝蛋白的NdeⅠ单酶切鉴定图；其中，从左到右依次为D15000+2000(marker)、MaSp2(8R)+CT和MaSp2(8R)+CT-NdeⅠ；

图3为本发明的载体pCold I上的重组蛛丝蛋白表达的电泳图；其中，左侧为marker的条带，单位为：kDa，Y表示诱导；

图4为本发明的不同热变性温度下蛋白溶液的变性情况；其中，左侧为marker的条带，单位为：kDa，上侧为每个泳道的蛋白样品的名称，与上侧标号对应，Y表示诱导，A为30℃和40℃温度下，B为50℃和60℃温度下，C为70℃和80℃温度下；

图5为本发明的融合碳端的重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT-pCold I回收的情况；其中，左侧为marker的条带，单位为：kDa，Y表示诱导，A为洗脱液E1-E4的目的蛋白情况，B为洗涤液W1至W3的目的蛋白情况；

图6为本发明的空白微球和载药微球的荧光图；

图7为本发明的空白微球和载药微球的扫描电镜图；

图8为本发明的阿霉素标准曲线图；

图9为本发明的两种不同pH值下的微球的载药率比较图；其中，灰色柱形图为A组，pH值＝4，白色柱形图为B组，pH值＝7；

图10为本发明的B组(pH值＝7)的微球的释放率及释放曲线图；其中，图A为PBS的pH值＝4.5，37℃条件下释放48h的释放率，图B为B组微球分别在pH值＝4.5、6.0和7.2时的释放曲线；

图11为本发明的B组(pH值＝7)的微球细胞毒性实验。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明中，MaSp2(nR)表示含有n个核心序列的MaSp2，MaSp2(CT)表示含有碳端序列的MaSp2。

如表1，本发明提供的一种融合碳端的重组蛛丝蛋白(命名为MaSp2(8R)+CT)，由8个重复核心序列和碳端序列组成，所述重组蛛丝蛋白的核心序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述碳端序列如SEQ.ID.NO.2所示，编码所述重组蛛丝蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，所述重组蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

表1序列表

表2氨基酸序列表

本发明提供的上述融合碳端的重组蛛丝蛋白的制备方法，具体步骤如下：

实验材料：

载体pET28-a(+)购于北京赛百胜基因技术有限公司；载体pCold I购于TakaRa公司；重组蛛丝蛋白的核心序列(MaSp2(1R))和重组蛛丝蛋白的碳端序列(MaSp2(CT))均购于北京赛百盛基因技术有限公司；磁珠回收所用试剂配方包括：裂解液1：50mM Tris-HCl、500mM NaCl、5mM imidazole，调节pH值为8.0；洗涤液2：50mM Tris-HCl、500mM NaCl、20mMimidazole，调节pH值为8.0；洗脱液3：50mM Tris-HCl、500mM NaCl、250mM imidazole，调节pH值为8.0。

1、构建

1)制备MaSp2(8R)

在载体pET28-a(+)上以MaSp2(1R)的质粒为起点，使用Nde I和BstE II、Spe I和BstE II进行酶切，再回收Nde I和BstE II酶切得到的大片段I，Spe I和BstE II酶切得到的小片段I，对大片段I和小片段I进行连接，实现核心序列倍增，得到MaSp2(2R)；以MaSp2(2R)的质粒为起点，通过酶切、回收和连接，实现核心序列倍增，得到MaSp2(4R)；以MaSp2(4R)的质粒为起点，通过酶切、回收和连接，实现核心序列倍增，得到MaSp2(8R)；

其中，MaSp2(2R)、MaSp2(4R)、MaSp2(8R)核心序列倍增的条件同MaSp2(1R)。

注：MaSp2(nR)进行核心序列倍增的条件同MaSp2(1R)。

2)制备MaSp2(8R)+CT

对步骤1)得到的MaSp2(8R)使用Nde I和BstE II、Spe I和BstE II进行酶切，回收Nde I和BstE II酶切得到大片段II，对MaSp2(CT)使用Nde I和BstE II、Spe I和BstE II进行酶切，回收BstE II和Spe I酶切得到小片段II，对得到大片段II和小片段II进行连接，得到MaSp2(8R)+CT。

3)酶切、连接

在限制性内切酶Nde I和Hind III的酶切位点(载体pET28-a(+)和载体pCold-I上相同的酶切位点)对载体pET28-a(+)上的MaSp2(8R)+CT片段进行酶切处理，回收得到小片段III，对载体pCold I用Nde I和Hind III进行酶切处理，得到大片段III，酶切后使用凝胶电泳判断酶切是否完全及相应条带是否符合理论值，并用凝胶回收或者柱回收的方式将上述片段从凝胶或酶切体系溶液中分离；再通过T4连接酶将大片段III和小片段III以1：10的摩尔比连接，在16℃下孵育16h后得到连接产物，即将MaSp2(8R)+CT片段连接在pCold I上。

在图1A和图1B中，pCold I在单酶切和双酶切后的条带基本无差别，原因是根据质粒图谱上的酶切位点可计算，pCold I在Nde I和Hind III双酶切后，只会被切割35bp，这样小的变化在电泳图中不容易被分辨，又因为应回收的是载体pCold I上的绝大部分，所以在pCold I-NdeⅠ+HindⅢ的回收实验不用凝胶电泳回收，采用的是吸附柱回收。图1C显示的是MaSp2(8R)+CT的双酶切情况，图1D是图1C的凝胶回收。图D中MaSp2(8R)+CT在NdeⅠ和HindⅢ双酶切后产生的两个片段分别为1343bp和5304bp，应回收的是较小的片段，因此在凝胶电泳中应分别回收约在marker的1000bp处的条带。

4)转化

化学转化法：取100μL感受态细胞BL21，加入1μL步骤2)得到的连接产物混匀；冰浴20-30min，42℃水浴90S，再放在冰中2min；随后加入650-800μL LB液体培养基，37℃、220rpm震荡孵育1h；取含有抗生素的固体LB培养平板，分别加入不同菌液量涂板，37℃过夜培养，得到转化后的菌种。

5)鉴定

载体pCold I没有T7启动子序列，不具备使用T7引物做PCR的基础，因此使用酶切鉴定。

具体步骤如下：对转化后的菌种，37℃过夜培养，提取质粒，使用限制性内切酶酶切质粒，如图2，由图中可看出在pCold I上的MaSp2(8R)+CT的单酶切的情况，在载体pColdⅠ上，MaSp2(8R)+CT的单酶切产物大小的理论值为5685bp，与marker对比，在7500-5000bp之间，符合理论值。

2、表达

根据载体pCold I的性质，将转化后的菌种挑于含100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床中过夜培养。将过夜的转化后的菌种菌液按1：100的质量浓度重新接入100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD

3、制备纯化

1)粗分离

超声：将诱导后的菌液离心，收集菌体，将菌体重悬在裂解液1中，加入裂解里的比例为800mL菌液加入30mL裂解液1。混匀后置于冰水浴中超声，超声8s，暂停8s，约30min后，得到澄清透明的蛋白超声溶液。

离心：将蛋白超声溶液于4000rpm的离心机中离心30min，离心后的上清称为蛋白溶液1，沉淀称为蛋白沉淀1。

热变性：将离心后得到的蛋白溶液1分别取1.5mL于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴中加热30min，再将加热后的蛋白溶液1于20000g，4℃的超速离心机中离心30min，分别得到不同水浴温度加热过的热变性上清和热变性沉淀，将30℃和40℃热变性沉淀用200μL PBS重悬，将50℃和60℃热变性沉淀用1000μL PBS重悬，将70℃和80℃热变性沉淀用2000μL PBS重悬，SDS-PAGE电泳时每个样品上样6μL。如图4，蛋白溶液在加热后出现了不同程度的变性。首先，通过对比图A诱导前后的重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT，在40-35KDa处出现了目的条带，说明在诱导表达了目的蛋白，从而在超声溶液中存在该蛋白。在对其进行加热、离心处理后发现：未诱导的重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT在30℃和40℃加热时变化不大，而诱导后的重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT在30℃加热时，沉淀和上清中有均有目的条带且含量相当，诱导后的重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT在40℃加热时，沉淀中有目的条带，但目的条带较上清浅，说明在40℃加热条件下，大部分目的蛋白存在于上清中。对比30℃和40℃发现，30℃加热的上清中目的蛋白存在量较40℃时低，但沉淀中的变性的目的蛋白条带却相差不大。图B中可看出在50℃和60℃加热时的情况，随着温度升高，蛋白变性的程度加大，诱导后的重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT在60℃时已经有约一半的目的蛋白变性，存在于沉淀中。但诱导后的重组蛛丝蛋白MaSp2(8R)+CT在50℃时有不同的表现：在图中显示，目的蛋白几乎全部存在于上清，在沉淀中几乎可以看不到目的蛋白的条带。而图C中可看出在70℃和80℃加热时,目的蛋白基本全部变性而存在于沉淀中。因此，在热变性实验中可以看出，高于50℃的加热条件可以使得蛋白出现变性，变性程度随温度升高而增加，在40℃和50℃时利用热变性除去杂蛋白的方法可行性较大。因此，热变性优选40℃和50℃加热30min。

2)柱纯化

结合：将磁珠与缓冲液混合均匀，取混合后的磁珠加入15mL塑料管中，使用10倍体积即2mL的裂解液1对混合后的磁珠平衡2次，用磁铁吸附磁珠，将液体除去。将变性后且离心的蛋白溶液与平衡后的磁珠在室温下温和翻转30min。除去结合后的流穿液，并取20μL作为留样。

洗涤(Wash)：在结合完成的磁珠中加入1mL的洗涤液2，在室温下温和翻转3-5min，重复冲洗3次，每次洗涤均取20μL作为留样，标记为W1至W3。

洗脱(Elution)：使用1倍柱体积的洗脱液3对洗涤后的磁珠冲洗3次，每次洗涤均取20μL作为留样，标记为E1至E4。将洗脱液中的蛋白溶液通过透析除去盐离子，将透析后的蛋白溶液冷冻干燥即可。如图5，图B中经过热变性后的沉淀中无目的蛋白条带，说明在加热过程中目的蛋白没有因为加热而大量变性，杂蛋白因不具备对热的抵抗而变性。在流穿液中仍可见极少量目的蛋白条带，说明目的蛋白结合充分。在洗涤液W1、W2和W3中可见杂蛋白的条带，在W1中可见少量目的蛋白，图A洗脱液E2-E4中的目的蛋白量较高，说明纯化成功。

本发明提供的一种载药微球，由上述重组蛛丝蛋白溶于磷酸钾缓冲液中制得。

1.制备载药微球

取5mg/mL上述的重组蛛丝蛋白溶液50μL加入到1000μL的pH值为7(B组)或pH值为4(A组)的2M磷酸钾缓冲液中，室温混合过夜，制得不同pH值的微球。将pH值为7(B组)或pH值为4(A组)的微球分别各自加入2mg/mL的药物(阿霉素；购于生工生物工程(上海)股份有限公司)50μL、100μL室温混合过夜，随后将微球在超纯水中透析过夜，制得载药微球。然后将所得液体样品进行干燥，在载玻片上滴加10μL，于室温自然风干，重复2-3次，之后进行喷金处理，制得载药微球的扫描电镜的上样样品。

2.对载药微球进行性能评价

1)荧光检测

由于阿霉素可在激发后发射荧光，因此使用荧光显微镜观察蛋白微球是否包载了阿霉素，在明场和绿光激发下拍摄微球的图像。

将包载后的微球在绿色激发光下，分别拍摄A组、B组的空白微球和分别载药(阿霉素)50μL、100μL微球的图像，如图6所示，未包载阿霉素的微球在荧光显微镜下无荧光，而包载了阿霉素的微球在绿色激发光下都可以观察到红色的荧光，说明阿霉素已经包载于微球表面。

2)载药微球形态观察

用扫描电子显微镜(SEM)来观察载药微球的形状和大小，由图7可看出，A组微球的粒径较小，约300nm，分散均匀，在包载阿霉素后，粒径变化不大，分散性没有因为包载了阿霉素而降低。相反，B组微球在不包载阿霉素的情况下，粒径较大，约500nm，在包载阿霉素为50μL时，粒径和包载之前相差不大，但在包载阿霉素的量为100μL时，微球出现聚集，甚至团聚成块状，表面可见的微球较未包载微球的直径大。

3)载药率和释放率

载药率的测量：固定微球的量为250μg，加入2mg/mL药物(阿霉素)的量分别为50μL、60μL、70μL、80μL和100μL，加入到1000μL的pH值为8的2M磷酸钾缓冲液中，室温混合过夜。过夜孵育后的微球在超纯水中透析过夜。收集透析袋外侧的溶液并记录体积，在波长508nm处测吸收值。

阿霉素标准曲线的绘制：准备10mL容量瓶，分别加入2mg/mL阿霉素100μL、50μL、40μL、30μL、20μL、10μL、5μL和1μL，加水至刻度线。通过测吸光度A

在体外释药环节，首先分别配制pH值为4.5、6.0和7.2的PBS溶液，将载药微球置于透析带中并放入PBS溶液中，在37℃的培养箱中48h。收集透析袋外侧的溶液并记录体积，在波长508nm处测吸收值。计算公式为：

阿霉素标准曲线的测量点为：阿霉素分别100μL、50μL、40μL、30μL、20μL、10μL、5μL和1μL，标准曲线如图8，y＝21.787x，R

图9为对不同pH值下的微球载药率的比较。总体趋势来说，两组微球的载药量随药物量的增加而增加，但随着药物量的增加，载药率的增加速率放缓，说明阿霉素与蛋白微球作用的部位趋于饱和。B组的载药率均大于55％，最高可达75％(现有技术是40％-60％)，A组的最大载药率低于50％，因而B组的微球整体比A组微球载药率高，更适合对阿霉素的包载，因此采用B组的微球做释放实验。

图10A为不同浓度的载药微球在相同条件下(PBS的pH值＝4.5，37℃条件下释放48h)的释放。从图中可看出释放率在50％-83％之间，出现先降低后升高的趋势。其中，0.14mg组最低，为50％，0.10mg组释放效率最高，释放了83％(现有技术是60％)。因此，B组微球的释放实验可以说明，在同等情况下即微球为250μg，加入2mg/mL阿霉素50μL，即阿霉素为0.10mg时的释放最好。图10B中，阿霉素的释放率随释放时长的增加而累计，在pH值为4.5(模拟癌细胞微环境)时，在前3h释放较快，在8h左右就基本达到了B组微球的释放最大值，约为80％，在48h释放率为83％，而在pH值为6.0和7.2的环境时，48h的累计释放率为36％和32％。

4)细胞毒性测试

采用MTT法进行细胞毒性测试，MTT(噻唑蓝)法测细胞毒性的机理是活细胞中存在线粒体代谢产生的脱氢酶可将MTT被脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒(Formazan)结晶，该结晶可溶于二甲亚砜(DMSO)，并用酶标仪在492nm处测其吸光度，吸光度的值在一定范围内与活细胞的数量成正比，而活细胞数量越大，说明对细胞的毒性越小。而死细胞中不具有脱氢酶，因此可以排除死细胞的干扰。

在对空白微球和载药微球进行细胞毒性测试时的步骤分为两部分。首先是Hela细胞的种植：取100μL用PBS清洗、胰酶消化的细胞稀释至1mL，运用血细胞计数板在显微镜下计数，按每孔约5000-6000个细胞数量接种到96孔板中，补入100μL培养基，在37℃、5％CO

由图11可看出，细胞在空白微球的不同浓度中均可生长，存活率均接近100％，说明空白微球对细胞无毒性，具备良好的生物相容性。而对于载药微球，细胞的存活率随载药微球浓度的增加而降低，说明随着阿霉素浓度升高，对细胞的毒性增加，说明阿霉素对细胞的杀灭效果增加。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 四川轻化工大学

<120> 一种融合碳端的重组蛛丝蛋白及其制备方法与基于重组蛛丝蛋白的载药微球

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gctagcggtc caggtggcta tggtcctggc caacaaggtc catctggtcc tggctctgca 60

gctgcagcag ctgctgcagc tggtccaggt ggctatggtc ctggccagca aactagt 117

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gctagcgttg gcagcggtgc gagcgccgcg agcgcggcag ccagtcgcct gtcgtctccg 60

caggcatcca gtcgtgtgag cagtgctgtt agcaacctgg tcgcaagtgg tccgaccaat 120

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<210> 3

<211> 1278

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gctagcggtc caggtggcta tggtcctggc caacaaggtc catctggtcc tggctctgca 60

gctgcagcag ctgctgcagc tggtccaggt ggctatggtc ctggccagca aactagtgct 120

agcggtccag gtggctatgg tcctggccaa caaggtccat ctggtcctgg ctctgcagct 180

gcagcagctg ctgcagctgg tccaggtggc tatggtcctg gccagcaaac tagtgctagc 240

ggtccaggtg gctatggtcc tggccaacaa ggtccatctg gtcctggctc tgcagctgca 300

gcagctgctg cagctggtcc aggtggctat ggtcctggcc agcaaactag tgctagcggt 360

ccaggtggct atggtcctgg ccaacaaggt ccatctggtc ctggctctgc agctgcagca 420

gctgctgcag ctggtccagg tggctatggt cctggccagc aaactagtgc tagcggtcca 480

ggtggctatg gtcctggcca acaaggtcca tctggtcctg gctctgcagc tgcagcagct 540

gctgcagctg gtccaggtgg ctatggtcct ggccagcaaa ctagtgctag cggtccaggt 600

ggctatggtc ctggccaaca aggtccatct ggtcctggct ctgcagctgc agcagctgct 660

gcagctggtc caggtggcta tggtcctggc cagcaaacta gtgctagcgg tccaggtggc 720

tatggtcctg gccaacaagg tccatctggt cctggctctg cagctgcagc agctgctgca 780

gctggtccag gtggctatgg tcctggccag caaactagtg ctagcggtcc aggtggctat 840

ggtcctggcc aacaaggtcc atctggtcct ggctctgcag ctgcagcagc tgctgcagct 900

ggtccaggtg gctatggtcc tggccagcaa actagtgcta gcgttggcag cggtgcgagc 960

gccgcgagcg cggcagccag tcgcctgtcg tctccgcagg catccagtcg tgtgagcagt 1020

gctgttagca acctggtcgc aagtggtccg accaattccg cagctctctc gtctacgatc 1080

tctaacgttg tgagccagat tggcgcaagc aatcctggtc tgagcggctg cgatgtgctc 1140

atccaagcgc tgctcgaagt ggtcagtgcg ctgattcaga tcctcggtag cagttccatc 1200

ggtcaggtta actatggctc ggcaggtcaa gcgacgcaga ttgttggcca gagcgtgtac 1260

caggcgcttg gcactagt 1278

<210> 4

<211> 426

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gln Ser Gly

1 5 10 15

Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr

20 25 30

Gly Pro Gly Gln Gln Thr Ser Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro

35 40 45

Gly Gln Gln Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Thr Ser Ala Ser

65 70 75 80

Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gln Ser Gly Pro Gly

85 90 95

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro

100 105 110

Gly Gln Gln Thr Ser Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln

115 120 125

Gln Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Thr Ser Ala Ser Gly Pro

145 150 155 160

Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln

180 185 190

Gln Thr Ser Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly

195 200 205

Gln Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro

210 215 220

Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Thr Ser Ala Ser Gly Pro Gly Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Thr

260 265 270

Ser Ala Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gln Ser

275 280 285

Gly Pro Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly

290 295 300

Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Thr Ser Ala Ser Val Gly Ser Gly Ala Ser

305 310 315 320

Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Arg Leu Ser Ser Pro Gln Ala Ser Ser

325 330 335

Arg Val Ser Ser Ala Val Ser Asn Leu Val Ala Ser Gly Pro Thr Asn

340 345 350

Ser Ala Ala Leu Ser Ser Thr Ile Ser Asn Val Val Ser Gln Ile Gly

355 360 365

Ala Ser Asn Pro Gly Leu Ser Gly Cys Asp Val Leu Ile Gln Ala Leu

370 375 380

Leu Glu Val Val Ser Ala Leu Ile Gln Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile

385 390 395 400

Gly Gln Val Asn Tyr Gly Ser Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Val Gly

405 410 415

Gln Ser Val Tyr Gln Ala Leu Gly Thr Ser

420 425