基质金属蛋白酶可切割且丝氨酸蛋白酶可切割底物及其使用方法

摘要

本发明一般地涉及包括作为至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的至少第一可切割部分(CM1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物的至少第二可切割部分(CM2)的多肽，涉及这些包括作为至少一种MM蛋白酶的底物的至少CM1和作为至少一种SP蛋白酶的底物的至少CM2的多肽的可活化抗体和其它更大分子，和涉及在各种治疗、诊断和预防适应症中制备和使用这些包括作为至少一种MM蛋白酶的底物的至少CM1和作为至少一种SP蛋白酶的底物的至少CM2的多肽的方法。

说明书

本申请是申请日为2016年1月20日，申请号为201680016951.5， 发明名称为“基质金属蛋白酶可切割且丝氨酸蛋白酶可切割底物及其 使用方法”的发明专利申请的分案申请。

本申请要求享有2015年1月20日提交的美国临时申请号 62/105,490、2015年11月20日提交的美国临时申请号62/258,015和 2016年1月14日提交的美国临时申请号62/278,713的权益，所述申请 各自的内容全文通过引用并入本文。

序列表的并入

在2016年1月15日创建且大小为456KB的命名为 “CYTM037001WO_ST25”的文本文件的内容以其整体通过引用并入 本文。

技术领域

本发明总体涉及包括作为至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物 的至少第一可切割部分(CM1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底 物的至少第二可切割部分(CM2)的多肽，包括这些至少包括作为至少一 种MM蛋白酶的底物的CM1和作为至少一种SP蛋白酶的底物的CM2 的多肽的可活化抗体和其它更大分子，并涉及各种治疗、诊断和预防 适应症中制备和使用这些至少包括作为至少一种MM蛋白酶的底物的 CM1和作为至少一种SP蛋白酶的底物的CM2的多肽的方法。

背景技术

蛋白酶是通过切割氨基酸残基之间的肽键来降解蛋白的酶。蛋白 酶天然存在于所有生物体中，并且涉及从简单降解至高度调节的途径 的各种生理反应。已知一些蛋白酶基于蛋白内特定氨基酸序列的存在 而破坏特定的肽键。

因此，需要鉴定蛋白酶的新底物并且在各种治疗、诊断和预防适 应症中使用这些底物。

发明内容

本发明提供了包括作为至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的 至少第一可切割部分(CM1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物 的至少第二可切割部分(CM2)的氨基酸序列。这些氨基酸序列在本文中 统称为“CM1-CM2底物”。该术语不旨在传达关于作为至少一种基质 金属蛋白酶(MMP)的底物的第一可切割部分(CM1)和作为至少一种丝 氨酸蛋白酶(SP)的底物的至少第二可切割部分(CM2)的取向或其它结 构排列的任何要求。因此，术语“CM1-CM2底物”涵盖具有如下的 N-端至C-端的结构排列的CM1-CM2底物：CM1-CM2或CM2-CM1。 术语“CM1-CM2底物”还涵盖其中CM1序列的至少一部分与CM2序 列的至少一部分重叠的底物。

本文所述的CM1-CM2底物可用于各种治疗、诊断和预防性适应症 中。例如，这些CM1-CM2底物可用于可活化抗体，其包括抗体或其抗 原结合片段(AB)，其包括与AB的至少一个抗原或表位结合结构域连 接的至少一个掩蔽部分(MM)，使得MM的偶联降低AB结合其靶标的 能力。

在一些实施方案中，可活化抗体至少包括第一CM(CM1)和第二 CM(CM2)。在一些实施方案中，CM1底物序列的至少部分与CM2序 列的至少部分重叠。在一些实施方案中，CM1底物序列和CM2底物序 列共有至少一个共同氨基酸残基。在一些实施方案中，CM1底物序列和CM2底物序列共有至少两个共同氨基酸残基。在一些实施方案中， CM1底物序列和CM2底物序列共有至少三个共同氨基酸残基。在一些 实施方案中，CM1底物序列和CM2底物序列共有三个或更多个共同氨 基酸残基。

在一些实施方案中，CM1和CM2是可操作连接在一起的分开的多 肽。

在一些实施方案中，CM1和CM2是直接连接在一起的分开的多肽， 即，一个底物的N-端与另一底物多肽的C-端直接连接。在一些实施方 案中，CM1的N-端与CM2的C-端直接连接。在一些实施方案中，CM2 的N-端与CM1的C-端直接连接。

在一些实施方案中，CM1和CM2是经由至少一个连接部分可操作 连接在一起的分开的多肽。

在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体中的第一可切割 部分CM1和第二可切割部分CM2具有如下的从N-端至C-端的结构排 列：MM-CM1-CM2-AB、AB-CM2-CM1-MM、MM-CM2-CM1-AB或AB-CM1-CM2-MM。

在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2之间的连接肽 (LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括掩蔽部分(MM)和CM1之 间的连接肽(LP″)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM2和AB之 间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括MM和CM1之间的连接肽(LP″)和CM2和AB之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方 案中，可活化抗体包括MM和CM1之间的连接肽(LP″)和CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和AB之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括MM和CM1之间的连接肽(LP″)、CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和AB之间的连接肽(LP″′)。

在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2之间的连接肽 (LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽 (LP″)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM2和掩蔽部分(MM)之 间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽(LP″)和CM2和MM之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方 案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽(LP″)和CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和MM之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方 案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽(LP″)、CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和MM之间的连接肽(LP″′)。

在一些实施方案中，LP′是GG。在一些实施方案中，LP′是GGSGGS (SEQ ID NO：350)。

在一些实施方案中，CM1是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底 物。MMP的实例包括MMP1；MMP2；MMP3；MMP7；MMP8；MMP9； MMP10；MMP11；MMP12；MMP13；MMP14；MMP15；MMP16；MMP17；MMP19；MMP20；MMP23；MMP24；MMP26；和MMP27。

在一些实施方案中，CM1是MMP2、MMP9、MMP14、MMP1、 MMP3、MMP13、MMP17、MMP11和/或MMP19的底物。在一些实 施方案中，CM1是MMP2的底物。在一些实施方案中，CM1是MMP9 的底物。在一些实施方案中，CM1是MMP14的底物。在一些实施方 案中，CM1是两种或更多种MMP的底物。在一些实施方案中，CM1 是至少MMP9和MMP14的底物。在一些实施方案中，CM1是至少 MMP2和MMP9的底物。在一些实施方案中，CM1是至少MMP2和 MMP14的底物。在一些实施方案中，CM1是三种或更多种MMP的底 物。在一些实施方案中，CM1是至少MMP2、MMP9和MMP14的底 物。在一些实施方案中，CM1包含相同的MMP的两种或更多种底物。 在一些实施方案中，CM1包含至少两种或更多种MMP2底物。在一些 实施方案中，CM1包含至少两种或更多种MMP9底物。在一些实施方 案中，CM1包含至少两种或更多种MMP14底物。

在一些实施方案中，CM1是MMP的底物且至少包括序列 ISSGLLSS(SEQ ID NO：20)；QNQALRMA(SEQ ID NO：21)； AQNLLGMV(SEQ ID NO：351)；STFPFGMF(SEQ ID NO：352)；PVGYTSSL(SEQ ID NO：353)；DWLYWPGI(SEQ ID NO：354)； MIAPVAYR(SEQ ID NO：355)；RPSPMWAY(SEQ ID NO：356)； WATPRPMR(SEQ ID NO：357)；FRLLDWQW(SEQ ID NO：358)；LKAAPRWA(SEQ ID NO：359)；GPSHLVLT(SEQ ID NO：360)； LPGGLSPW(SEQ ID NO：361)；MGLFSEAG(SEQ ID NO：362)； SPLPLRVP(SEQ ID NO：363)；RMHLRSLG(SEQ ID NO：364)；LAAPLGLL(SEQ ID NO：365)；AVGLLAPP(SEQ ID NO：366)； LLAPSHRA(SEQ ID NO：367)；PAGLWLDP(SEQ ID NO：368)； ISSGLSS(SEQ ID NO：369)；ISSGL(SEQ ID NO：480)；ISSGLLS(SEQ ID NO：481)；ISSGLL(SEQ ID NO：482)；和/或VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：411)。

在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列ISSGLLSS(SEQ ID NO：20)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列QNQALRMA(SEQ ID NO：21)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列AQNLLGMV (SEQ ID NO：351)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列 STFPFGMF(SEQ IDNO：352)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序 列PVGYTSSL(SEQ ID NO：353)。在一些实施方案中，CM1包含氨基 酸序列DWLYWPGI(SEQ ID NO：354)。在一些实施方案中，CM1包含 氨基酸序列MIAPVAYR(SEQ ID NO：355)。在一些实施方案中，CM1 包含氨基酸序列RPSPMWAY(SEQ ID NO：356)。在一些实施方案中， CM1包含氨基酸序列WATPRPMR(SEQ ID NO：357)。在一些实施方案 中，CM1包含氨基酸序列FRLLDWQW(SEQ ID NO：358)。在一些实施 方案中，CM1包含氨基酸序列LKAAPRWA(SEQ ID NO：359)。在一些 实施方案中，CM1包含氨基酸序列GPSHLVLT(SEQ ID NO：360)。在 一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列LPGGLSPW(SEQ IDNO：361)。 在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列MGLFSEAG(SEQ ID NO：362)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列SPLPLRVP(SEQ ID NO：363)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列RMHLRSLG(SEQ ID NO：364)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列LAAPLGLL (SEQID NO：365)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸序列 AVGLLAPP(SEQ ID NO：366)。在一些实施方案中，CM1包含氨基酸 序列LLAPSHRA(SEQ ID NO：367)。在一些实施方案中，CM1包含氨 基酸序列PAGLWLDP(SEQ ID NO：368)。在一些实施方案中，CM1包 含氨基酸序列ISSGLSS(SEQ ID NO：369)。在一些实施方案中，CM1 包含氨基酸序列VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：411)。在一些实施方案中， CM1包含氨基酸序列ISSGL(SEQ ID NO：480)。在一些实施方案中， CM1包含氨基酸序列ISSGLLS(SEQ ID NO：481)。在一些实施方案中， CM1包含氨基酸序列ISSGLL(SEQ ID NO：482)。

在一些实施方案中，CM2是至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物。 在一些实施方案中，SP选自u-型纤溶酶原激活物(uPA，也称为尿激酶)、 matriptase(本文也称为MT-SP1或MTSP1)及其组合。通过非限制性实 例，切割本文所述的CM2的其它SP的实例包括活化蛋白C；组织蛋 白酶A；组织蛋白酶G；糜蛋白酶；凝血因子蛋白酶，诸如例如FVIIa、 FIXa、FXa、FXIa、FXIIa；弹性蛋白酶；颗粒酶B；Guanidinobenzoatase； HtrA1；人中性粒细胞弹性蛋白酶；乳铁蛋白；Marapsin；NS3/4A；PACE4； 纤溶酶；PSA；tPA；凝血酶；类胰蛋白酶；II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)， 诸如例如DESC1、DPP-4、FAP、Hepsin、Matriptase-2、TMPRSS2、TMPRSS3和/或TMPRSS4。

例如，合适的CM2由至少一种丝氨酸蛋白酶切割且包括序列 TGRGPSWV(SEQ IDNO：370)；SARGPSRW(SEQ ID NO：371)； TARGPSFK(SEQ ID NO：372)；LSGRSDNH(SEQ ID NO：18)； GGWHTGRN(SEQ ID NO：373)；HTGRSGAL(SEQ ID NO：374)； PLTGRSGG(SEQ ID NO：375)；AARGPAIH(SEQ ID NO：376)；RGPAFNPM(SEQ ID NO：377)；SSRGPAYL(SEQ ID NO：378)；RGPATPIM(SEQ ID NO：379)；RGPA(SEQ ID NO：380)；LSGRSGNH (SEQ ID NO：412)；TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：413)；TSGRSANP (SEQ ID NO：414)；SGRSANPRG(SEQ ID NO：468)；VAGRSMRP(SEQ ID NO：415)；LSGRSDDH(SEQ ID NO：547)；LSGRSDIH(SEQ ID NO：548)；LSGRSDQH(SEQ ID NO：549)；LSGRSDTH(SEQ ID NO：550)； LSGRSDYH(SEQ ID NO：551)；LSGRSDNP(SEQ ID NO：552)； LSGRSANP(SEQ ID NO：553)；LSGRSANI(SEQ ID NO：554)；和/或 LSGRSDNI(SEQ ID NO：71)。

在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列TGRGPSWV(SEQ ID NO：370)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列SARGPSRW(SEQ ID NO：371)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列TARGPSFK (SEQ ID NO：372)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列 LSGRSDNH(SEQ ID NO：18)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序 列GGWHTGRN(SEQ ID NO：373)。在一些实施方案中，CM2包含氨基 酸序列HTGRSGAL(SEQ ID NO：374)。在一些实施方案中，CM2包含 氨基酸序列PLTGRSGG(SEQ ID NO：375)。在一些实施方案中，CM2 包含氨基酸序列AARGPAIH(SEQ ID NO：376)。在一些实施方案中， CM2包含氨基酸序列RGPAFNPM(SEQ IDNO：377)。在一些实施方案 中，CM2包含氨基酸序列SSRGPAYL(SEQ ID NO：378)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列RGPATPIM(SEQ ID NO：379)。在一些 实施方案中，CM2包含氨基酸序列RGPA(SEQ ID NO：380)。在一些实 施方案中，CM2包含氨基酸序列LSGRSGNH(SEQ IDNO：412)。在一 些实施方案中，CM2包含氨基酸序列TSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：413)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列SGRSANPRG(SEQ ID NO：468)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列TSGRSANP (SEQ ID NO：414)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列VAGRSMRP(SEQ ID NO：415)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸 序列LSGRSDDH(SEQ IDNO：547)。在一些实施方案中，CM2包含氨 基酸序列LSGRSDIH(SEQ ID NO：548)。在一些实施方案中，CM2包 含氨基酸序列LSGRSDQH(SEQ ID NO：549)。在一些实施方案中，CM2 包含氨基酸序列LSGRSDTH(SEQ ID NO：550)。在一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列LSGRSDYH(SEQ ID NO：551)。在一些实施方案 中，CM2包含氨基酸序列LSGRSDNP(SEQ ID NO：552)。在一些实施 方案中，CM2包含氨基酸序列LSGRSANP(SEQ ID NO：553)。在一些 实施方案中，CM2包含氨基酸序列LSGRSANI(SEQ ID NO：554)。在 一些实施方案中，CM2包含氨基酸序列LSGRSDNI(SEQ ID NO：71)。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO：1)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：2)； AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：3)；TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：4)； VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：5)；TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：6)； AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：7)；LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：8)； VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：9)；LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：10)； LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：11)；LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：12)； ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：13)；LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：14)； QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：15)；LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：16)； QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：17)；ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO：22)；ISSGLLSGRSANPRG(SEQ ID NO：469)；AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO：470)； AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO：471)；ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO：483)；ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO：484)；ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO：485)；ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO：486)； ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO：487)；ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO：488)；ISSGLLSGRSANP(SEQ ID NO：489)；ISSGLLSGRSANI(SEQ ID NO：490)；AVGLLAPPGGLSGRSDDH(SEQ ID NO：515)； AVGLLAPPGGLSGRSDIH(SEQ ID NO：516)； AVGLLAPPGGLSGRSDQH(SEQ IDNO：517)；AVGLLAPPGGLSGRSDTH(SEQ ID NO：518)； AVGLLAPPGGLSGRSDYH(SEQ ID NO：519)；AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO：520)； AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO：521)；AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQ ID NO：522)；ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO：555)；和/或AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO：557)。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列 ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：2)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列 TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：4)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO：5)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列 TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：6)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：7)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列 LSGRSDNHGGAVGLLAPP(SEQ ID NO：8)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH(SEQ ID NO：9)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列 LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP(SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：11)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS(SEQ ID NO：12)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：13)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：14)。在一些实施方案 中，CM1-CM2底物包括序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH(SEQ ID NO：15)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA(SEQ ID NO：16)。在一些实施方案 中，CM1-CM2底物包括序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH(SEQ ID NO：17)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSGNH(SEQ ID NO：22)。在一些实施方案中，CM1-CM2底 物包括序列ISSGLLSGRSANPRG(SEQ ID NO：469)。在一些实施方案 中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPTSGRSANPRG(SEQ ID NO：470)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPSGRSANPRG(SEQ ID NO：471)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDDH(SEQ ID NO：483)。在一些 实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDIH(SEQ ID NO：484)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDQH(SEQ ID NO：485)。在一些实施方案中，CM1-CM2 底物包括序列。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列 ISSGLLSGRSDTH(SEQ ID NO：486)。在一些实施方案中，CM1-CM2 底物包括序列ISSGLLSGRSDYH(SEQ ID NO：487)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDNP(SEQ ID NO：488)。在一些 实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSANP(SEQ ID NO：489)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSANI(SEQ ID NO：490)。在一些实施方案中，CM1-CM2 底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDDH(SEQ ID NO：515)。在一些实 施方案中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDIH(SEQ ID NO：516)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDQH(SEQ ID NO：517)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDTH(SEQ ID NO：518)。 在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDYH(SEQ ID NO：519)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDNP(SEQ ID NO：520)。 在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSANP(SEQ ID NO：521)。在一些实施方案中， CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSANI(SEQ ID NO：522)。 在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列ISSGLLSGRSDNI(SEQ ID NO：555)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包括序列AVGLLAPPGGLSGRSDNI(SEQ ID NO：557)。

在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的从N- 端至C-端的结构排列：MM-CM1-CM2-AB、AB-CM2-CM1-MM、MM-CM2-CM1-AB或AB-CM1-CM2-MM。

在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接 肽(LP2)，且未切割状态下的抗体具有如下的从N-端至C-端的结构排列： MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB、AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM、 MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB或AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM。在一些 实施方案中，LP1和LP2各自是约1-20个氨基酸长的肽。在一些实施 方案中，两个连接肽不需要彼此相同。

在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2之间的连接肽 (LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括掩蔽部分(MM)和CM1之 间的连接肽(LP″)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM2和AB之 间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括MM和CM1之间的连接肽(LP″)和CM2和AB之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方 案中，可活化抗体包括MM和CM1之间的连接肽(LP″)和CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和AB之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括MM和CM1之间的连接肽(LP″)、CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和AB之间的连接肽(LP″′)。

在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2之间的连接肽 (LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽 (LP″)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM2和掩蔽部分(MM)之 间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽(LP″)和CM2和MM之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方 案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽(LP″)和CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)。在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和MM之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方 案中，可活化抗体包括AB和CM1之间的连接肽(LP″)、CM1和CM2 之间的连接肽(LP′)和CM2和MM之间的连接肽(LP″′)。

在一些实施方案中，LP′是GG。在一些实施方案中，LP′是GGSGGS (SEQ ID NO：350)。

在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一种包含选自以下的氨 基酸序列：(GS)

在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一种包含选自以下的氨 基酸序列：GGSG(SEQ ID NO：383)、GGSGG(SEQ ID NO：384)、GSGSG (SEQ ID NO：385)、GSGGG(SEQ ID NO：386)、GGGSG(SEQ ID NO：387) 和GSSSG(SEQ ID NO：388)。

在一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO：389)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO：390)、GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO：391)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQID NO：392)、 GSSGGSGGSG(SEQ ID NO：393)或GSSGGSGGSGS(SEQ ID NO：394)。

在一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：395)、GSSGT(SEQ ID NO：396)或GSSG(SEQ ID NO：397)。

在一些实施方案中，AB对于结合靶标具有约100nM或更低的解 离常数。

在一些实施方案中，可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其 抗原结合片段(AB)。在一些实施方案中，AB是全长抗体。在一些实施 方案中，AB是免疫活性片段。在一些实施方案中，AB是抗原结合片 段。在一些实施方案中，AB是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab 片段、F(ab′)

在一些实施方案中，MMP蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗 体暴露于蛋白酶时，MMP蛋白酶切割抗体中的CM1。在一些实施方案 中，SP蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗体暴露于蛋白酶时，SP 蛋白酶切割抗体中的CM2底物。在一些实施方案中，MMP蛋白酶和/ 或SP蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗体暴露于蛋白酶时，MMP 蛋白酶和/或SP蛋白酶切割抗体中的CM1-CM2底物。在一些实施方案 中，MMP蛋白酶和SP蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当抗体暴露 于蛋白酶时，MMP蛋白酶和SP蛋白酶中的至少一种切割抗体中的CM1-CM2底物。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM1底物序列和CM2底物 序列各自独立地是最多达15个氨基酸长的多肽。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM1底物序列是至少一种 MMP的底物，且包含与任何多肽序列(例如，被相同的MMP蛋白酶自 然切割的任何动物多肽序列)基本上不同的多肽序列。在一些实施方案 中，CM1-CM2底物的CM1底物序列是至少一种MMP的底物，且包含与被相同的MMP蛋白酶自然切割的任何哺乳动物多肽序列基本上 不同的多肽序列。在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM1底物序 列是至少一种MMP的底物，且包含与被相同的MMP蛋白酶自然切割 的任何人多肽序列基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中， CM1-CM2底物的CM1底物序列是至少一种MMP的底物，且包含与 任何多肽序列(例如，被相同的MMP蛋白酶自然切割的任何动物多肽 序列)具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。在一些实施方案中， CM1-CM2底物的CM1底物序列是至少一种MMP的底物，且包含与 被相同的MMP蛋白酶自然切割的任何哺乳动物多肽序列具有不超过 90％或更高同一性的多肽序列。在一些实施方案中，CM1-CM2底物的 CM1底物序列是至少一种MMP的底物，且包含与被相同的MMP蛋白 酶自然切割的任何人多肽序列具有不超过90％或更高同一性的多肽序 列。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM2底物序列是至少一种 SP的底物，且包含与任何多肽序列(例如，被相同的SP蛋白酶自然切 割的任何动物多肽序列)基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中， CM1-CM2底物的CM2底物序列是至少一种SP的底物，且包含与被相 同的SP蛋白酶自然切割的任何哺乳动物多肽序列基本上不同的多肽序 列。在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM2底物序列是至少一种 SP的底物，且包含与被相同的SP蛋白酶自然切割的任何人多肽序列 基本上不同的多肽序列。在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM2 底物序列是至少一种SP的底物，且包含与任何多肽序列(例如，被相 同的SP蛋白酶自然切割的任何动物多肽序列)具有不超过90％或更高 同一性的多肽序列。在一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM2底物 序列是至少一种SP的底物，且包含与被相同的SP蛋白酶自然切割的 任何哺乳动物多肽序列具有不超过90％或更高同一性的多肽序列。在 一些实施方案中，CM1-CM2底物的CM2底物序列是至少一种SP的底 物，且包含与被相同的SP蛋白酶自然切割的任何人多肽序列具有不超 过90％或更高同一性的多肽序列。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557。在一 些实施方案中，可活化抗体含有包含选自SEQ ID NO：1-17、22、469-471、 483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的CM1-CM2底物，以及 结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)和降低AB的抗原或表位结合 结构域结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM)。

在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自SEQ ID NO：1-17、 22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的CM1-CM2 底物，和包含本文公开的抗Jagged抗体的氨基酸序列的抗Jagged抗体。 在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自SEQ IDNO：1-17、22、 469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的CM1-CM2底 物，和具有包含氨基酸序列SEQ ID NO：162或SEQ ID NO：164的轻链 和包含氨基酸序列SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：163的重链的抗体。

在一些实施方案中，CM1-CM2包括在具有选自SEQ ID NO：420、 422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、 539-546、561和562的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO：67的重链氨基酸 序列的可活化抗体中。

在一些实施方案中，CM1-CM2包括在具有选自SEQ ID NO：420、 422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、507-514、 539-546、561和562的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO：163的重链氨基 酸序列的可活化抗体中。

在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自SEQ ID NO：1-17、 22、469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的CM1-CM2 底物，和包含本文公开的抗EGFR抗体的氨基酸序列的抗EGFR抗体。 在一些实施方案中，可活化抗体含有包含选自SEQ ID NO：1-17、22、 469-471、483-490、515-522、555和557的氨基酸序列的CM1-CM2底 物，和具有包含氨基酸序列SEQ ID NO：111的轻链和包含氨基酸序列 SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：110的重链的抗体。

在一些实施方案中，CM1-CM2包括在具有选自SEQ ID NO：449、 451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、 531-538、559和560的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO：108的重链氨基 酸序列的可活化抗体中。

在一些实施方案中，CM1-CM2包括在具有选自SEQ ID NO：449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、 531-538、559和560的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO：109的重链氨基 酸序列的可活化抗体中。

在一些实施方案中，CM1-CM2包括在具有选自SEQ ID NO：449、 451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、474、499-506、 531-538、559和560的轻链氨基酸序列和SEQ IDNO：110的重链氨基 酸序列的可活化抗体中。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物也是至少一种额外蛋白酶的底 物。

在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶是与切割CM1的MMP 蛋白酶不同的MMP蛋白酶。在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶 是选自以下的MMP蛋白酶：MMP1；MMP2；MMP3；MMP7；MMP8； MMP9；MMP10；MMP11；MMP12；MMP13；MMP14；MMP15； MMP16；MMP17；MMP19；MMP20；MMP23；MMP24；MMP26； 和MMP27。

在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶是与切割CM2的SP蛋 白酶不同的SP蛋白酶。在一些实施方案中，所述至少一种额外SP蛋 白酶选自uPA；matriptase；活化蛋白C；组织蛋白酶A；组织蛋白酶 G；糜蛋白酶；凝血因子蛋白酶，诸如例如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa；弹性蛋白酶；颗粒酶B；Guanidinobenzoatase；HtrA1；人中性 粒细胞弹性蛋白酶；乳铁蛋白；Marapsin；NS3/4A；PACE4；纤溶酶； PSA；tPA；凝血酶；类胰蛋白酶；II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)，诸 如例如DESC1、DPP-4、FAP、Hepsin、Matriptase-2、TMPRSS2、TMPRSS3 和/或TMPRSS4。

在一些实施方案中，至少一种额外蛋白酶选自表6中所示的那些。

表6：示例性蛋白酶和/或酶

本发明还提供包括至少第一CM1和第二CM2且与试剂缀合的抗 体。在一些实施方案中，第一CM1和第二CM2各自是不超过15个氨 基酸长的多肽。在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体， 其未切割状态下具有如下的从N-端至C-端的结构排列： MM-CM1-CM2-AB-试剂、试剂-AB-CM2-CM1-MM、 MM-CM2-CM1-AB-试剂或试剂-AB-CM1-CM2-MM。在一些实施方案 中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其未切割状态下具有如下的从 N-端至C-端的结构排列：试剂-MM-CM1-CM2-AB、AB-CM2-CM1-MM- 试剂、试剂-MM-CM2-CM1-AB或AB-CM1-CM2-MM-试剂。在一些实 施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其未切割状态下具有如 下的从N-端至C-端的结构排列：试剂-MM-CM1-CM2-AB-试剂、试剂-AB-CM2-CM1-MM-试剂、试剂-MM-CM2-CM1-AB-试剂或试剂 -AB-CM1-CM2-MM-试剂。

在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其包含掩 蔽部分(MM)、第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且未切割状态下 的抗体具有如下的从N-端至C-端的结构排列： MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-试剂、试剂-AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM、 MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB-试剂或试剂 -AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM。在一些实施方案中，LP1和LP2各自是 约1-20个氨基酸长的肽。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此 相同。

在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其包含掩 蔽部分(MM)、第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且未切割状态下 的抗体具有如下的从N-端至C-端的结构排列：试剂 -MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB、AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM-试剂、试 剂-MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB或AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-试剂。 在一些实施方案中，LP1和LP2各自是约1-20个氨基酸长的肽。在一 些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。

在一些实施方案中，可活化抗体是缀合的可活化抗体，其包含掩 蔽部分(MM)、第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且未切割状态下 的抗体具有如下的从N-端至C-端的结构排列：试剂 -MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-试剂、试剂 -AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM-试剂、试剂 -MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB-试剂或试剂 -AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-试剂。在一些实施方案中，LP1和LP2 各自是约1-20个氨基酸长的肽。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。

在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括CM1和CM2之间的 连接肽(LP′)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括掩蔽部分(MM) 和CM1之间的连接肽(LP″)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包 括CM2和AB之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，缀合的可活化 抗体包括MM和CM1之间的连接肽(LP″)和CM2和AB之间的连接肽 (LP″′)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括MM和CM1之间 的连接肽(LP″)和CM1和CM2之间的连接肽(LP′)。在一些实施方案中， 缀合的可活化抗体包括CM1和CM2之间的连接肽(LP′)和CM2和AB 之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括MM 和CM1之间的连接肽(LP″)、CM1和CM2之间的连接肽(LP′)和CM2 和AB之间的连接肽(LP″′)。

在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括CM1和CM2之间的 连接肽(LP′)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括AB和CM1 之间的连接肽(LP″)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括CM2 和掩蔽部分(MM)之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，缀合的可活 化抗体包括AB和CM1之间的连接肽(LP″)和CM2和MM之间的连接 肽(LP″′)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括AB和CM1之间 的连接肽(LP″)和CM1和CM2之间的连接肽(LP′)。在一些实施方案中， 缀合的可活化抗体包括CM1和CM2之间的连接肽(LP′)和CM2和MM 之间的连接肽(LP″′)。在一些实施方案中，缀合的可活化抗体包括AB 和CM1之间的连接肽(LP″)、CM1和CM2之间的连接肽(LP′)和CM2 和MM之间的连接肽(LP″′)。

在一些实施方案中，LP′是GG。在一些实施方案中，LP′是GGSGGS (SEQ ID NO：350)。

在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一种包含选自以下的氨 基酸序列：(GS)

在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一种包含选自以下的氨 基酸序列：GGSG(SEQ ID NO：383)、GGSGG(SEQ ID NO：384)、GSGSG (SEQ ID NO：385)、GSGGG(SEQ ID NO：386)、GGGSG(SEQ ID NO：387) 和GSSSG(SEQ ID NO：388)。

在一些实施方案中，LP1包含氨基酸序列GSSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO：389)、GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO：390)、GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO：391)、GSSGGSGGSGGSGGGS(SEQID NO：392)、 GSSGGSGGSG(SEQ ID NO：393)或GSSGGSGGSGS(SEQ ID NO：394)。

在一些实施方案中，LP2包含氨基酸序列GSS、GGS、GGGS(SEQ ID NO：395)、GSSGT(SEQ ID NO：396)或GSSG(SEQ ID NO：397)。

在一些实施方案中，CM1-CM2底物连接或以其它方式附接至抗体。 例如，CM1-CM2用于将一个或多个试剂连接至结合给定靶标的抗体或 其抗原结合片段(AB)，使得当暴露于MMP和/或SP时CM1-CM2被切 割，且从AB释放试剂。示例性靶标包括但不限于表1中所示的靶标。 示例性AB包括但不限于表2中所示的抗体。

在一些实施方案中，AB对于结合靶标具有约100nM或更低的解 离常数。

在一些实施方案中，抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结 合片段。在一些实施方案中，结合靶标的抗体或其免疫活性片段是单 克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab′)

在一些实施方案中，MM与AB结合的解离常数不大于AB与靶标 的解离常数。

在一些实施方案中，在切割状态下，MM不干扰AB结合靶标或不 与AB竞争结合靶标。

在一些实施方案中，MM是约2-40个氨基酸长的多肽。例如，MM 是最多达约40个氨基酸长的多肽。

在一些实施方案中，MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体的 多肽序列不同。在一些实施方案中，MM多肽序列与AB的任何天然结 合配偶体具有不多于50％的同一性。在一些实施方案中，MM多肽序 列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于40％、30％、25％、20％、 15％或10％同一性。

在一些实施方案中，与AB或可活化抗体的AB缀合的试剂是治疗 剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中， 所述试剂是毒素或其片段。如本文所用，毒素的片段是保留毒性活性 的片段。在一些实施方案中，试剂经由可切割接头与AB缀合。在一些 实施方案中，试剂经由包括至少一种CM1-CM2底物序列的接头与AB 缀合。在一些实施方案中，试剂经由不可切割接头与AB缀合。在一些 实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，试剂是核酸损 伤剂，诸如DNA烷化剂或DNA嵌入剂，或其它DNA损伤剂。在一些实施方案中，试剂是选自表3中所列的试剂。在一些实施方案中， 试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。 在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案 中，试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单 甲基阿里他汀D(MMAD)。在一些实施方案中，试剂是美登木素生物 碱或美登木素生物碱衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。 在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些 实施方案中，试剂是加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物。在一些 实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂

在一些实施方案中，试剂是抗炎剂。

在一些实施方案中，抗体和/或可活化抗体还包括可检测部分。在 一些实施方案中，可检测部分是诊断剂。

在一些实施方案中，缀合的抗体和/或缀合的可活化抗体包括可检 测标记。在一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、 荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。 在一些实施方案中，成像剂包含放射性同位素。在一些实施方案中， 放射性同位素是铟或锝。在一些实施方案中，造影剂包含碘、钆或氧 化铁。在一些实施方案中，酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β- 半乳糖苷酶。在一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、 青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、 红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在一些实 施方案中，发光标记包含N-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物。在一 些实施方案中，标记包含Alexa

在一些实施方案中，可活化抗体的抗体和/或AB天然含有一个或 多个二硫键。在一些实施方案中，AB可以进行工程改造以包括一个或 多个二硫键。

在一些实施方案中，抗体和/或缀合的抗体是单特异性的。在一些 实施方案中，抗体和/或缀合的抗体是多特异性的，本文中被称为多特 异性抗体和/或缀合的多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗 体和/或缀合的多特异性抗体是双特异性或三功能性的。在一些实施方 案中，抗体和/或缀合的抗体被配制为前双特异性T-细胞接合者(前BITE)分子的一部分。在一些实施方案中，抗体和/或缀合的抗体被配制 为前嵌合抗原受体(前CAR)修饰的T-细胞或其它工程改造的受体或其 它免疫效应细胞、诸如CAR修饰的NK细胞的一部分。在一些实施方 案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为前嵌合抗原受体 (CAR)修饰的T-细胞的一部分。在一些实施方案中，可活化抗体和/或 缀合的可活化抗体被配制为前嵌合抗原受体(CAR)修饰的NK细胞的一 部分。

在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是单特异 性的。在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体是多特 异性的，在本文中被称为多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可 活化抗体。如本文所用，除非另有说明，术语诸如“可活化抗体”及 其所有语法变体旨在涵盖但不限于其中可活化抗体是本发明的多特异性可活化抗体的实施方案。如本文所用，除非另有说明，术语诸如“缀 合的可活化抗体”及其所有语法变体旨在涵盖但不限于其中缀合的可 活化抗体是本发明的缀合的多特异性可活化抗体的实施方案。在一些 实施方案中，多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体是 双特异性或三功能性的。在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的 可活化抗体被配制为前双特异性T-细胞接合者(前BITE)分子的一部分。 在一些实施方案中，可活化抗体和/或缀合的可活化抗体被配制为前嵌 合抗原受体(前CAR)修饰的T-细胞或其它工程改造的受体的一部分。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、抗体缀合物、可活化抗体、 缀合的可活化抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化 抗体与一种或多种额外试剂或额外试剂的组合结合使用。合适的额外 试剂包括用于预期应用、诸如例如癌症的当前药物和/或手术疗法。例 如，可活化抗体、缀合的可活化抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合 的多特异性可活化抗体可以与额外化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。

在一些实施方案中，可活化抗体是多特异性可活化抗体。本文提 供的多特异性可活化抗体是这样的多特异性抗体，其识别两种或更多 种不同的抗原或表位，且包括至少一个掩蔽部分(MM)，所述掩蔽部分 与多特异性抗体的至少一个抗原或表位结合结构域连接，使得MM的 偶联降低抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力。在一些实施方案 中，MM经由起至少一种MMP蛋白酶和至少一种SP蛋白酶的底物的 作用的CM1-CM2底物与多特异性抗体的抗原或表位结合结构域偶联。 本文提供的可活化多特异性抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/ 或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活 化时展现与相应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与靶标的结合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、 VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VHCDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列 SYAMS(SEQ ID NO：398)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列 SIDPEGRQTYYADSVKG(SEQ ID NO：399)的VH CDR2序列；和至少 包括氨基酸序列DIGGRSAFDY(SEQ ID NO：400)的VH CDR3序列， 及其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VL CDR1序列、 VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2 序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列 RASQSISSY(SEQ ID NO：401)的VLCDR1序列；至少包括氨基酸序列 AASSLQS(SEQ ID NO：402)的VL CDR2序列；至少包括氨基酸序列 QQTVVAPPL(SEQ ID NO：403)的VL CDR3序列，及其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、 VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VHCDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列 SYAMS(SEQ ID NO：398)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括 与氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG(SEQ ID NO：399)具有至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多 同一性的序列的VH CDR2序列；包括与氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQ ID NO：400)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的VH CDR3序列，及其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VL CDR1序列、 VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2 序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列 RASQSISSY(SEQ ID NO：401)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的VL CDR1序列； 包括与氨基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：402)具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列 的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列QQTVVAPPL(SEQ ID NO：403) 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％ 或更多同一性的序列的VL CDR3序列，及其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、 VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和 VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列至少包括氨基酸序列 SYAMS(SEQ ID NO：398)；VH CDR2序列至少包括氨基酸序列 SIDPEGRQTYYADSVKG(SEQ ID NO：399)；VH CDR3序列至少包括 氨基酸序列DIGGRSAFDY(SEQ ID NO：400)；VL CDR1序列至少包括 氨基酸序列RASQSISSY(SEQ IDNO：401)；VL CDR2序列至少包括氨 基酸序列AASSLQS(SEQ ID NO：402)；且VL CDR3序列至少包括氨基 酸序列QQTVVAPPL(SEQ ID NO：403)。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、 VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和 VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列包括与氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO：398)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或更多同一性的序列；VH CDR2序列包括与氨基酸 序列SIDPEGRQTYYADSVKG(SEQ ID NO：399)具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列； VH CDR3序列包括与氨基酸序列DIGGRSAFDY(SEQ ID NO：400)具 有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％ 或更多同一性的序列；VL CDR1序列包括与氨基酸序列RASQSISSY (SEQ ID NO：401)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或更多同一性的序列；VL CDR2序列包括与氨基酸序 列AASSLQS(SEQ ID NO：402)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；且VL CDR3序列 包括与氨基酸序列QQTVVAPPL(SEQ ID NO：403)具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合表皮生长因子受体(EGFR)，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列 和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO：404)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列 VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO：405)的VH CDR2序列；至少包括 氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO：406)的VH CDR3序列；及 其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合EGFR，且含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VLCDR3序列的 组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的至少一 个选自至少包括氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO：407)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO：408)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列QQNNNWPTT(SEQ ID NO：409) 的VL CDR3序列，及其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合EGFR，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VHCDR3序列的 组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少 一个选自包括与氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO：404)具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性 的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO：405)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的VH CDR2序列；包括与氨基 酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO：406)具有至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的VH CDR3序列；及其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合EGFR，且含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VLCDR3序列的 组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少 一个选自包括与氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO：407)具有至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多 同一性的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO：408)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序 列QQNNNWPTT(SEQ ID NO：409)具有至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列的VLCDR3 序列，及其组合。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合EGFR，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、 VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1 序列至少包括氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO：404)；VH CDR2序列至 少包括氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQID NO：405)；VH CDR3序列至少包括氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO：406)； VL CDR1序列至少包括氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO：407)； VL CDR2序列至少包括氨基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO：408)；且 VL CDR3序列至少包括氨基酸序列QQNNNWPTT(SEQ ID NO：409)。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结 合EGFR，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、 VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1 序列包括与氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO：404)具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列； VH CDR2序列包括与氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQID NO：405)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多同一性的序列；VH CDR3序列包括与氨基酸序列 ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO：406)具有至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列；VL CDR1序列包括与氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO：407)具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性 的序列；VL CDR2序列包括与氨基酸序列KYASESIS(SEQ ID NO：408) 具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％ 或更多同一性的序列；且VL CDR3序列包括与氨基酸序列 QQNNNWPTT(SEQ ID NO：409)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的序列。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，含有包含选自SEQID NO：1-17、22、469-471、483-490、 515-522、555和557的氨基酸序列的CM1-CM2底物，和包含本文公 开的抗Jagged抗体的氨基酸序列的抗Jagged抗体。在一些实施方案中， 本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明 的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，含有包含选 自SEQ ID NO：1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的 氨基酸序列的CM1-CM2底物，和具有包含氨基酸序列SEQ ID NO：162或SEQ ID NO：164的轻链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：163的重链的抗体。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括SEQ IDNO：67的重链氨基酸序列和选自SEQ ID NO：420、422、424、426、428、430、432、434、436、439、477、479、 507-514、539-546、561和562的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，含有包含选自SEQID NO：1-17、22、469-471、483-490、 515-522、555和557的氨基酸序列的CM1-CM2底物，和包含本文公 开的抗EGFR抗体的氨基酸序列的抗EGFR抗体。在一些实施方案中， 本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，包括但不限于本发明 的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，含有包含选 自SEQ ID NO：1-17、22、469-471、483-490、515-522、555和557的 氨基酸序列的CM1-CM2底物，和具有包含氨基酸序列SEQ ID NO：111 的轻链和包含氨基酸序列SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：110的重链的抗体。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括SEQ IDNO：108的重链氨基酸序列和选自SEQ ID NO：449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、472、 474、499-506、531-538、559和560的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括与SEQ IDNO：67的氨基酸序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性 的重链氨基酸序列和与选自SEQ ID NO：420、422、424、426、428、430、 432、434、436、439、477、479、507-514、539-546、561和562的氨 基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体，包括但不限于本发明的多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性 可活化抗体，至少包括与SEQ IDNO：108的氨基酸序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性 的重链氨基酸序列和与选自SEQ ID NO：449、451、453、455、457、459、 461、463、465、467、472、474、499-506、531-538、559和560的氨 基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。在一些 实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是抗肿瘤 剂。在一些实施方案中，所述试剂是毒素或其片段。在一些实施方案 中，试剂经由接头与AB缀合。在一些实施方案中，接头是可切割接头。 在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，试剂是 核酸损伤剂，诸如DNA烷化剂或DNA嵌入剂，或其它DNA损伤剂。 在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，试剂经 由包括至少一种CM1-CM2底物序列的接头与AB缀合。在一些实施方 案中，试剂是选自表3中所列的试剂。在一些实施方案中，试剂是多 拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些 实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，试 剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿 里他汀D(MMAD)。在一些实施方案中，试剂是美登木素生物碱或美 登木素生物碱衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。在 一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实 施方案中，试剂是加利车霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂 是吡咯并苯并二氮杂

在一些实施方案中，试剂是抗炎剂。

在一些实施方案中，可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施 方案中，可检测部分是诊断剂。

在一些实施方案中，缀合的抗体包括可检测标记。在一些实施方 案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染 料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在一些实施方案中，成 像剂包含放射性同位素。在一些实施方案中，放射性同位素是铟或锝。 在一些实施方案中，造影剂包含碘、钆或氧化铁。在一些实施方案中， 酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在一些实施方 案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色 荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2 (RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在一些实施方案中，发光标记包 含N-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物。在一些实施方案中，标记包 含Alexa

在一些实施方案中，可活化抗体还包括信号肽。在一些实施方案 中，信号肽经由间隔区与可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔 区在信号肽不存在的情况下与可活化抗体缀合。在一些实施方案中， 间隔区直接连接至可活化抗体的MM。在一些实施方案中，间隔区以 间隔区-MM-CM1-CM2底物-AB的N-端至C-端的结构排列直接连接至 可活化抗体的MM。直接连接至可活化抗体的MM的N-端的间隔区的 实例是选自以下的氨基酸序列：QGQSGQ(SEQ ID NO：410)、GQSGQ (SEQ ID NO：416)、QSGQ(SEQ ID NO：417)、SGQ(SEQ ID NO：418)、GQ和Q。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO：410)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列 GQSGQ(SEQ ID NO：416)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基 酸序列QSGQ(SEQ ID NO：417)。在一些实施方案中，间隔区至少包括 氨基酸序列SGQ(SEQ ID NO：418)。在一些实施方案中，间隔区至少包 括氨基酸序列GQ。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列Q。

在一些实施方案中，可活化抗体的AB天然含有一个或多个二硫键。 在一些实施方案中，AB可以进行工程改造以包括一个或多个二硫键。

在一些实施方案中，可活化抗体的血清半衰期比相应的抗体的血 清半衰期更长；例如，可活化抗体的pK比相应的抗体的pK更长。在 一些实施方案中，可活化抗体的血清半衰期类似于相应的抗体的血清 半衰期。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清 半衰期是至少15天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化 抗体的血清半衰期是至少12天。在一些实施方案中，当施用于生物体 时，可活化抗体的血清半衰期是至少11天。在一些实施方案中，当施 用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少10天。在一些实施方 案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少9天。在 一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至 少8天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清 半衰期是至少7天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化 抗体的血清半衰期是至少6天。在一些实施方案中，当施用于生物体 时，可活化抗体的血清半衰期是至少5天。在一些实施方案中，当施 用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少4天。在一些实施方 案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少3天。在 一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至 少2天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清 半衰期是至少24小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活 化抗体的血清半衰期是至少20小时。在一些实施方案中，当施用于生 物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少18小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少16小时。在一些 实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少14 小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半 衰期是至少12小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化 抗体的血清半衰期是至少10小时。在一些实施方案中，当施用于生物 体时，可活化抗体的血清半衰期是至少8小时。在一些实施方案中， 当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少6小时。在一些 实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少4 小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半 衰期是至少3小时。

本发明还提供包括可活化抗体的组合物和方法，所述可活化抗体 包括特异性结合给定靶标的抗体或抗体片段(AB)，其中AB与降低AB1 结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM)偶联。在一些实施方案中，可活化 抗体还包括作为至少一种MMP和至少一种SP的底物的CM1-CM2底 物。本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂连接至AB 中的一个或多个半胱氨酸残基，而不损害可活化抗体的活性(例如，掩 蔽、活化或结合活性)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法 使得能够将一种或多种试剂连接至AB中的一个或多个半胱氨酸残基， 而不减少或以其它方式干扰MM内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生可活化抗体，其与一种或多种试剂，例如多种治疗 剂、诊断剂和/或预防剂中的任一种缀合，例如，在一些实施方案中， 没有任何试剂与可活化抗体的MM缀合。本文提供的组合物和方法产 生缀合的可活化抗体，其中MM保留有效且有效地掩蔽未切割状态下 的可活化抗体的AB的能力。本文提供的组合物和方法产生缀合的可活 化抗体，其中可活化抗体在可切割CM1-CM2底物的MMP存在的情况 下仍被活化，即切割。

可活化抗体具有试剂的至少一个缀合点，但在本文提供的方法和 组合物中，少于所有可能的缀合点可用于与试剂缀合。在一些实施方 案中，一个或多个缀合点是涉及二硫键的硫原子。在一些实施方案中， 一个或多个缀合点是涉及链间二硫键的硫原子。在一些实施方案中， 一个或多个缀合点是涉及链间硫化物键的硫原子，但不是涉及链内二 硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是半胱氨酸或 含有硫原子的其它氨基酸残基的硫原子。这样的残基可以天然存在于 抗体结构中，或者可以通过定点诱变、化学转化或错误并入非天然氨 基酸而并入抗体中。

还提供了制备在AB中具有一个或多个链间二硫键和在MM中具 有一个或多个链内二硫键的可活化抗体的缀合物的方法，并且提供与 游离硫醇反应的药物。该方法通常包括用还原剂(诸如例如TCEP)部分 还原可活化抗体中的链间二硫键；和将与游离巯基反应的药物与部分 还原的可活化抗体缀合。如本文所用，术语部分还原是指其中可活化 抗体与还原剂接触且少于所有二硫键，例如少于所有可能的缀合位点 被减少的情况。在一些实施方案中，少于99％、98％、97％、96％、95％、 90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、 35％、30％、25％、20％、15％、10％或少于5％的所有可能的缀合位点 被还原。

在一些实施方案中，提供了将试剂例如药物还原和缀合至可活化 抗体、导致试剂放置的选择性的方法。该方法通常包括用还原剂部分 还原可活化抗体，使得可活化抗体的掩蔽部分或其它非AB部分中的任 何缀合位点不被还原，并将该试剂缀合至AB中的链间硫醇。选择缀合 位点以便允许试剂的期望放置，以允许在期望的位点发生缀合。还原 剂例如为TCEP。通过鉴定产生其中MM保留有效和有效地掩蔽未切 割状态下的可活化抗体的AB的能力的缀合的可活化抗体的条件来鉴 定还原反应条件，诸如例如还原剂与可活化抗体的比率，温育时间， 温育期间的温度，还原反应溶液的pH等。还原剂与可活化抗体的比率 将根据可活化抗体而变化。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体 的比率将范围为约20∶1至1∶1、约10∶1至1∶1、约9∶1至1∶1、约8∶1至 1∶1、约7∶1至1∶1、约6∶1至1∶1、约5∶1至1∶1、约4∶1至1∶1、约3∶1 至1∶1、约2∶1至1∶1、约20∶1至1∶1.5、约10∶1至1∶1.5、约9∶1至1∶1.5、 约8∶1至1∶1.5、约7∶1至1∶1.5、约6∶1至1∶1.5、约5∶1至1∶1.5、约4∶1 至1∶1.5、约3∶1至1∶1.5、约2∶1至1∶1.5、约1.5∶1至1∶1.5或约1∶1至 1∶1.5。在一些实施方案中，比率在约5∶1至1∶1的范围内。在一些实施 方案中，比率在约5∶1至1.5∶1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4∶1至1∶1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4∶1至1.5∶1的范 围内。在一些实施方案中，比率在约8∶1至约1∶1的范围内。在一些实 施方案中，比率在约2.5∶1至1∶1的范围内。

在一些实施方案中，提供了还原可活化抗体的AB中的链间二硫键 和将试剂(例如，含硫醇的试剂，诸如药物)缀合至所得链间硫醇以将试 剂选择性定位在AB上的方法。该方法通常包括用还原剂部分还原AB 以形成至少两个链间硫醇，而不在可活化抗体中形成所有可能的链间 硫醇；和将所述试剂缀合至部分还原的AB的链间硫醇。例如，以还原 剂：可活化抗体的期望比率将可活化抗体的AB在约37℃下部分还原约 1小时。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率将范围为约 20∶1至1∶1、约10∶1至1∶1、约9∶1至1∶1、约8∶1至1∶1、约7∶1至1∶1、 约6∶1至1∶1、约5∶1至1∶1、约4∶1至1∶1、约3∶1至1∶1、约2∶1至1∶1、 约20∶1至1∶1.5、约10∶1至1∶1.5、约9∶1至1∶1.5、约8∶1至1∶1.5、约 7∶1至1∶1.5、约6∶1至1∶1.5、约5∶1至1∶1.5、约4∶1至1∶1.5、约3∶1 至1∶1.5、约2∶1至1∶1.5、约1.5∶1至1∶1.5或约1∶1至1∶1.5。在一些实 施方案中，比率在约5∶1至1∶1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5∶1至1.5∶1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4∶1至1∶1的范 围内。在一些实施方案中，比率在约4∶1至1.5∶1的范围内。在一些实 施方案中，比率在约8∶1至约1∶1的范围内。在一些实施方案中，比率 在约2.5∶1至1∶1的范围内。

含硫醇的试剂可以是例如半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸。还原剂可 以是例如TCEP。在一些实施方案中，可以在缀合之前使用例如柱色谱、 透析或渗滤纯化还原的可活化抗体。在一些实施方案中，在部分还原 后和缀合之前不纯化还原的抗体。

本发明还提供了部分还原的可活化抗体，其中可活化抗体中的至 少一个链间二硫键已用还原剂还原，而不干扰可活化抗体中的任何链 内二硫键，其中可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合 片段(AB)，抑制未切割状态下的可活化抗体的AB与靶标的结合的掩 蔽部分(MM)，和与AB偶联的CM1-CM2底物，其中CM1-CM2底物 是起至少一种MMP和一种SP的底物的作用的多肽。在一些实施方案 中，MM经由CM1-CM2底物与AB偶联。在一些实施方案中，可活化 抗体的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中， 可活化抗体内的MM的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一 些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的N-端至C-端的 结构排列：MM-CM1-CM2底物-AB或AB-CM1-CM2底物-MM。在一 些实施方案中，还原剂是TCEP。

本发明还提供了部分还原的可活化抗体，包括但不限于本发明的 多特异性可活化抗体，其中可活化抗体中的至少一个链间二硫键已用 还原剂还原，而不干扰或以其它方式损害可活化抗体的活性和/或效力， 其中可活化抗体包括特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)， 抑制未切割状态下的可活化抗体的AB与靶标的结合的掩蔽部分(MM)，和与AB偶联的CM1-CM2底物，且CM1-CM2底物是起蛋白酶的底物 作用的多肽。通过非限制性实例，可活化抗体的活性和/或效力是可活 化抗体的掩蔽活性、活化和/或活化的可活化抗体的结合活性。在一些 实施方案中，可活化抗体的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。 在一些实施方案中，可活化抗体内的MM的一个或多个链内二硫键不 被还原剂干扰。在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有 如下的N-端至C-端的结构排列：MM-CM1-CM2底物-AB或 AB-CM1-CM2底物-MM。在一些实施方案中，还原剂是TCEP。

本发明还提供了缀合的可活化抗体，其包括与单甲基阿里他汀D (MMAD)有效负载连接的可活化抗体，其中可活化抗体包括特异性结合 靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)，抑制未切割状态下的可活化抗体 的AB与靶标的结合的掩蔽部分(MM)，和与AB偶联的CM1-CM2底 物，且其中CM1-CM2底物是起至少一种MMP蛋白酶和至少一种SP 蛋白酶的底物的作用的多肽。

在一些实施方案中，可以使用几种用于将试剂附接至AB的方法中 的任一种来缀合MMAD-缀合的可活化抗体：(a)附接至AB的碳水化合 物部分，或(b)附接至AB的巯基，或(c)附接至AB的氨基，或(d)附接 至AB的羧酸酯基团。

在一些实施方案中，MMAD有效负载经由接头与AB缀合。在一 些实施方案中，MMAD有效负载经由接头与AB中的半胱氨酸缀合。 在一些实施方案中，MMAD有效负载经由接头与AB中的赖氨酸缀合。 在一些实施方案中，MMAD有效负载经由接头与AB中的另一残基(诸 如本文公开的那些残基)缀合。在一些实施方案中，所述接头是含硫醇 的接头。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方 案中，所述接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头选自 表5和6中所示的接头。在一些实施方案中，可活化抗体和MMAD有 效载荷经由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头连接。在一些实施方 案中，可活化抗体和MMAD有效载荷经由马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜 氨酸接头连接。在一些实施方案中，可活化抗体和MMAD有效载荷经 由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在 一些实施方案中，可活化抗体和MMAD有效载荷经由马来酰亚胺PEG- 缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接头连接。在一些实施方案中，使用 本文公开的部分还原和缀合技术将MMAD有效载荷与AB缀合。

本发明还提供了包括本文提供的CM1-CM2底物序列中的一种或 多种的多肽和其它较大分子。作为非限制性实例，本文提供的 CM1-CM2底物序列可用于前药组合物及其使用方法中。本文提供的这 些CM1-CM2底物序列也可用于探针和其它检测剂及其使用方法中。例 如，本文提供的CM1-CM2底物序列可以与荧光和其它猝灭剂结合使用 以产生检测剂，诸如成像剂和/或其它诊断剂。本领域普通技术人员将 理解本文提供的CM1-CM2底物序列可用于本领域使用可由至少一种 MMP和至少一种SP切割的底物的任何组合物和/或方法中。

本发明还提供了编码本文所述的抗体和/或可活化抗体的分离的核 酸分子，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本发明提供了通过在 导致表达抗体和/或可活化抗体的条件下培养细胞来产生抗体和/或可 活化抗体的方法，其中所述细胞包含这样的载体。

本发明提供了通过如下制造本发明的结合给定靶标的缀合的抗体 的方法：(a)在导致表达所述抗体的条件下培养包含编码所述抗体的核 酸构建体的细胞，(i)其中所述抗体包括CM1-CM2底物，且(ii)其中所 述CM1-CM2底物是起基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的底物作用的 多肽；(b)回收所述抗体；和(c)将回收的抗体与一种或多种额外试剂缀 合。

本发明还提供了通过如下制造本发明的在活化状态下结合给定靶 标的可活化抗体的方法：(a)在导致表达所述可活化抗体的条件下培养 包含编码所述可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中可活化抗体包含 掩蔽部分(MM)、CM1-CM2底物和特异性结合靶标的抗体或其抗原结 合片段(AB)，(i)其中CM1-CM2底物是起MMP和SP的底物的作用的 多肽；且(ii)其中CM1-CM2底物位于可活化抗体中，使得在未切割状 态下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，且在切割状态下，MM不干 扰AB特异性结合靶标或竞争AB特异性结合靶标；和(b)回收可活化 抗体。

本发明还提供了通过如下制造本发明的在活化状态下结合给定靶 标的缀合的可活化抗体的方法：(a)在导致表达所述可活化抗体的条件 下培养包含编码所述可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中可活化抗 体包含掩蔽部分(MM)、CM1-CM2底物和特异性结合靶标的抗体或其 抗原结合片段(AB)，(i)其中CM1-CM2底物是起MMP和SP的底物的 作用的多肽；且(ii)其中CM1-CM2底物位于可活化抗体中，使得在未 切割状态下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，且在切割状态下， MM不干扰AB特异性结合靶标或竞争AB特异性结合靶标；(b)回收 所述可活化抗体；和(c)将回收的抗体与一种或多种额外试剂缀合。

本发明提供了通过将治疗有效量的本文所述的缀合的抗体、可活 化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于有需要的受试者来在受试者中预 防靶标相关的疾病、延迟靶标相关的疾病的进展、治疗靶标相关的疾 病、减轻靶标相关的疾病的症状或以其它方式改善靶标相关的疾病的 方法。

本发明提供了通过将治疗有效量的本文所述的缀合的抗体、可活 化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于有需要的受试者来在受试者中预 防炎症和/或炎性病症、延迟炎症和/或炎性病症的进展、治疗炎症和/ 或炎性病症、减轻炎症和/或炎性病症的症状或以其它方式改善炎症和/ 或炎性病症的方法。本发明还提供了通过将治疗有效量的本文所述的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于有需要的受试 者来在受试者中预防癌症、延迟癌症的进展、治疗癌症、减轻癌症的 症状或以其它方式改善癌症的方法。本发明还提供了通过将治疗有效 量的本文所述的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用 于有需要的受试者来在受试者中预防自身免疫学疾病、延迟自身免疫 学疾病的进展、治疗自身免疫学疾病、减轻自身免疫学疾病的症状或 以其它方式改善自身免疫学疾病的方法。

在这些方法和用途的任何实施方案中使用的缀合的抗体、可活化 抗体和/或缀合的可活化抗体可以在疾病的任何阶段施用。例如，这样 的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以施用于患有任 何阶段的癌症(从早期至转移)的患者。术语受试者和患者在本文可互换 使用。

在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如人、非人灵长 类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在 一些实施方案中，所述受试者是啮齿动物。在一些实施方案中，受试 者是人。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物。在一些实施方案中， 受试者是兽医护理的动物。

将缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体及其治疗制剂 施用于患有或易患异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症的受试者。 使用本领域已知的各种方法中的任一种鉴定患有或易患异常靶标表达 和/或活性相关的疾病或病症的受试者。例如，使用各种临床和/或实验 室测试(诸如身体检查和血液、尿液和/或粪便分析)中的任一种来鉴定 患有癌症或其它肿瘤病况的受试者以评估健康状况。例如，使用各种 临床和/或实验室测试(诸如身体检查和/或体液分析，例如血液、尿液和 /或粪便分析)中的任一种来鉴定患有炎症和/或炎性病症的受试者，以评 估健康状况。

如果实现各种实验室或临床目标中的任一种，则将缀合的抗体、 可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于患有与异常靶标表达和/或 活性相关的疾病或病症被认为是成功的。例如，如果与疾病或病症相 关的症状中的一种或多种得到缓解、减少、抑制或不进展至进一步(即 更差)状态，则将缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用 于患有与异常靶标表达和/或活性相关的疾病或病症被认为是成功的。 如果疾病或病症进入缓解或不进展至进一步(即更差)状态，则将缀合的 抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于患有与异常靶标表达 和/或活性相关的疾病或病症被认为是成功的。

在一些实施方案中，本文所述的抗体、缀合的抗体、可活化抗体 和/或缀合的可活化抗体与一种或多种额外试剂或额外试剂的组合结合 使用。合适的额外试剂包括用于预期应用、诸如例如癌症的当前药物 和/或手术疗法。例如，抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可 活化抗体可以与额外化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。

在一些实施方案中，所述额外试剂是化学治疗剂，诸如选自多西 他赛、紫杉醇、abraxane(即，白蛋白缀合的紫杉醇)、多柔比星、奥沙 利铂、卡铂、顺铂、伊立替康和吉西他滨的化学治疗剂。

在一些实施方案中，所述额外试剂是检查点抑制剂、激酶抑制剂、 靶向肿瘤微环境中的抑制剂的试剂和/或T-细胞或NK激动剂。在一些 实施方案中，所述额外试剂是单独或与其它额外试剂诸如化学治疗剂 或抗肿瘤剂组合的放射疗法。在一些实施方案中，所述额外试剂是疫 苗、肿瘤病毒和/或DC-活化剂，诸如，通过非限制性实例的方式，toll 样受体(TLR)激动剂和/或α-CD40。在一些实施方案中，所述额外试剂 是设计为经由ADCC或经由与毒素的直接缀合(例如，抗体药物缀合物 (ADC))杀死肿瘤的肿瘤靶向抗体。

在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是选自CTLA-4、LAG-3、 PD-1、PD-1、TIGIT、TIM-3、B7H4、BTLA和Vista的靶标的抑制剂。 在一些实施方案中，所述激酶抑制剂选自B-RAFi、MEKi和Btk抑制 剂，诸如依鲁替尼。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是克里唑替尼。在一些实施方案中，所述肿瘤微环境抑制剂选自IDO抑制剂、α -CSF1R抑制剂、α-CCR4抑制剂、TGF-β、骨髓衍生的抑制细胞或T 调节细胞。在一些实施方案中，所述激动剂选自Ox40、GITR、CD137、 ICOS、CD27和HVEM。

在一些实施方案中，所述抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施 方案中，所述抑制剂是LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制 剂是PD-1抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是PD-1抑制剂。 在一些实施方案中，所述抑制剂是TIGIT抑制剂。在一些实施方案中， 所述抑制剂是TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是B7H4 抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是Vista抑制剂。在一些实施 方案中，所述抑制剂是B-RAFi抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制 剂是MEKi抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是Btk抑制剂。 在一些实施方案中，所述抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，所 述抑制剂是克里唑替尼。在一些实施方案中，所述抑制剂是IDO抑制 剂。在一些实施方案中，所述抑制剂是α-CSF1R抑制剂。在一些实施 方案中，所述抑制剂是α-CCR4抑制剂。在一些实施方案中，所述抑 制剂是TGF-β。在一些实施方案中，所述抑制剂是骨髓衍生的抑制细 胞。在一些实施方案中，所述抑制剂是T调节细胞。

在一些实施方案中，所述激动剂是Ox40。在一些实施方案中，所 述激动剂是GITR。在一些实施方案中，所述激动剂是CD137。在一些 实施方案中，所述激动剂是ICOS。在一些实施方案中，所述激动剂是 CD27。在一些实施方案中，所述激动剂是HVEM。

在一些实施方案中，所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀 合的可活化抗体在治疗期间和/或之后与一种或多种额外试剂组合施用， 所述额外试剂诸如例如化学治疗剂、抗炎剂和/或免疫抑制剂。在一些 实施方案中，将所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活 化抗体和额外试剂配制于单一治疗组合物中，且同时施用所述抗体、 缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。可选地， 所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试 剂彼此分开，例如，各自配制于分开的治疗组合物中，且同时施用所 述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂， 或在治疗方案期间在不同的时间施用所述抗体、缀合的抗体、可活化 抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。例如，在施用额外试剂之前 施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体，在 施用额外试剂之后施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合 的可活化抗体，或以交替的方式施用所述抗体、缀合的抗体、可活化 抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。如本文所述，以单剂量或多 剂量施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体 和额外试剂。

在一些实施方案中，同时施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗 体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。例如，所述抗体、缀合的抗体、 可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂可以配制在单一组合物 中或作为两种或更多种分开的组合物施用。在一些实施方案中，依次 施用所述抗体、缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额 外试剂，或者在治疗方案期间在不同的时间施用所述抗体、缀合的抗 体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂。

在一些实施方案中，在治疗期间和/或之后将所述缀合的抗体、可 活化抗体和/或缀合的可活化抗体与一种或多种额外试剂组合施用，所 述额外试剂诸如(通过非限制性实例的方式)，抗炎剂、免疫抑制剂、 化学治疗剂，诸如烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、 细胞毒性抗生素和/或任何其它核酸损伤剂。在一些实施方案中，所述 额外试剂是紫杉烷，诸如紫杉醇(例如，

在一些实施方案中，所述额外试剂是抗体、另一缀合的抗体、另 一可活化抗体和/或另一缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，所述 额外试剂是与第一缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体针 对相同的靶标的抗体、另一缀合的抗体、另一可活化抗体和/或另一缀 合的可活化抗体。在一些实施方案中，所述额外试剂是针对与第一缀 合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的靶标不同的靶标的抗 体、另一缀合的抗体、另一可活化抗体和/或另一缀合的可活化抗体。

在一些实施方案中，同时施用所述缀合的抗体、可活化抗体和/或 缀合的可活化抗体和额外试剂。例如，所述缀合的抗体、可活化抗体 和/或缀合的可活化抗体和额外试剂可以配制在单一组合物中或作为两 种或更多种分开的组合物施用。在一些实施方案中，依次施用所述缀 合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和额外试剂，或者在治 疗方案期间在不同的时间施用所述抗体和/或缀合的抗体和额外试剂。 例如，在施用额外试剂之前施用所述抗体和/或缀合的抗体，在施用额 外试剂之后施用所述抗体和/或缀合的抗体，或以交替的方式施用所述 抗体和/或缀合的抗体和额外试剂。如本文所述，以单剂量或多剂量施 用所述抗体和/或缀合的抗体和额外试剂。

本发明还提供了用于在各种诊断和/或预防适应症中使用缀合的抗 体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的方法和试剂盒。

根据本发明的药物组合物可以包括本发明的抗体、缀合的抗体、 可活化抗体和/或缀合的可活化抗体和载体。这些药物组合物可以包括 在试剂盒诸如例如诊断试剂盒中。

综上，本申请提供了如下具体实施方案：

1.一种包含CM1-CM2底物的分离的多肽，所述CM1-CM2底物 包含作为至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的至少第一可切割部 分(CM1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物的至少第二可切割 部分(CM2)。

2.实施方案1的分离的多肽，其中CM1和CM2经由连接肽连接。

3.实施方案1的分离的多肽，其中CM1和CM2共有至少一个氨 基酸残基。

4.实施方案1的分离的多肽，其中CM1和CM2彼此直接连接。

5.实施方案1-4中任一项的分离的多肽，其中所述CM1-CM2底 物包含选自SEQ IDNO：1-17、22、469-471、483-490、515-522、555 和557的氨基酸序列。

6.实施方案1-5中任一项的分离的多肽，其中所述MMP是MMP2、 MMP9或MMP14。

7.实施方案1-6中任一项的分离的多肽，其中所述SP是uPA或 matriptase。

8.一种分离的多肽，其包含结合靶标的抗体或其抗原结合片段 (AB)，以及作为至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的至少第一可 切割部分(CM1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物的至少第二 可切割部分(CM2)。

9.实施方案8的分离的多肽，其中CM1和CM2经由连接肽连接。

10.实施方案8的分离的多肽，其中CM1和CM2共有至少一个氨 基酸残基。

11.实施方案8的分离的多肽，其中CM1和CM2彼此直接连接。

12.实施方案8-11中任一项的分离的多肽，其中所述CM1-CM2 底物包含选自SEQID NO：1-17、22、469-471、483-490、515-522、555 和557的氨基酸序列。

13.实施方案8-12中任一项的分离的多肽，其中所述MMP、SP 或MMP和SP两者与靶标共同定位于组织中。

14.实施方案8-13中任一项的分离的多肽，其中其抗原结合片段 选自Fab片段、F(ab′)2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体和 单结构域轻链抗体。

15.实施方案8-14中任一项的分离的多肽，其中所述AB与所述 CM1连接。

16.实施方案15的分离的多肽，其中所述AB与所述CM1直接连 接。

17.实施方案15的分离的多肽，其中所述AB经由连接肽与所述 CM1连接。

18.实施方案8-14中任一项的分离的多肽，其中所述AB与CM2 连接。

19.实施方案18的分离的多肽，其中所述AB与CM2直接连接。

20.实施方案18的分离的多肽，其中所述AB经由连接肽与所述 CM1连接。

21.实施方案8-20中任一项的分离的多肽，其中所述MMP是 MMP2、MMP9或MMP14。

22.实施方案8-21中任一项的分离的多肽，其中所述SP是uPA 或matriptase。

23.实施方案8-22中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽 包含掩蔽部分(MM)。

24.实施方案8-23中任一项的分离的多肽，其中所述MM与AB 结合的解离常数大于AB与靶标结合的解离常数。

25.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述MM是不超过40 个氨基酸长的多肽。

26.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述MM与所述CM1 连接，使得未切割状态下的分离的多肽包含如下的N-端至C-端的结构 排列：MM-CM1-CM2-AB或AB-CM2-CM1-MM。

27.实施方案26的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含所述MM 和所述CM1之间的连接肽。

28.实施方案26的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含CM2 和所述AB之间的连接肽。

29.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含 CM1和CM2之间的连接肽。

30.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述MM与CM2连接， 使得未切割状态下的分离的多肽包含如下的N-端至C-端的结构排列： MM-CM2-CM1-AB或AB-CM1-CM2-MM。

31.实施方案30的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含所述MM 和CM2之间的连接肽。

32.实施方案30的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含CM1 和所述AB之间的连接肽。

33.实施方案30的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含CM1 和CM2之间的连接肽。

34.实施方案23或24的分离的多肽，其中所述分离的多肽包含第 一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且其中未切割状态下的分离的多肽 具有如下的N-端至C-端的结构排列：MM-LP1-CM1-CM2-LP2-AB、 AB-IP2-CM2-CM1-LP1-MM、MM-LP1-CM2-CM1-LP2-AB或AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM。

35.实施方案34的分离的多肽，其中两个连接肽不需要彼此相同。

36.实施方案34或35的分离的多肽，其中LP1和LP2各自是约 1-20个氨基酸长的肽。

37.实施方案34-36中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽 包含CM1和CM2之间的第三连接肽(LP′)。

38.实施方案23-37中任一项的分离的多肽，其中所述MM的氨基 酸序列不同于所述靶标的氨基酸序列，并且与所述AB的天然结合配偶 体的氨基酸序列具有不超过10％同一性。

39.实施方案23或24的分离的多肽，其中在切割状态下，所述 MM不干扰AB结合靶标或不与AB竞争结合靶标。

40.实施方案8-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽 包含选自SEQ IDNO：420、422、424、426、428、430、432、434、436、 439、477、479、507-514、539-546、561和562的轻链氨基酸序列和 包含SEQ ID NO：67的重链氨基酸序列。

41.实施方案8-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽 包含选自SEQ IDNO：449、451、453、455、457、459、461、463、465、 467、472、474、499-506、531-538、559和560的轻链氨基酸序列和 包含SEQ ID NO：108的重链氨基酸序列。

42.实施方案1-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽 包含选自SEQ IDNO：420、422、424、426、428、430、432、434、436、 439、477、479、507-514、539-546、561和562的氨基酸序列。

43.实施方案1-39中任一项的分离的多肽，其中所述分离的多肽 包含选自SEQ IDNO：449、451、453、455、457、459、461、463、465、 467、472、474、499-506、531-538、559和560的氨基酸序列。

实施方案23-43中任一项的分离的多肽，其中所述MMP是MMP2、 MMP9或MMP14。

44.实施方案23-43中任一项的分离的多肽，其中所述SP是uPA 或matriptase。

45.一种缀合的可活化抗体，其包含与试剂缀合的如实施方案8-44 中任一项中所述的分离的多肽。

46.实施方案45的缀合的可活化抗体，其中所述试剂经由接头与 所述AB缀合。

47.实施方案46的缀合的可活化抗体，其中所述接头是可切割接 头。

48.实施方案46的缀合的可活化抗体，其中所述接头是不可切割 接头。

49.实施方案45-48中任一项的缀合的可活化抗体，其中所述试剂 是毒素或其片段。

50.实施方案45-48中任一项的缀合的可活化抗体，其中所述试剂 是微管抑制剂。

51.实施方案45-48中任一项的缀合的可活化抗体，其中所述试剂 是核酸损伤剂。

52.实施方案49的缀合的可活化抗体，其中所述试剂选自多拉司 他汀或其衍生物、阿里他汀或其衍生物、美登木素或其衍生物、倍癌 霉素或其衍生物和加利车霉素或其衍生物。

53.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是阿里他汀 E或其衍生物。

54.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是单甲基阿 里他汀E(MMAE)。

55.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是单甲基阿 里他汀D(MMAD)。

56.实施方案52的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是选自DM1 和DM4的美登木素。

57.实施方案45的缀合的可活化抗体，其中所述试剂是可检测部 分。

58.实施方案57的缀合的可活化抗体，其中所述可检测部分是诊 断剂。

59.一种药物组合物，其包含如实施方案8-44中任一项中所述的 分离的多肽和载体。

60.实施方案59的药物组合物，其包含额外试剂。

61.实施方案60的药物组合物，其中所述额外试剂是治疗剂。

62.一种分离的核酸分子，其编码如实施方案1-44中任一项中所 述的分离的多肽。

63.一种载体，其包含实施方案62的分离的核酸分子。

64.一种通过在导致如实施方案8-44中任一项中所述的分离的多 肽表达的条件下培养细胞来产生抗体或可活化抗体的方法，其中所述 细胞包含实施方案62的核酸分子。

65.一种制造可活化抗体的方法，所述可活化抗体在活化状态下结 合靶标，所述方法包括：

(a)培养包含编码如实施方案8-44中任一项中所述的分离的多肽 的核酸构建体的细胞；和

(b)回收所述可活化抗体。

66.一种治疗、缓解病症或疾病的症状或延缓病症或疾病的进展的 方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如实施方案8-44中 任一项中所述的分离的多肽、如实施方案45-58中任一项中所述的缀合 的可活化抗体或如实施方案59-61中任一项中所述的药物组合物。

67.实施方案66的方法，其中所述病症或疾病是癌症。

68.实施方案66或实施方案67的方法，其中所述方法包括向所述 受试者施用额外试剂。

69.实施方案68的方法，其中所述额外试剂是治疗剂。

附图说明

图1A和1B是描绘人Jagged 1结合ELISA测定的结果的一系列图， 其表明抗Jagged抗体和掩蔽的且活化的可活化抗体的结合。含有(A) 2001和(B)1001/LP′/0001底物的可活化抗体通过uPA(丝氨酸蛋白酶)、 MMP14(MMP)和uPA与MMP14组合活化。活化的可活化抗体显示与 抗Jagged抗体等同的结合。

图2是描绘在单次5mg/kg静脉内剂量之后的抗Jagged抗体和 1001/LP′/0001和2001可活化抗体的人IgG血清浓度的图。抗Jagged 抗体由于靶标介导的清除而迅速清除。相比之下，抗Jagged可活化抗 体在循环中仍然被掩蔽。

图3是描绘相对于初始剂量后时间绘制的HCC1806肿瘤体积(组平 均值±SEM n＝8)的图。将组在研究的第1天和第8天给药。抗 Jagged-SPDB-DM4抗体和抗Jagged 2001可活化抗体-SPDB-DM4组两 者都显示肿瘤消退，而同种型-SPDB-DM4组未显示肿瘤生长抑制。

图4是描绘相对于初始剂量后时间绘制的初始体重百分比(组平均 值n＝8)的图。将组在研究的第1天和第8天给药。抗 Jagged-SPDB-DM4ADC治疗组中的动物显示显著的体重减轻，而PBS、 同种型-SPDB-DM4ADC和抗Jagged 2001可活化抗体-SPDB-DM4处理 的动物显示没有显著的体重减轻。

图5是描绘在H292异种移植荷瘤小鼠中12.5mg/kg这样的EGFR 可活化抗体的剂量后8天内在血浆中测量的EGFR可活化抗体的体内 活化的图。

图6是描绘在H292异种移植荷瘤小鼠中EGFR活化抗体的体内效 力的图。

图7是描绘在H292异种移植肿瘤微环境中EGFR可活化抗体活化 的原位评估的图。

图8A、8B、8C、8D、8E和8F是描绘用对照静脉内免疫球蛋白(IVIG， 图8A)、抗EGFR抗体西妥昔单抗(图8B)、本文被称为抗EGFR 2001 可活化抗体的抗EGFR可活化抗体(其包括SEQ ID NO：108的重链序列 和SEQ ID NO：449的轻链序列)(图8C)；本文被称为抗EGFR2003可活 化抗体的抗EGFR可活化抗体(其包括SEQ ID NO：108的重链序列和 SEQ ID NO：472的轻链序列)(图8D)；或本文被称为抗EGFR 2005可活 化抗体的抗EGFR可活化抗体(其包括SEQ ID NO：108的重链序列和 SEQ ID NO：474的轻链序列)(图8E)施用后各个时间点的nu/nu小鼠中 H292异种移植肿瘤的肿瘤体积的一系列图。对于图8C和8D中所示的 数据，每组由于体重减轻而损失一只动物。图8F是在单个图中绘制并 比较图8A-8E中呈现的数据的图。

图9是描绘用同种型对照静脉内免疫球蛋白(IVIG)、20mg/kg剂量 的本文被称为4D11的抗Jagged抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序 列和SEQ ID NO：162的轻链序列)、10mg/kg剂量的4D11抗体、5mg/kg 剂量的4D11抗体、本文被称为抗Jagged 2001可活化抗体的抗Jagged 可活化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：420的轻 链序列)、本文被称为抗Jagged 1004/LP′/0001可活化抗体的抗Jagged 可活化抗体(其包括SEQID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：432的轻 链序列)、本文被称为抗Jagged 2003可活化抗体的抗Jagged可活化抗 体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：477的轻链序列)和 本文被称为抗Jagged 2005可活化抗体的抗Jagged可活化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：477的轻链序列)施用后如通 过体重(BW)损失所测量的毒性的图。结果显示为在研究期间的各个时 间点的相对体重(BW)变化百分比(％)。

图10是描绘用同种型对照静脉内免疫球蛋白(IVIG)、20mg/kg剂 量的本文被称为4D11的抗Jagged抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链 序列和SEQ ID NO：162的轻链序列)、10mg/kg剂量的4D11抗体、5 mg/kg剂量的4D11抗体、本文被称为抗Jagged 2001可活化抗体(“2001”) 的抗Jagged可活化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：420的轻链序列)、本文被称为抗Jagged 1004/LP′/0001可活化抗体 的抗Jagged可活化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：432的轻链序列)和本文被称为抗Jagged 1004/LP′/0003可活化抗体 的抗Jagged可活化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ IDNO：424的轻链序列)施用后如通过体重(BW)损失所测量的毒性的图。 结果显示为在研究期间的各个时间点的相对体重(BW)变化百分比(％)。

图11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G和11H以及图12是描 绘当并入本发明的可活化抗EGFR抗体时本发明的各种底物的效力的 一系列图。通过在施用后的各个时间点测量肿瘤体积(TV mm

图13是描绘用对照静脉注射免疫球蛋白(IVIG)、本发明的抗 Jagged抗体和包括本发明的各种底物的本发明的可活化抗Jagged抗体 施用后DBA/1小鼠中根据体重(BW)损失测量毒性的图。

图14是描绘在H292(空心箭头)和FaDu(实心箭头)共同植入的异种 移植肿瘤模型中西妥昔单抗和含有串联底物的两个EGFR可活化抗体 的FLIT-μCT成像数据的3D重构的图。

具体实施方案

本发明提供了包括作为至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的 至少第一可切割部分(CM1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物 的至少第二可切割部分(CM2)的氨基酸序列。这些CM1-CM2底物可用 于各种治疗、诊断和预防性适应症中。例如，这些CM1-CM2底物可用 于可活化抗体，其包括抗体或其抗原结合片段(AB)，其包括与AB的 至少一个抗原或表位结合结构域连接的至少一个掩蔽部分(MM)，使得 MM的偶联降低AB结合其靶标的能力。

本文提供的实施例证明当在特定条件下暴露于至少一种MMP蛋 白酶和/或至少一种SP蛋白酶时，这些CM1-CM2底物表现出许多所需 切割特性。

本发明还提供了包括这些CM1-CM2底物中的一种或多种的抗体。 例如，当将抗体与一种或多种额外试剂缀合以产生缀合的抗体时，这 些CM1-CM2底物是有用的。这些CM1-CM2底物也可用于可活化抗体 和/或可活化抗体缀合物中。

缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括特异性结合 靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)。AB的靶标的示例性类别包括但不 必限于细胞表面受体和分泌的结合蛋白(例如生长因子)、可溶性酶、结 构蛋白(例如胶原、纤连蛋白)等。在一些实施方案中，缀合的抗体和/ 或可活化抗体具有结合细胞外靶标(通常为细胞外蛋白靶标)的AB。在一些实施方案中，缀合的抗体和/或可活化抗体被设计用于细胞摄取并 且在细胞内可切换。

作为非限制性实例，AB是表1中所列的任一靶标的结合配偶体。

表1：示例性靶标

作为非限制性实例，AB是或衍生自表2中所列的抗体。

表2：示例性Ab来源

本发明的示例性缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体 包括例如结合白介素6受体(IL-6R)且包括重链和轻链的抗体，所述抗 体是或衍生自本文被称为“Av1”抗体的抗体，其结合白介素-6受体 (IL-6R)。Av1重链和Av1轻链的氨基酸序列下面分别显示于SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：101中。

Av1抗体重链氨基酸序列：

Av1抗体轻链氨基酸序列：

本发明的示例性可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包括例如结合 白介素6受体(IL-6R)且包括重链和轻链的抗体，所述抗体是或衍生自 Av1抗体和掩蔽部分。本发明的示例性可活化抗体和/或缀合的可活化 抗体包括附接至AV1轻链的N-端的氨基酸序列。这些N-端氨基酸序 列包括，例如，YGSCSWNYVHIFMDC(SEQ ID NO：102)； QGDFDIPFPAHWVPIT(SEQID NO：103)； MGVPAGCVWNYAHIFMDC(SEQ ID NO：104)； QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC(SEQ IDNO：105)； QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT(SEQ ID NO：106)；或 QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC(SEQID NO：107)。还应当理解， 这样的氨基酸序列可以附接至AV1重链的N-端或AV1重链或轻链的 C-端。

本发明的示例性可活化抗体包括，例如，结合表皮生长因子受体 (EGFR)且包括重链和轻链的抗体，所述抗体是和/或衍生自选自以下的 抗体：本文称为“c225v5”抗体的抗体(本文也称为C225v5抗体)、本 文称为“c225v4”抗体的抗体(本文也称为C225v4抗体)和本文称为 “c225v6”抗体的抗体(本文也称为C225v6抗体)，其各自结合EGFR。 c225v5抗体、c225v4抗体和c225v6抗体共有相同的轻链序列，本文称 为“c225轻链”。下面显示c225v5重链、c225v4抗体、c225v6抗体 和c225轻链的氨基酸序列。

C225v5抗体重链氨基酸序列：

C225v4抗体重链氨基酸序列：

C225v6抗体重链氨基酸序列：

C225抗体轻链氨基酸序列：

本发明的示例性缀合抗体和/或可活化抗体包括例如这样的抗体， 其结合Jagged靶标，例如Jagged-1、Jagged-2和/或Jagged-1和Jagged-2 两者，并且包括可变重链区域和可变轻链区域的组合，所述可变重链 区域和可变轻链区域是或衍生自下文所示的可变重链和可变轻链序列。 可变轻链氨基酸序列Lc4

可变重链氨基酸序列Hc4

可变轻链氨基酸序列Lc5

可变重链氨基酸序列Hc5

可变轻链氨基酸序列Lc7

可变重链氨基酸序列Hc7

可变轻链氨基酸序列Lc8

可变重链氨基酸序列Hc8

可变轻链氨基酸序列Lc13

可变重链氨基酸序列Hc13

可变轻链氨基酸序列Lc16

可变重链氨基酸序列Hc16

可变轻链氨基酸序列Lc19

可变重链氨基酸序列Hc19

可变轻链氨基酸序列Lc21

可变重链氨基酸序列Hc21

可变轻链氨基酸序列Lc24

可变重链氨基酸序列Hc24

可变轻链氨基酸序列Lc26

可变重链氨基酸序列Hc26

可变轻链氨基酸序列Lc27

可变重链氨基酸序列Hc27

可变轻链氨基酸序列Lc28

可变重链氨基酸序列Hc28

可变轻链氨基酸序列Lc30

可变重链氨基酸序列Hc30

可变轻链氨基酸序列Lc31

可变重链氨基酸序列Hc31

可变轻链氨基酸序列Lc32

可变重链氨基酸序列Hc32

可变轻链氨基酸序列Lc37

可变重链氨基酸序列Hc37

可变轻链氨基酸序列Lc39

可变重链氨基酸序列Hc39

可变轻链氨基酸序列Lc40

重链氨基酸序列Hc40

可变轻链氨基酸序列Lc47

可变重链氨基酸序列Hc47

可变4B2轻链

可变4B2重链

可变4D11轻链

可变4D11重链

可变4E7轻链

可变4E7重链

可变4E11轻链

可变4E11重链

可变6B7轻链

可变6B7重链

可变6F8轻链

可变6F8重链

本发明的示例性缀合抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体包 括例如这样的抗体，其结合Jagged靶标，例如Jagged-1、Jagged-2和/ 或Jagged-1和Jagged-2两者，并且包括重链区域和轻链区域的组合， 所述重链区域和轻链区域是或衍生自下文所示的重链和轻链序列。

4D11轻链序列：

4D11重链序列：

4D11v2重链序列

4D11v2轻链序列

本文提供的可活化抗体和可活化抗体组合物至少含有特异性结合 靶标(例如，人靶标)的抗体或其抗体片段(在整个本发明中统称为AB)， 其中AB被掩蔽部分(MM)修饰。

在一些实施方案中，选择掩蔽部分用于与特定抗体或抗体片段一 起使用。例如，用于与结合EGFR的抗体一起使用的合适的掩蔽部分 包括包含序列CISPRG(SEQ ID NO：165)的MM。通过非限制性实例的 方式，MM可以包括序列诸如CISPRGC(SEQ ID NO：166)；CISPRGCG (SEQ ID NO：167)；CISPRGCPDGPYVMY(SEQ ID NO：168)； CISPRGCPDGPYVM(SEQID NO：169)，CISPRGCEPGTYVPT(SEQ ID NO：170)和CISPRGCPGQIWHPP(SEQ ID NO：171)。其它合适的掩蔽部 分包括PCT公开号WO 2010/081173中公开的任何EGFR-特异性掩蔽 物，诸如，通过非限制性实例的方式，GSHCLIPINMGAPSC(SEQ ID NO：172)；CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC(SEQ ID NO：173)；CNHHYFYTCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：174)；ADHVFWGSYGCISPRGCPG(SEQ ID NO：175)； CHHVYWGHCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：176)；CPHFTTTSCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：177)； CNHHYHYYCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：178)；CPHVSFGSCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：179)； CPYYTLSYCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：180)；CNHVYFGTCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：181)； CNHFTLTTCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：182)；CHHFTLTTCGCISPRGCPG(SEQ ID NO：183)； YNPCATPMCCISPRGCPG(SEQ ID NO：184)；CNHHYFYTCGCISPRGCG(SEQ ID NO：185)； CNHHYHYYCGCISPRGCG(SEQ ID NO：186)；CNHVYFGTCGCISPRGCG(SEQ ID NO：187)； CHHVYWGHCGCISPRGCG(SEQ ID NO：188)；CPHFTTTSCGCISPRGCG(SEQ ID NO：189)； CNHFTLTTCGCISPRGCG(SEQ ID NO：190)；CHHFTLTTCGCISPRGCG(SEQ ID NO：191)； CPYYTLSYCGCISPRGCG(SEQ ID NO：192)；CPHVSFGSCGCISPRGCG(SEQ ID NO：193)； ADHVFWGSYGCISPRGCG(SEQ ID NO：194)；YNPCATPMCCISPRGCG(SEQ ID NO：195)； CHHVYWGHCGCISPRGCG(SEQ ID NO：196)；C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG(SEQ ID NO：197)；CISPRGCGQPIPSVK(SEQ ID NO：198)； CISPRGCTQPYHVSR(SEQ ID NO：199)；和/或CISPRGCNAVSGLGS (SEQ ID NO：200)。

与结合Jagged靶标、例如Jagged 1和/或Jagged 2的抗体一起使用 的合适的掩蔽部分包括，通过非限制性实例的方式，掩蔽部分，其包 括序列，诸如QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG(SEQ ID NO：201)； QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG(SEQ ID NO：202)； PWCMQRQDFLRCPQP(SEQ ID NO：203)；QLGLPAYMCTFECLR (SEQ ID NO：204)；CNLWVSGGDCGGLQG(SEQ ID NO：205)； SCSLWTSGSCLPHSP(SEQ ID NO：206)；YCLQLPHYMQAMCGR(SEQ ID NO：207)；CFLYSCTDVSYWNNT(SEQ ID NO：208)；PWCMQRQDYLRCPQP(SEQ ID NO：209)；CNLWISGGDCRGLAG (SEQ ID NO：210)；CNLWVSGGDCRGVQG(SEQ ID NO：211)； CNLWVSGGDCRGLRG(SEQ ID NO：212)；CNLWISGGDCRGLPG (SEQ ID NO：213)；CNLWVSGGDCRDAPW(SEQ ID NO：214)；CNLWVSGGDCRDLLG(SEQ ID NO：215)；CNLWVSGGDCRGLQG (SEQ ID NO：216)；CNLWLHGGDCRGWQG(SEQ ID NO：217)； CNIWLVGGDCRGWQG(SEQ ID NO：218)；CTTWFCGGDCGVMRG (SEQ ID NO：219)；CNIWGPSVDCGALLG(SEQ ID NO：220)；CNIWVNGGDCRSFEG(SEQ ID NO：221)；YCLNLPRYMQDMCWA (SEQ ID NO：222)；YCLALPHYMQADCAR(SEQ ID NO：223)； CFLYSCGDVSYWGSA(SEQ ID NO：224)；CYLYSCTDSAFWNNR (SEQ ID NO：225)；CYLYSCNDVSYWSNT(SEQ ID NO：226)； CFLYSCTDVSYW(SEQ ID NO：227)；CFLYSCTDVAYWNSA(SEQ ID NO：228)；CFLYSCTDVSYWGDT(SEQ ID NO：229)； CFLYSCTDVSYWGNS(SEQ ID NO：230)；CFLYSCTDVAYWNNT (SEQ ID NO：231)；CFLYSCGDVSYWGNPGLS(SEQ ID NO：232)； CFLYSCTDVAYWSGL(SEQ ID NO：233)；CYLYSCTDGSYWNST (SEQ ID NO：234)；CFLYSCSDVSYWGNI(SEQ ID NO：235)； CFLYSCTDVAYW(SEQ ID NO：236)；CFLYSCTDVSYWGST(SEQ ID NO：237)；CFLYSCTDVAYWGDT(SEQ ID NO：238)；GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG(SEQ ID NO：239)； GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG(SEQ ID NO：240)； GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG(SEQ ID NO：241)； GCNIWANGGDCRGWIDNIDG(SEQ ID NO：242)； GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG(SEQ ID NO：243)； GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG(SEQ ID NO：244)； GGPALCNIWLNGGDCRGWSG(SEQ ID NO：245)； GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG(SEQ ID NO：246)； GQQQWCNIWINGGDCRGWNG(SEQ ID NO：247)； GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG(SEQ ID NO：248)； GTPGGCNIWANGGDCRGWEG(SEQ ID NO：249)； GASQYCNLWINGGDCRGWRG(SEQ ID NO：250)； GCNIWLVGGDCRPWVEGG(SEQ ID NO：251)； GCNIWAVGGDCRPFVDGG(SEQ ID NO：252)；GCNIWLNGGDCRAWVDTG(SEQ ID NO：253)； GCNIWIVGGDCRPFINDG(SEQ ID NO：254)；GCNIWLNGGDCRPVVFGG(SEQ ID NO：255)； GCNIWLSGGDCRMFMNEG(SEQ ID NO：256)；GCNIWVNGGDCRSFVYSG(SEQ ID NO：257)； GCNIWLNGGDCRGWEASG(SEQ ID NO：258)；GCNIWAHGGDCRGFIEPG(SEQ ID NO：259)； GCNIWLNGGDCRTFVASG(SEQ ID NO：260)；GCNIWAHGGDCRGFIEPG(SEQ ID NO：261)； GFLENCNIWLNGGDCRTG(SEQ ID NO：262)；GIYENCNIWLNGGDCRMG(SEQ ID NO：263)；和/或 GIPDNCNIWINGGDCRYG(SEQ ID NO：264)。

与结合白介素6靶标、例如白介素6受体(IL-6R)的抗体一起使用 的合适的掩蔽部分包括，通过非限制性实例的方式，掩蔽部分，其包 括序列，诸如QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC(SEQ ID NO：265)； QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT(SEQ ID NO：266)；QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC(SEQ ID NO：267)； YRSCNWNYVSIFLDC(SEQ ID NO：268)；PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID NO：269)；ESSCVWNYVHIYMDC(SEQ ID NO：270)；YPGCKWNYDRIFLDC(SEQ ID NO：271)；YRTCSWNYVGIFLDC(SEQ ID NO：272)；YGSCSWNYVHIFMDC(SEQ ID NO：273)； YGSCSWNYVHIFLDC(SEQ ID NO：274)；YGSCNWNYVHIFLDC(SEQ ID NO：275)；YTSCNWNYVHIFMDC(SEQ ID NO：276)； YPGCKWNYDRIFLDC(SEQ ID NO：277)；WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO：278)；WSNCHWNYVHIFLDC(SEQ ID NO：279)；DRSCTWNYVRISYDC(SEQ ID NO：280)；SGSCKWDYVHIFLDC(SEQ ID NO：281)；SRSCIWNYAHIHLDC(SEQ ID NO：282)； SMSCYWQYERIFLDC(SEQ ID NO：283)；YRSCNWNYVSIFLDC(SEQ ID NO：284)；SGSCKWDYVHIFLDC(SEQ ID NO：285)； YKSCHWDYVHIFLDC(SEQ ID NO：286)；YGSCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO：287)；FSSCNWNYVHIFLDC(SEQ ID NO：288)；WRSCNWNYAHIFLDC(SEQ ID NO：289)；YGSCQWNYVHIFLDC (SEQ ID NO：290)；YRSCNWNYVHIFLDC(SEQ ID NO：291)； NMSCHWDYVHIFLDC(SEQ ID NO：292)；FGPCTWNYARISWDC (SEQ ID NO：293)；XXsCXWXYvhIfXdC(SEQ ID NO：294)；MGVPAGCVWNYAHIFMDC(SEQ ID NO：295)； RDTGGQCRWDYVHIFMDC(SEQ ID NO：296)；AGVPAGCTWNYVHIFMEC(SEQ ID NO：297)； VGVPNGCVWNYAHIFMEC(SEQ ID NO：298)；DGGPAGCSWNYVHIFMEC(SEQ ID NO：299)； AVGPAGCWWNYVHIFMEC(SEQ ID NO：300)；CTWNYVHIFMDCGEGEGP(SEQ ID NO：301)； GGVPEGCTWNYAHIFMEC(SEQ ID NO：302)；AEVPAGCWWNYVHIFMEC(SEQ ID NO：303)； AGVPAGCTWNYVHIFMEC(SEQ ID NO：304)；SGASGGCKWNYVHIFMDC(SEQ ID NO：305)； TPGCRWNYVHIFMECEAL(SEQ ID NO：306)；VGVPNGCVWNYAHIFMEC(SEQ ID NO：307)； PGAFDIPFPAHWVPNT(SEQ ID NO：308)；RGACDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO：309)；QGDFDIPFPAHWVPIT(SEQ ID NO：310)；XGafDIPFPAHWvPnT(SEQ ID NO：311)；RGDGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO：312)；SGVGRDRDIPFPAHWVPRT(SEQ ID NO：313)； WAGGNDCDIPFPAHWIPNT(SEQ ID NO：314)；WGDGMDVDIPFPAHWVPVT(SEQ ID NO：315)； AGSGNDSDIPFPAHWVPRT(SEQ ID NO：316)；ESRSGYADIPFPAHWVPRT(SEQ ID NO：317)；和/或 RECGRCGDIPFPAHWVPRT(SEQ ID NO：318)。

当AB用MM修饰且在靶标存在的情况下时，与未用MM修饰的 AB的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标 的特异性结合被降低或抑制。

用MM修饰的AB对靶标的K

MM对AB的解离常数(K

当AB用MM修饰且在靶标存在的情况下时，与未用MM修饰的 AB的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标 的特异性结合被降低或抑制。当与未用MM修饰的AB与靶标的结合 或亲本AB与靶标的结合相比时，当在体内或在体外测定法中测量时，当用MM修饰时的AB结合靶标的能力可以降低至少50％、60％、70％、 80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和甚至 100％持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84 或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。

MM抑制AB与靶标的结合。MM结合AB的抗原结合结构域且抑 制AB与靶标的结合。MM可以空间抑制AB与靶标的结合。MM可以 变构抑制AB与其靶标的结合。在这些实施方案中，与未经MM修饰 的AB、亲本AB或未与MM偶联的AB与靶标的结合相比，当AB用 MM修饰或与MM偶联且在靶标存在的情况下时，当在体内或在体外 测定法中测量时，不存在AB与靶标的结合或基本上无AB与靶标的结 合，或不多于0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、 7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的 AB与靶标的结合，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、 60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或 180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。

当AB与MM偶联或被MM修饰时，MM“掩蔽”或降低或以其 它方式抑制AB与靶标的特异性结合。当AB与MM偶联或被MM修 饰时，这样的偶联或修饰可以实现降低或抑制AB特异性结合其靶标的 能力的结构改变。

与MM偶联或用MM修饰的AB可以由下式代表(以从氨基(N)端 区域至羧基(C)端区域的顺序)：

(MM)-(AB)

(AB)-(MM)

(MM)-L-(AB)

(AB)-L-(MM)

其中MM是掩蔽部分，AB是抗体或其抗体片段，且L是接头。 在许多实施方案中，可期望将一个或多个接头，例如，柔性接头插入 组合物中以提供柔性。

在某些实施方案中，MM不是AB的天然结合配偶体。在一些实施 方案中，MM不合或基本上不含与AB的任何天然结合配偶体的同源性。 在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％或80％的相似性。在一些实施方案中，MM与AB的 任何天然结合配偶体具有不多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的同一 性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于 25％的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体 具有不多于50％的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天 然结合配偶体具有不多于20％的同一性。在一些实施方案中，MM与 AB的任何天然结合配偶体具有不多于10％的同一性。

在一些实施方案中，可活化抗体包括通过MM修饰的AB，且还包 括作为至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的至少一种可切割部分 (CM1)和作为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物的至少第二可切割部 分(CM2)。这样的可活化抗体展现与AB的靶标的可活化/可变换结合。 可活化抗体通常包括被掩蔽部分(MM)和CM1-CM2底物修饰或与掩蔽 部分(MM)和CM1-CM2底物偶联的抗体或抗体片段(AB)。

可活化抗体的元件经排列，使得MM和CM1-CM2底物经放置， 使得在切割(或者相对活性)状态下且在靶标存在的情况下，AB结合靶 标，而在未切割(或者相对无活性)状态下在靶标存在的情况下，AB与 其靶标的特异性结合被降低或抑制。AB与其靶标的特异性结合可以由 于AB特异性结合其靶标的能力被MM抑制或掩蔽而降低。

用MM和CM1-CM2底物修饰的AB对靶标的K

当AB用MM和CM1-CM2底物修饰且在靶标存在的情况下、但 不在修饰剂(例如MMP和SP)存在的情况下时，与未用MM和 CM1-CM2底物修饰的AB或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB 与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当与亲本AB与其靶标的结合或 未用MM和CM1-CM2底物修饰的AB与其靶标的结合相比时，当在 体内或在体外测定法中测量时，当用MM和CM1-CM2底物修饰时的 AB结合靶标的能力可以降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和甚至100％持续至少2、4、 6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时或5、10、15、 30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11或12个月或更长。

如本文所用，术语切割状态是指在CM1-CM2底物被至少一种基质 金属蛋白酶和/或至少一种丝氨酸蛋白酶修饰(即切割)后可活化抗体的 状况。如本文所用，术语未切割状态或完全未切割的是指在不存在 CM1-CM2底物被MMP和/或SP切割的情况下可活化抗体的状况。如 上所讨论，术语“可活化抗体”在本文用于指呈其未切割(天然)状态以 及呈其切割状态的可活化抗体。其切割状态下的可活化抗体也在本文 中称为活化的抗体和/或活化的可活化抗体。普通技术人员显而易见的 是，在一些实施方案中，切割的可活化抗体可以由于蛋白酶对 CM1-CM2底物的切割、导致至少MM的释放而缺乏MM。

可活化或可变换的意指可活化抗体当在抑制、掩蔽或未切割状态 下(即，第一构象)时展现与靶标的第一结合水平，和在未抑制、未掩蔽 和/或切割状态下(即，第二构象)与靶标的第二结合水平，其中第二靶 标结合水平大于第一结合水平。通常，靶标对可活化抗体的AB的接近 在能够切割CM1-CM2底物的切割剂存在的情况下比在这样的切割剂 不存在的情况下更大。因此，当可活化抗体在未切割状态下时，AB被 抑制免于靶标结合且可以被掩蔽免于靶标结合(即，第一构象使得AB 不能结合靶标)，且在切割状态下，对于靶标结合，AB未被抑制或未 被掩蔽。

选择可活化抗体的CM1-CM2底物和AB，使得AB代表给定靶标 的结合部分，且CM1-CM2底物代表MMP和SP的底物，其中MMP 和/或SP与靶标在受试者中的治疗部位或诊断部位处共定位。本文公开 的可活化抗体特别可用于其中例如各自能够切割CM1-CM2底物中的位点的MMP和SP以比非治疗部位的组织(例如健康组织)相对更高的 水平存在于治疗部位或诊断部位的含有靶标的组织中的情况。

在一些实施方案中，可活化抗体提供降低的毒性和/或不良副作用， 如果AB未被掩蔽或以其它方式被抑制免于结合靶标，则所述毒性和/ 或不良副作用可以其它方式由在非治疗部位处的AB的结合导致。

通常，可活化抗体可以通过如下来设计：选择目标AB和构建可活 化抗体的剩余部分，使得当构象上被限制时，MM提供AB的掩蔽或 AB与其靶标的结合的降低。可以考虑结构设计标准以提供该功能特征。

提供了对在抑制构象相比于非抑制构象中的靶标结合展现所需动 态范围的可变换表型的可活化抗体。动态范围通常是指(a)在第一组条 件下参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下该参数的最小检测值的 比率。例如，在可活化抗体的背景下，动态范围是指(a)在能够切割可 活化抗体的CM1-CM2底物的MMP和SP存在的情况下与可活化抗体 结合的靶蛋白的最大检测水平与(b)在蛋白酶不存在的情况下与可活化 抗体结合的靶蛋白的最小检测水平的比率。可活化抗体的动态范围可 计算为可活化抗体切割剂(例如，酶)处理的解离常数与可活化抗体切割 剂处理的解离常数的比率。可活化抗体的动态范围越大，可活化抗体 的可变换表型越好。具有相对更高的动态范围值(例如，大于1)的可活 化抗体展现更加期望的变换表型，使得在能够切割可活化抗体的CM1-CM2底物的切割剂(例如，酶)存在的情况下比在切割剂不存在的 情况下，可活化抗体的靶蛋白结合在更大的程度上发生(例如，主要发 生)。

可活化抗体可以各种结构构型提供。下文提供可活化抗体的示例 性式。特别考虑，AB、MM和CM1-CM2底物的N-至C-端顺序可以在 可活化抗体内反转。还特别考虑，CM和MM的氨基酸序列可以重叠， 例如，使得CM1-CM2底物至少部分包含于MM内。

例如，可活化抗体可以由下式代表(以从氨基(N)端区域至羧基(C) 端区域的顺序)：

(MM)-(CM1-CM2底物)-(AB)

(AB)-(CM1-CM2底物)-(MM)

其中MM是掩蔽部分，CM1-CM2底物是可切割部分，且AB是抗 体或其片段。如上所示，术语“CM1-CM2底物”不旨在传达关于作为 至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物的第一可切割部分(CM1)和作 为至少一种丝氨酸蛋白酶(SP)的底物的至少第二可切割部分(CM2)的 取向或其它结构排列的任何要求。因此，术语“CM1-CM2底物”涵盖 具有如下的N-端至C-端的结构排列的CM1-CM2底物：CM1-CM2或 CM2-CM1。术语“CM1-CM2底物”还涵盖其中CM1序列的至少一部 分与CM2序列的至少一部分重叠的底物。还应注意，尽管MM和 CM1-CM2底物在上式中表示为不同的组分，但在本文公开的所有示例 性实施方案(包括式)中，考虑MM和CM1-CM2底物的氨基酸序列可以 重叠，例如，使得CM1-CM2底物完全或部分地包含于MM内。此外， 上式提供额外氨基酸序列，其可以位于可活化抗体元件的N-端或C-端。

在某些实施方案中，MM不是AB的天然结合配偶体。在一些实施 方案中，MM不含或基本上不合与AB的任何天然结合配偶体的同源性。 在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％或80％的相似性。在一些实施方案中，MM与AB的 任何天然结合配偶体具有不多于5％、10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的同一 性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于 50％的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体 具有不多于25％的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天 然结合配偶体具有不多于20％的同一性。在一些实施方案中，MM与 AB的任何天然结合配偶体具有不多于10％的同一性。

在许多实施方案中，可期望将一个或多个接头、例如柔性接头插 入可活化抗体构建体，以在MM-CM1-CM2底物连接CM1-CM2底物 -AB连接或两者中的一个或多个处提供柔性。例如，AB、MM和/或 CM1-CM2底物可以不含足够数量的残基(例如，Gly、Ser、Asp、Asn， 尤其是Gly和Ser，特别是Gly)以提供期望的柔性。因此，这样的可活 化抗体构建体的可变换表型可以获益于引入一个或多个氨基酸以提供 柔性接头。此外，如下所述，在作为构象受限的构建体提供可活化抗 体的情况下，可以可操作插入柔性接头，以促进形成和维持未切割的 可活化抗体的环状结构。

例如，在某些实施方案中，可活化抗体包含下式之一(其中下式代 表以N-至C-端方向或C-至N-端方向的氨基酸序列)：

(MM)-L1-(CM1-CM2底物)-(AB)

(MM)-(CM1-CM2底物)-L2-(AB)

(MM)-L1-(CM1-CM2底物)-L2-(AB)

其中MM、CM1-CM2底物和AB如上文所定义；其中L1和L2各 自独立地且任选地存在或不存在，是相同或不同的柔性接头，其包括 至少1个柔性氨基酸(例如，Gly)。此外，上式提供额外氨基酸序列， 其可以位于可活化抗体元件的N-端或C-端。实例包括但不限于靶向部 分(例如，靶组织中存在的细胞的受体的配体)和血清半衰期延长部分 (例如，结合血清蛋白诸如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如， 人血清白蛋白(HAS)的多肽)。

CM1-CM2底物被至少一种MMP以约0.001-1500 x 10

对于酶的特异性切割，进行酶和CM1-CM2底物之间的接触。当包 含与MM和CM1-CM2底物偶联的AB的可活化抗体在靶标和足够的 酶活性存在的情况下时，CM1-CM2底物可以被切割。足够的酶活性可 以是指酶与CM1-CM2底物进行接触并实现切割的能力。可以容易设想， 酶可以在CM1-CM2底物的附近，但因为其它细胞因子或酶的蛋白修饰 而不能切割。

适合用于本文所述的组合物的接头通常是提供修饰的AB或可活 化抗体的柔性以促进AB与靶标的结合的抑制的接头。这样的接头通常 被称为柔性接头。合适的接头可以容易地选择，且可以具有任何合适 的不同长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸 至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个 氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨 基酸至8个氨基酸，且可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长。

示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包 括例如，(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：381)和(GGGS)n(SEQ ID NO：382)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝 氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚 合物相对无结构，因此可能能够充当各组分之间的中性系链。甘氨酸 获得比甚至丙氨酸显著更多的phi-psi空间，且比具有更长侧链的残基 受到少得多的限制(参见Scheraga，Rev.Computational Chem.11173-142 (1992))。示例性柔性接头包括但不限于Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：383)，Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：384，Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO：385)，Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：386)， Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：387)，Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO：388)等。普通技术人员将认识到，可活化抗体的设计可以包括全部 或部分柔性的接头，使得接头可以包括柔性接头以及赋予较少柔性结 构的一个或多个部分，以提供期望的可活化抗体结构。

在一些实施方案中，本文所述的可活化抗体还包括与可活化抗体 缀合的试剂。在一些实施方案中，缀合的试剂是治疗剂，诸如抗炎剂 和/或抗肿瘤剂。在这样的实施方案中，试剂与可活化抗体的碳水化合 物部分缀合，例如，在一些实施方案中，其中碳水化合物部分位于可 活化抗体中的抗体或抗原结合片段的抗原结合区域之外。在一些实施 方案中，试剂与可活化抗体中的抗体或抗原结合片段的巯基缀合。

在一些实施方案中，试剂是细胞毒性剂诸如毒素(例如，细菌、真 菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放 射性缀合物)。

在一些实施方案中，试剂是可检测部分，诸如例如标记或其它标 记物。例如，试剂是或包括放射性标记的氨基酸，可以通过标记的抗 生物素蛋白检测的一种或多种生物素部分(例如，可以通过光学或量热 法检测的含有荧光标记物或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)，一种或多 种放射性同位素或放射性核素，一种或多种荧光标记，一种或多种酶 促标记和/或一种或多种化学发光剂。在一些实施方案中，可检测部分 通过间隔区分子连接。

本发明还涉及包含与细胞毒性剂诸如毒素(例如，细菌、真菌、植 物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀 合物)缀合的抗体的免疫缀合物。合适的细胞毒性剂包括例如多拉司他 汀和其衍生物(例如，阿里他汀E、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、 DMAF、DMAE)。例如，试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)或单甲基 阿里他汀D(MMAD)。在一些实施方案中，试剂是选自表3中所列的 试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中， 试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。 在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀D(MMAD)。在一些实施 方案中，试剂是美登木素生物碱或美登木素生物碱衍生物。在一些实 施方案中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉 素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是加利车霉素或 其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂

在一些实施方案中，试剂使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接 头或马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接至AB。在一些实施方案 中，试剂使用马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸接头连接至AB。在一 些实施方案中，试剂使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸接头连接至 AB。在一些实施方案中，试剂是使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸- 对氨基苄氧基羰基接头连接至AB的单甲基阿里他汀D(MMAD)，且 该接头有效载荷构建体在本文中称为“vc-MMAD”。在一些实施方案 中，试剂是使用马来酰亚胺PEG-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基接 头连接至AB的单甲基阿里他汀E(MMAE)，且该接头有效载荷构建体 在本文中称为“vc-MMAE”。下面显示vc-MMAD和vc-MMAE的结 构：

vc-MMAD：

vc-MMAE：

可使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合 活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆 毒素A链、朔莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、 石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII和 PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌 素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类(tricothecenes)。各种放射性核 素可用于制备放射性缀合的抗体。实例包括

抗体和细胞毒性剂的缀合物使用各种双官能蛋白偶联剂制备，所 述双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸盐 (SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(thiolane)(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸 如二甲基己二酰亚胺酸酯HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸 酯)、醛类(诸如戊二醛)、双-叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基) 己二胺)、双-重氮盐衍生物(诸如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异 氰酸酯类(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟 -2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238： 1098(1987)中所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙 烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核素(radionucleotide)与抗体缀合 的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。

表3列举了可用于本文所述的公开内容的一些示例性的药物，但 其绝不意指为详尽的列表。

表3：用于缀合的示例性药物

本领域普通技术人员将认识到，很多可能的部分可与本发明的抗 体偶联。(参见例如“Conjugate Vaccines”，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis，Jr(编辑)，Carger Press，New York，(1989)，其完整内容通过引用并入本文)。

偶联可通过结合两个分子的任何化学反应进行，只要抗体和另一 部分保持它们各自的活性。该键可包括许多化学机制，例如共价结合、 亲和力结合、嵌入、配位结合和络合。然而在一些实施方案中，结合 是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过并入外部的 桥接分子实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子，诸如本发 明的抗体，与其它分子偶联。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合 物，诸如硫代酸酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、 重氮苯和六亚甲基二胺。该列表不意欲穷尽本领域已知的各种类别的 偶联剂，而是较常见偶联剂的例示。(参见Killen和Lindstrom，Jour.Immun.133：1335-2549(1984)；Jansen等人，Immunological Reviews 62：185-216(1982)；和Vitetta等人，Science 238：1098(1987)。

在一些实施方案中，除了本文提供的组合物和方法以外，缀合的 可活化抗体还可通过插入或以其它方式包括在可活化抗体序列中的修 饰的氨基酸序列，经修饰用于位点特异性缀合。这些修饰的氨基酸序 列经设计以允许在缀合的可活化抗体内受控的放置和/或给药缀合的试 剂。例如，可活化抗体可经工程改造以在轻链和重链的位置上包括半 胱氨酸取代，其提供反应性巯基和不负面影响蛋白折叠和装配，也不 改变抗原结合。在一些实施方案中，可活化抗体可经工程改造以在可 活化抗体内包括或以其它方式引入一个或多个非天然氨基酸残基，以 提供用于缀合的合适位点。在一些实施方案中，可活化抗体可经工程 改造以在可活化抗体序列内包括或以其它方式经酶促引入可活化肽序 列。

合适的接头描述于文献中(参见例如Ramakrishnan，S.等人，Cancer Res.44：201-208(1984)，描述使用MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N- 羟基琥珀酰亚胺酯)。也参见美国专利号5,030,719，描述使用通过寡肽 接头与抗体偶联的卤代乙酰基酰肼衍生物。在一些实施方案中，合适 的接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐； (ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二巯基)-甲 苯(PierceChem.Co.，目录号(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6 [3-(2-吡啶基二巯基)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，目录号 21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二巯 基)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.目录号2165-G)；和(v)与EDC缀 合的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酸亚胺：Pierce Chem.Co.，目录号 24510)。额外的接头包括但不限于SMCC、磺基-SMCC、SPDB或磺基 -SPDB。

上述接头含有具有不同属性的元件，因此产生具有不同物理化学 性质的缀合物。例如，羧酸烷酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基 -NHS酯更稳定。含有NHS-酯的接头比磺基-NOS酯更难溶解。此外， 接头SMPT含有空间阻碍的二硫键，且可形成具有增加的稳定性的缀 合物。二硫键通常比其它键更不稳定，因为二硫键被体外切割，导致 较少的可获得缀合物。具体地，磺基-NHS可以增强碳二亚胺接头的稳 定性。当与磺基-NHS结合使用时，碳二亚胺偶联物(诸如EDC)形成比 单独的碳二亚胺偶联反应更耐受水解的酯。

在一些实施方案中，接头是可切割的。在一些实施方案中，接头 是不可切割的。在一些实施方案中，存在两个或更多个接头。所述两 个或更多个接头全都相同，即，是可切割的或不可切割的，或所述两 个或更多个接头是不同的，即，至少一个可切割且至少一个不可切割。

本发明利用几种方法来将试剂连接至Ab：(a)连接至AB的碳水 化合物部分，或(b)连接至AB的巯基，或(c)连接至AB的氨基，或 (d)连接至AB的羧酸基团。根据本发明，AB可通过具有至少两个反 应性基团的中间体接头共价连接至试剂，一个基团与AB反应和一个基团与所述试剂反应。可包括任何相容的有机化合物的接头可经选择使 得与AB(或试剂)的反应不会不利地影响AB的反应性和选择性。此外， 连接接头至试剂，可能不破坏试剂的活性。对于与氧化的抗体或氧化 的抗体片段反应，合适的接头包括含有胺的那些，所述胺选自伯胺、 仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和氨基硫脲基团。这样的反应 性官能团可作为接头结构的部分存在，或可通过不含这样的基团的接 头的合适化学修饰引入。

根据本发明，用于连接至还原的AB的合适的接头包括具有能够与 还原抗体或片段的巯基反应的某些反应性基团的那些。这样的反应性 基团包括但不限于：反应性卤代烷基(包括例如，卤代乙酰基)、对汞基 苯甲酸基团和能够Michael-型加成反应的基团(包括例如，马来酰亚胺 和Mitra和Lawton，1979，J.Amer.Chem.Soc.101：3097-3110描述的类 型的基团)。

根据本发明，用于连接至非氧化也非还原的Ab的合适的接头包括 具有能够与存在于Ab的未经修饰的赖氨酸残基中的伯氨基反应的某 些官能团的那些。这样的反应性基团包括但不限于NHS羧酸或碳酸酯、 磺基-NHS羧酸或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸或碳酸酯、五氟苯基羧酸或 碳酸酯、酰基咪唑、异氰酸酯和异硫氰酸酯。

根据本发明，用于连接至非氧化也非还原的Ab的合适的接头包括 具有能够与存在于Ab的天冬氨酸或谷氨酸残基中的羧酸基团反应的 某些官能团的那些，所述羧酸基团已被合适的试剂活化。合适的活化 试剂包括EDC(具有或不具有加入的NHS或磺基-NHS)和用于羧酰胺 形成的其它脱水剂。这些实例中，存在于合适的接头中的官能团包括 伯胺和仲胺、肼、羟胺和酰肼。

所述试剂可在接头与AB连接之前或之后与接头连接。在某些应用 中，首先产生AB-接头中间体可能是需要的，其中接头不包含相关的 试剂。根据具体的应用，特定的试剂可然后与接头共价连接。在一些 实施方案中，AB首先与MM、CM1-CM2底物和相关的接头连接，且 然后与用于缀合目的的接头连接。

分支接头：在特定的实施方案中，利用具有多个试剂连接位点的 分支接头。对于多位点接头，与AB的单一共价连接将产生能够在多个 位点上结合试剂的AB-接头中间体。所述位点可以是醛基团或巯基或 试剂可连接的任何化学位点。

在一些实施方案中，通过在AB的多个位点上连接单一位点接头， 可获得较高的特异活性(或较高的试剂：AB比)。通过两种方法的任一种， 该多个位点可引入AB中。第一，可在同一AB上产生多个醛基团和/ 或巯基。第二，可连接AB的醛或巯基与具有用于随后连接接头的多个 功能位点的″分支接头″。分支接头或多位点接头的功能位点可以是醛基 团或巯基，或可以是接头可连接的任何化学位点。还更高的特异活性 可通过组合这两种方法获得，即在AB的数个位点上连接多位点接头。

可切割的接头：在本发明的一个实施方案中，可使用易于被补体 系统的酶(诸如但不限于尿激酶、组织纤溶酶原激活物、类胰蛋白酶、 纤溶酶或具有蛋白水解活性的另一种酶)切割的肽接头。根据本发明的 一种方法，试剂经由对补体切割敏感的接头连接。抗体选自可活化补 体的类别。因此，抗体-试剂缀合物活化补体级联且在靶标位点上释放 试剂。根据本发明的另一种方法，试剂经由易于被具有蛋白水解活性 的酶(例如尿激酶、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶或类胰蛋白酶)切割的 接头连接。这些可切割的接头可用于缀合的可活化抗体，其包括胞外 毒素，例如通过非限制性实例的方式的表3中所示的任何胞外毒素。

可切割的接头序列的非限制性实例提供于表4中。

表4：用于缀合的示例性接头序列

此外，试剂可经由二硫键(例如半胱氨酸分子上的二硫键)与AB连 接。因为许多肿瘤天然释放高水平的谷胱甘肽(还原剂)，所以这可还原 二硫键，随后在递送位点上释放试剂。在某些具体的实施方案中，修 饰CM1-CM2底物的还原剂也将修饰缀合的可活化抗体的接头。

间隔区和可切割的元件：在一些实施方案中，以使得优化试剂和 可活化抗体的AB之间的间隔的方式构建接头可能是必需的。这可通过 使用以下通式结构的接头实现：

W-(CH

其中

W是--NH--CH

Q是氨基酸、肽；且

n是0-20的整数。

在一些实施方案中，接头可包含间隔区元件和可切割的元件。间 隔区元件用于定位可切割的元件远离AB的核心，使得可切割的元件更 易接近负责切割的酶。上述的某些分支接头可用作间隔区元件。

在整个讨论中，应理解接头与试剂(或间隔区元件与可切割的元件、 或可切割的元件与试剂)的连接不需要是特定的连接或反应模式。提供 具有合适的稳定性和生物相容性的产物的任何反应都是可接受的。

血清补体和接头选择：根据本发明的一种方法，当需要试剂释放 时，使用作为可活化补体的类型的抗体的AB。所得缀合物同时保留结 合抗原和活化补体级联的能力。因此，根据本发明的该实施方案，试 剂连接可切割的接头或可切割的元件的一个末端，且接头基团的另一 末端与AB上的特定位点连接。例如，如果试剂具有羟基或氨基，其可 与肽、氨基酸或其它合适选择的接头的羧基末端分别经由酯或酰胺键 连接。例如，这样的试剂可与接头肽经由碳二亚胺反应连接。如果试 剂含有会干涉接头连接的官能团，这些干涉官能团可在连接之前被封 闭且在产物缀合物或中间体制备后解封闭。接头的相对或氨基端然后 直接或在进一步修饰后用于结合能够活化补体的AB。

接头(或接头的间隔区元件)可具有任何需要的长度，其一个末端可 与可活化抗体的AB的特定位点共价连接。接头或间隔区元件的另一末 端可与氨基酸或肽接头连接。

因此，当这些缀合物在补体的存在下结合抗原时，连接试剂与接 头的酰胺或酯键将被切割，导致释放呈其活性形式的试剂。这些缀合 物当施用于受试者时，将在靶标位点上实现试剂的递送和释放，且对 于药剂、抗生素、抗代谢物、抗增殖药等(如在表3中(但不限于此)提 供的那些)的体内递送特别有效。

用于元补体活化下的释放的接头：在靶向递送的又一种应用中， 无补体活化的试剂释放是需要的，因为补体级联的活化将最终溶解靶 细胞。因此，当试剂的递送和释放应在不杀死靶细胞的情况下实现时 该方法是有用的。这是当需要递送细胞介质诸如激素、酶、皮质类固 醇、神经递质、基因或酶至靶细胞时的目标。这些缀合物可通过将试 剂与不能活化补体的AB经由接头连接制备，所述接头对通过血清蛋白 酶的切割轻度敏感。当将该缀合物施用于个体时，抗原-抗体复合物将 快速形成，而试剂的切割将缓慢发生，因此导致在靶标位点上释放化 合物。

生物化学交叉接头：在一些实施方案中，使用某些生物化学交叉 接头，可活化抗体可与一种或多种治疗剂缀合。交叉连接试剂形成分 子桥，其将两个不同分子的官能团系在一起。为了以逐步方式连接两 个不同的蛋白，可使用杂-双官能交叉-接头，其排除不需要的均聚物形 成。

还可使用通过溶酶体蛋白酶可切割的肽基接头，例如Val-Cit、 Val-Ala或其它二肽。此外，可使用在溶酶体的低pH环境中可切割的 酸不稳定性接头，例如：双-唾液酸醚。其它合适的接头包括组织蛋白 酶不稳定性底物，特别是在酸性pH下显示最佳功能的那些。

示例性的杂-双官能交叉-接头在表5中提及。

表5：示例性的杂-双官能交叉接头

不可切割的接头或直接连接：在本发明的一些实施方案中，缀合 物可经设计，使得所述试剂被递送至靶标而不释放。这可通过将试剂 与AB直接或经由不可切割的接头连接实现。

这些不可切割的接头可包括氨基酸、肽、D-氨基酸或可经修饰以 包括可随后用于通过本文所述的方法连接AB的官能团的其它有机化 合物。这样的有机接头的通式可以是

W-(CH

其中

W是--NH--CH

Q是氨基酸、肽；且

n是0-20的整数。

不可切割的缀合物：在一些实施方案中，化合物可与不活化补体 的AB连接。当使用不能补体活化的AB时，该连接可使用对活化的补 体的切割敏感的接头或使用对活化的补体的切割不敏感的接头来实现。

本文公开的抗体还可被配制为免疫脂质体。含有抗体的脂质体通 过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)； 和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的方法。具有提高的循环 时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。

特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷 脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发方法产生。脂质体通 过限定孔径的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。本发明的抗 体的Fab’片段可按Martin等人，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)中 所述，经由二硫化物交换反应与脂质体缀合。

除非另外定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领 域普通技术人员通常理解的含义。术语“一个/种(a)”实体或“一个/ 种(an)”实体是指该实体中的一个/种或多个/种。例如，化合物是指一 种或多种化合物。因此，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“一 个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。此外，除非上下文 另外要求，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。通常，与本 文描述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡核苷酸或多核苷酸 化学和杂交结合使用的命名法及其技术是本领域众所周知和通常使用 的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或本 领域通常实践或本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域众所 周知的常规方法和如本说明书各处中引用和讨论的各种通用和较特定 的参考文献中所述进行。参见例如，Sambrook等人Molecular Cloning： A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。与本文描述的分析化学、合成有机化学和 医用和药用化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域众 所周知和通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物 制备、配制和递送，和治疗患者。

如根据本发明所用，除非另外说明，以下术语应理解具有以下含 义：

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig) 分子的免疫活性部分，即，含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原 结合位点的分子。“特异性结合”或“与…免疫反应”或“免疫特异 性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其 它多肽反应或以低得多的亲和力结合(K

基础抗体结构单位已知包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽 链对构成，每一对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70 kDa)。各链的氨基末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区， 其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分限定了恒定区，其主要负 责效应子功能。通常，获得自人的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、 IgE和IgD中的任一类别，它们彼此不同之处在于分子中存在的重链的 性质。某些类别还具有亚类，诸如IgG

如本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)或“单克隆抗体组合物”， 是指仅含有一个分子种类的抗体分子的抗体分子群，所述抗体分子由 独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体而言，单克隆 抗体的互补决定区(CDR)在所述群的所有分子中相同。MAb含有能够 与抗原的特定表位起免疫反应的抗原结合位点，特征在于对抗原有独 特的结合亲和力。

术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子的一 部分，其涉及抗原结合。抗原结合位点由重(“H”)和轻(“L”)链的 N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内的三个 高度不同的区段，被称为“超变区”，间插在称为“框架区”或“FR”的较保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球 蛋白的超变区之间并与其邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的 三个超变区和重链的三个超变区在三维空间中彼此相对排列，以形成 抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，重链和 轻链各自的三个超变区被称为“互补决定区”或“CDR”。氨基酸在 各结构域中的分配根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1987和1991))或 Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)，Chothia等人Nature 342：878-883(1989)中的定义来进行。

如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv 或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合 免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子 例如氨基酸或糖侧链的化学活性表面簇(groupings)组成，和通常具有特 定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，抗体可以针对多肽的 N-端或C-端肽产生。当解离常数是≤1μM；在一些实施方案中≤100 nM和在一些实施方案中≤10nM时，认为抗体特异性结合抗原。

如本文所用，术语“特异性结合”、“免疫结合”和“免疫结合 性质”是指在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之 间形成的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力 可表示为相互作用的解离常数(K

如本文所用的术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA或合 成来源的多核苷酸，或其一些组合，根据其来源，“分离的多核苷酸” (1)不缔合“分离的多核苷酸”天然存在于其中的多核苷酸的全部或一 部分，(2)与天然不与其连接的多核苷酸可操作连接，或(3)不作为较大 序列的一部分天然存在。根据本发明的多核苷酸包括编码本文所示的 重链免疫球蛋白分子的核酸分子，和编码本文所示的轻链免疫球蛋白 分子的核酸分子。

本文提及的术语“分离的蛋白”意指cDNA、重组RNA或合成来 源的蛋白或其一些组合，根据其来源或衍生源，“分离的蛋白”(1) 不缔合天然存在的蛋白，(2)不合相同来源的其它蛋白，例如，不含鼠 蛋白，(3)通过不同物种的细胞表达，或(4)不天然存在。

本文作为通称使用的术语“多肽”是指具有多肽序列的天然蛋白、 片段或类似物。因此，天然蛋白片段和类似物是多肽上位概念(genus) 的下位概念(species)。根据本发明的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋 白分子和本文所示的轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋 白分子与轻链免疫球蛋白分子诸如κ轻链免疫球蛋白分子的组合(和反之亦然)形成的抗体分子以及其片段和类似物。

如本文所用的术语“天然存在的”在应用于物体时是指物体可天 然存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的、可自天然来源分 离的和未在实验室中经人为有意修饰或以其它方式修饰的多肽或多核 苷酸序列是天然存在的。

如本文所用的术语“可操作连接”是指所述组分的位置处于允许 它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作连接”的控 制序列以使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现的方式 连接。

如本文所用的术语“控制序列”是指实现与它们连接的编码序列 的表达和加工所必需的多核苷酸序列。这样的控制序列的性质取决于 宿主生物体而不同，在原核生物中这样的控制序列通常包括启动子、 核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中通常这样的控制序列 包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲最少包括其存在 是表达和加工所必需的所有元件，和还可包括其存在是有利的其它元 件，例如前导序列和融合物配偶体序列。本文提及的术语“多核苷酸” 意指至少10个碱基长的核苷酸，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任 一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。

本文提及的术语寡核苷酸包括通过天然存在的和非天然存在的寡 核苷酸键(linkage)连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸。寡核苷酸 是通常包含长度200个或更少的碱基的多核苷酸子集。在一些实施方 案中，寡核苷酸是10-60个碱基长，且在一些实施方案中12、13、14、 15、16、17、18、19或20-40个碱基长。寡核苷酸通常是单链的，例 如对于探针，但寡核苷酸也可以是双链的，例如用于构建基因突变体。 本发明的寡核苷酸为有义或反义寡核苷酸。

本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核 糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代 的糖基团等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸 键，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、 苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯 (phosphoraniladate)、氨基磷酸酯(phosphoronmidate)等。参见例如， LaPlanche等人Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人J.Am.Chem. Soc.106：6077(1984)，Stein等人Nucl.Acids Res.16：3209(1988)，Zon等 人Anti Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等人Oligonucleotidesand Analogues：A Practical Approach，第87-108页(F.Eckstein编辑，OxfordUniversity Press，Oxford England(1991))；Stec等人美国专利号 5,151,510；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)。如果需 要，寡核苷酸可包括用于检测的标记。

如本文所用，20种常规氨基酸和其缩写按常规使用。参见 Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland7 Mass.(1991))。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-，α-二取代的氨基酸、N-烷 基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明的多肽的合适的 组分。非常规氨基酸的实例包括：4羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε -N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、N-乙酰基 丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲 基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本 文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方 向和右手方向是羧基末端方向。

类似地，除非另外说明，单链多核苷酸序列的左手末端是5′端， 双链多核苷酸序列的左手方向被称为5′方向。新生RNA转录物的5′至 3′加入方向被称为转录方向，DNA链上具有与RNA相同的序列和在 RNA转录物的5′末端的5′处的序列区被称为“上游序列”，DNA链上 具有与RNA相同的序列和在RNA转录物的3′末端的3′处的序列区被 称为“下游序列”。

应用于多肽时，术语“基本同一性”意指，两个肽序列当诸如通 过程序GAP或BESTFIT使用默认的空位权重最佳比对时，共有至少 80％的序列同一性，在一些实施方案中，至少90％的序列同一性，在一 些实施方案中至少95％的序列同一性，和在一些实施方案中至少99％ 的序列同一性。

在一些实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。

如本文所讨论，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的较少变化 预期包括在本发明中，条件是氨基酸序列中的所述变化保持至少75％， 在一些实施方案中至少80％、90％、95％，和在一些实施方案中99％。 具体而言，预期保守氨基酸替换。保守替换是在其侧链上相关的氨基 酸家族中发生的那些。遗传编码氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸； (3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、 赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮 氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬 氨酸。氨基酸的其它家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其为含有酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂肪族的家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸 和酪氨酸，其为芳香族的家族。例如，可合理预期单独替换亮氨酸为 异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸为谷氨酸、苏氨酸为丝氨酸或类似替换 氨基酸为结构相关的氨基酸，不将对所得分子的结合或性质具有主要 影响，尤其是如果所述替换不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸变化 是否产生功能肽可通过测定多肽衍生物的特定活性而容易地确定。本 文详细描述了测定法。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可通过 本领域普通技术人员容易地制备。合适的片段或类似物的氨基末端和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可通过将 核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或专有的序列数据库比较来鉴定。 在一些实施方案中，计算机比较方法用于鉴定出现在具有已知结构和/ 或功能的其它蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠 成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253：164(1991)。因此，前述实例证实，本领域技术人员可识别可用于 定义根据本发明的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。

合适的氨基酸取代为以下那些氨基酸取代，其：(1)降低对蛋白水 解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合 亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或修改这样的类似物的其它物 理化学或功能性质。类似物可包括具有并非天然存在的肽序列的序列 的各种突变型蛋白。例如，可在天然存在的序列中，例如在形成分子 间接触的结构域外的多肽部分中进行单一或多个氨基酸取代(例如保守 氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应基本上改变亲本序列的结构特征(例 如，替换氨基酸不应倾向于中断在亲本序列中出现的螺旋，或破坏亲 本序列所特有的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级 结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company，New York(1984))； Introduction toProtein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354：105 (1991)。

如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端 缺失和/或一个或多个内部缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与从 例如全长cDNA序列中推论的天然存在的序列的相应的位置相同。片 段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长，在一些实施方案中至少14 个氨基酸长，在一些实施方案中至少20个氨基酸长，通常至少50个 氨基酸长，和在一些实施方案中至少70个氨基酸长。如本文所用的术 语“类似物”是指由至少25个氨基酸的区段构成的多肽，所述区段与 推论的氨基酸序列的一部分具有基本同一性和在合适的结合条件下与 靶标特异结合。通常，多肽类似物包含相对于天然存在的序列的保守 氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常为至少20个氨基酸长，在一 些实施方案中至少50个氨基酸长或更长，和通常可长至全长的天然存 在的多肽。

术语“试剂”在本文用于表示化合物、化合物的混合物、生物大 分子或自生物材料制备的提取物。

如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指并入可检测标记物， 例如，通过并入放射性标记的氨基酸或与可通过标记的抗生物素蛋白 (例如，含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗 生物素蛋白)检测的生物素基部分的多肽连接。在某些情况下，标记或 标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已 知的和可被使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性 同位素或放射性核素(例如，

本文的其它化学术语根据本领域的常规用法使用，如由The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker，S.编辑， McGraw-Hill，San Francisco(1985))所举例。

如本文所用，“基本上纯的”意指对象种类是存在的主要种类(即， 在摩尔基础上它比组合物中的任何其它个别种类更丰富)，并且在一些 实施方案中，基本上纯化的部分是其中对象种类占存在的所有大分子 种类的至少约50％(在摩尔基础上)的组合物。

通常，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的超过约80％的所 有大分子种类，在一些实施方案中，超过约85％、90％、95％和99％。 在一些实施方案中，对象种类纯化至基本均质(通过常规检测方法在组 合物中不能检测到污染物种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类 组成。

术语患者包括人和兽医受试者。

本发明的可活化抗体特异性结合给定靶标，例如人靶蛋白。本发 明中还包括与本文所述的可活化抗体结合相同表位的可活化抗体。

本领域技术人员将认识到，可能在没有过度实验的情况下通过确 定单克隆抗体(例如，鼠单克隆或人源化抗体)是否阻止本文所述的方法 中使用的单克隆抗体结合靶标来确定前者是否与后者具有相同的特异 性。如果所测试的单克隆抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如通过本 发明的单克隆抗体的结合降低所示，则两种单克隆抗体结合相同或紧密相关的表位。用于确定单克隆抗体是否具有本发明的单克隆抗体的 特异性的方法是将本发明的单克隆抗体与靶标预温育，然后添加待测 试的单克隆抗体，以确定所测试的单克隆抗体在其结合靶标的能力方 面是否被抑制。如果所测试的单克隆抗体被抑制，则很可能地，其具 有与本发明的单克隆抗体相同或功能等同的表位特异性。

本发明还提供多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性可活化 抗体是这样的多特异性抗体，其识别两种或更多种不同的抗原或表位， 且包括至少一个掩蔽部分(MM)，所述掩蔽部分与多特异性抗体的至少 一个抗原或表位结合结构域连接，使得MM的偶联降低抗原或表位结 合结构域结合其靶标的能力。在一些实施方案中，MM经由起至少一 种MMP蛋白酶和至少一种SP的底物的作用的CM1-CM2底物与多特 异性抗体的抗原或表位结合结构域偶联。本文提供的可活化多特异性 抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在 正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活化时展现与相应的未修饰的 多特异性抗体至少相当的与靶标的结合。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体经设计以接合免疫效应 细胞，在本文中也称为免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体。在一 些实施方案中，多特异性可活化抗体经设计以接合白细胞，在本文中 也称为白细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异 性可活化抗体经设计以接合T-细胞，在本文中也称为T-细胞接合多特 异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体接合白细 胞(诸如T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或 另一种免疫效应细胞)上的表面抗原。在一些实施方案中，免疫效应细 胞是白细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T-细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应 细胞是单核细胞，诸如骨髓单核细胞。在一些实施方案中，多特异性 可活化抗体经设计以与多于一种靶标和/或多于一种表位结合或以其它 方式相互作用，在本文中也称为多抗原靶向可活化抗体。如本文所用， 术语“靶标”和“抗原”可互换使用。

在一些实施方案中，本发明的免疫效应细胞接合多特异性可活化 抗体包括靶向抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合抗体或其抗 原结合部分，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或免疫效应细胞接合 抗体或或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中， 免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合片段包括结合第一免疫效应细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分 (MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力。在一 些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段， 其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的 能力。在一些实施方案中，免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合片段 包括结合第一免疫效应细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段 (AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1 结合第一靶标的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或 其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标， 其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第 二靶标的能力。在一些实施方案中，非免疫效应细胞接合抗体是癌症 靶向抗体。在一些实施方案中，非免疫细胞效应抗体是IgG。在一些实 施方案中，非免疫效应细胞接合抗体是scFv。在一些实施方案中，靶 向抗体(例如，非免疫细胞效应抗体)是IgG且免疫效应细胞接合抗体是 scFv。在一些实施方案中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方案中， 免疫效应细胞是T-细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细 胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是骨髓单核细胞。

在一些实施方案中，本发明的T-细胞接合多特异性可活化抗体包 括靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分， 其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或T-细胞接合抗体或或其抗原结合 部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其 抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低 AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结 合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段 (AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2 的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，T-细胞接 合抗体或其抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或 其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1 的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其 结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联 降低AB2结合第二靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括癌症靶 向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中 癌症靶向抗体或其抗原结合片段和/或T-细胞接合抗体或或其抗原结合 部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，T-细胞接合抗体或其 抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低 AB1结合第一靶标的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗 原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片 段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实 施方案中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括结合第一T-细胞接 合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，且癌 症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗 体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关的靶标，其中AB2 与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相 关的靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括癌症靶 向IgG抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合scFv，其中癌症靶向IgG 抗体或其抗原结合片段和/或T细胞接合抗体或或其抗原结合部分中的 至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，T细胞接合抗体或其抗原结合片 段包括结合第一T细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)， 其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合第 一靶标的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合 片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)， 其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得 MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案 中，T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标 的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接， 使得MM1的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，且癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗 原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关的靶标，其中AB2与掩蔽部 分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关的靶标 的能力。

在免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体的一些实施方案中，一 种抗原通常是存在于肿瘤细胞或与疾病相关的其它细胞类型的表面上 的抗原，诸如但不限于表1中所列的任何靶标，诸如但不限于EGFR、 erbB2、EpCAM、Jagged、PD-L1、B7H3或CD71(转铁蛋白受体)，且 另一种抗原通常是存在于T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、 巨噬细胞和/或其它免疫效应细胞的表面上的刺激或抑制受体，诸如， 但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、CD25、CD27、 CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3或VISTA。在一些实施方案中， 抗原是存在于T细胞或NK细胞的表面上的刺激性受体；这样的刺激 性受体的实例包括，但不限于CD3、CD27、CD28、CD137(也称为4-1BB)、 GITR、HVEM、ICOS、NKG2D和OX40。在一些实施方案中，抗原是 存在于T细胞的表面上的抑制性受体；这样的抑制性受体的实例包括， 但不限于BTLA、CTLA-4、LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3和NK-表达 的KIRs。赋予对T-细胞表面抗原特异性的抗体结构域还可以被配体或 配体结构域取代，所述配体或配体结构域结合T细胞受体、NK细胞受 体、巨噬细胞受体和/或其它免疫效应细胞受体，诸如例如但不限于B7-1、 B7-2、B7H3、PD-L1、PD-L2或TNFSF9。

本发明的一个实施方案是在癌症微环境中可活化的多特异性可活 化抗体，并且包括针对肿瘤靶标的抗体(例如IgG或scFv)以及针对在活 化的T细胞或NK细胞的表面上表达的共刺激受体的激动剂抗体(例如 IgG或scFv)，其中癌靶标抗体和/或激动剂抗体中的至少一种被掩蔽。 共刺激受体的实例包括但不限于CD27、CD137、GITR、HVEM、NKG2D 和OX40。在该实施方案中，多特异性可活化抗体，一旦通过肿瘤相关 蛋白酶活化，将以肿瘤依赖性方式有效地交联和活化T细胞或NK细 胞表达的共刺激受体，以增强T细胞的经由其内源性T细胞抗原或NK 活化受体响应于任何肿瘤抗原的活性。这些T细胞或NK细胞共刺激 受体的活化依赖性质将聚焦针对肿瘤特异性T细胞的活化的多特异性 可活化抗体的活性，而不活化所有T细胞，其与其抗原特异性无关。 在一个实施方案中，多特异性可活化抗体的至少共刺激受体抗体被掩 蔽以防止可存在于组织中、但其活性通过缺乏共受体接合而受限的自 身反应性T细胞的活化，所述组织也表达多特异性可活化抗体中的肿 瘤靶向抗体识别的抗原。

本发明的一个实施方案是多特异性可活化抗体，其在特征在于T 细胞过度刺激的疾病(例如但不限于自身免疫性疾病或炎性疾病微环境) 中可活化。这样的多特异性可活化抗体包括针对包含在自身免疫性或 炎症性疾病中由T细胞靶向的组织中表达的表面抗原的抗体(例如IgG 或scFv)，以及针对在T细胞或NK细胞的表面上表达的抑制性受体的 抗体(例如IgG或scFv)，其中所述疾病组织靶标抗体和/或T细胞抑制 性受体抗体中的至少一种被掩蔽。抑制性受体的实例包括，但不限于 BTLA、CTLA-4、LAG3、PD-1、TIGIT、TIM3和NK-表达的KIRs。 在自身免疫性疾病中由T细胞靶向的组织抗原的实例包括但不限于在 多发性硬化中的髓鞘或神经细胞上表达的表面抗原或在1型糖尿病中 的胰岛细胞上表达的表面抗原。在该实施方案中，当在自身免疫攻击 或炎症下位于组织中时，多特异性可活化抗体被活化并共同接合T细 胞或NK细胞抑制受体，以抑制经由其内源性TCR或活化受体响应于 任何疾病组织靶向抗原的自身反应性T细胞的活性。在一个实施方案 中，至少一种或多种抗体被掩蔽以防止抑制其中靶抗原也可表达的非 疾病组织中的T细胞应答。

在一些实施方案中，T细胞接合多特异性可活化抗体包括抗CD3 ε(CD3ε，本文中也称为CD3e和CD3)scFv和靶向抗体或其抗原结 合片段，其中抗CD3εscFv和/或靶向抗体或其抗原结合片段中的至 少一种被掩蔽。在一些实施方案中，CD3εscFv包括结合CD3ε的第 一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使 得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶 向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或 其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2) 连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施 方案中，CD3εscFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段 (AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1 结合CD3ε的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其 片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其 中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二 靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗CD3 εscFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中抗CD3εscFv和/ 或癌症靶向抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施 方案中，CD3εscFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1 结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合 片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)， 其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得 MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案 中，CD3εscFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)， 其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3 ε的能力，且癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段， 其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关的靶标， 其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第 二癌症相关的靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗CD3 εscFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中抗CD3εscFv 和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一 些实施方案中，CD3εscFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合 片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低 AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其 抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合 片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在 一些实施方案中，CD3εscFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结 合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降 低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体IgG或其抗原结合片段包 括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结 合第二癌症相关的靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2 的偶联降低AB2结合第二癌症相关的靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括衍生自 OKT3的抗CD3epsilon(CD3ε)scFv，其中靶向抗体或其抗原结合片 段和/或OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv中的至少一种被掩蔽。在一 些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第 一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使 得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶 向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或 其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2) 连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施 方案中，OKT3scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体 或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1 的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包 括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结 合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降 低AB2结合第二靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中 OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和/或癌症靶向抗体或其抗原结合片段 中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生 的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1 与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能 力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗 体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌 症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降 低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，OKT3 scFv 或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段 (AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1 结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体 或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症 相关的靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降 低AB2结合第二癌症相关的靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其 中OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原 结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或 OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段 (AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1 结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原 结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接， 使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实 施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗 体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得 MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体IgG或其 抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合 片段(AB2)，其结合第二癌症相关的靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2) 连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关的靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗 CTLA-4 scFv，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或抗CTLA-4 scFv 中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗CTLA-4 scFv包括结合 CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分 (MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CTLA-4的能力。在一 些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段， 其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2 与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，抗CTLA-4 scFv包括结合CTLA-4的第一 抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得 MM1的偶联降低AB1结合CTLA-4的能力，且靶向抗体或其抗原结合 片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)， 其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶 联降低AB2结合第二靶标的能力。

在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗 CTLA-4 scFv和靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中抗CTLA-4 scFv 和/或靶向IgG抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实 施方案中，抗CTLA-4 scFv包括结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结 合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降 低AB1结合CTLA-4的能力。在一些实施方案中，靶向IgG抗体或其 抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合 片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得 MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，抗 CTLA-4 scFv包括结合CTLA-4的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)， 其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合 CTLA-4的能力，且靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其 片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其 中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二 靶标的能力。

在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体 至少包括结合第一靶标和/或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段和 结合第二靶标和/或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段。在一些实 施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合两个或更 多个不同的靶标。在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶 向可活化抗体结合相同靶标上的两个或更多个不同的表位。在一些实 施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合两个或更 多个不同的靶标和相同靶标上的两个或更多个不同的表位的组合。

在一些实施方案中，包含IgG的多特异性可活化抗体具有被掩蔽 的IgG可变结构域。在一些实施方案中，包含scFv的多特异性可活化 抗体具有被掩蔽的scFv结构域。在一些实施方案中，多特异性可活化 抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中IgG可变结构域中 的至少一个与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗 体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中scFv结构域中的至少 一个与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有 IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中IgG可变结构域中的至少一 个与掩蔽部分偶联，且scFv结构域中的至少一个与掩蔽部分偶联。在 一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结 构域两者，其中IgG可变结构域和scFv结构域中的每个与其自身的掩 蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结 构域具有对靶抗原的特异性，且另一个抗体结构域具有对T-细胞表面 抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体 结构域具有对靶抗原的特异性，且另一个抗体结构域具有对另一个靶 抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体 结构域具有对靶抗原的一个表位的特异性，且另一个抗体结构域具有 对靶抗原的另一个表位的特异性。

在多特异性可活化抗体中，scFv可以与IgG可活化抗体的重链的 羧基末端、与IgG可活化抗体的轻链的羧基末端、或与IgG可活化抗 体的重链和轻链两者的羧基末端融合。在多特异性可活化抗体中，scFv 可以与IgG可活化抗体的重链的氨基末端、与IgG可活化抗体的轻链 的氨基末端、或与IgG可活化抗体的重链和轻链两者的氨基末端融合。 在多特异性可活化抗体中，scFv可以与IgG可活化抗体的一个或多个 羧基末端和一个或多个氨基末端的任何组合融合。在一些实施方案中， 与CM1-CM2底物连接的掩蔽部分(MM)连接至IgG的抗原结合结构域 并使之掩蔽。在一些实施方案中，与CM1-CM2底物连接的掩蔽部分 (MM)连接至至少一个scFv的抗原结合结构域并使之掩蔽。在一些实施 方案中，与CM1-CM2底物连接的掩蔽部分(MM)连接至IgG的抗原结 合结构域并使之掩蔽，且与CM1-CM2底物连接的掩蔽部分(MM)连接 至至少一个scFv的抗原结合结构域并使之掩蔽。

本发明提供了多特异性可活化抗体结构的实例，其包括但不限于 以下：(VL-CL)

在T细胞接合多特异性可活化抗体的一些实施方案中，一种抗原 通常是存在于肿瘤细胞或与疾病相关的其它细胞类型的表面上的抗原， 诸如但不限于表1中所列的任何靶标，诸如但不限于EGFR、erbB2、 EpCAM、Jagged、PD-L1、B7H3或CD71(转铁蛋白受体)，且另一种抗 原通常是存在于T-细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细 胞和/或其它免疫效应细胞的表面上的刺激(本文中也称为活化)或抑制 受体，诸如，但不限于B7-H4、BTLA、CD3、CD4、CD8、CD16a、 CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137(也称为TNFRSF9)、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3 或VISTA。赋予对T-细胞表面抗原特异性的抗体结构域还可以被配体 或配体结构域取代，所述配体或配体结构域结合T细胞受体、NK细胞 受体、巨噬细胞受体和/或其它免疫效应细胞受体，诸如例如但不限于 B7-1、B7-2、B7H3、PD-L1、PD-L2或TNFSF9。在多抗原靶向可活化 抗体的一些实施方案中，一种抗原选自表1中所列的靶标，且另一种 抗原选自表1中所列的靶标。

在一些实施方案中，靶向抗体是抗EGFR抗体。在一些实施方案 中，靶向抗体是C225v5，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中， 靶向抗体是C225，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗 体是C225v4，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是C225v6，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体是抗Jagged 抗体。在一些实施方案中，靶向抗体是4D11，其特异性结合人和小鼠 Jagged 1和Jagged 2。在一些实施方案中，靶向抗体是4D11v2，其特 异性结合人和小鼠Jagged 1和Jagged 2。

在一些实施方案中，靶向抗体可呈可活化抗体的形式。在一些实 施方案中，scFv可呈Pro-scFv的形式(参见例如WO 2009/025846、WO 2010/081173)。

在一些实施方案中，scFv对于结合CD3ε是特异性的，并且是或 衍生自结合CD3ε的抗体或其片段，例如CH2527、FN18、H2C、OKT3、 2C11、UCHT1或V9。在一些实施方案中，scFv对于结合CTLA-4(本 文也称为CTLA和CTLA4)是特异性的。

在一些实施方案中，抗CTLA-4 scFv包括以下氨基酸序列：

在一些实施方案中，抗CTLA-4 scFv包括与SEQ ID NO：347的氨 基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗CD3εscFv包括以下氨基酸序列：

在一些实施方案中，抗CD3εscFv包括与SEQ ID NO：349的氨 基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，scFv对于结合一种或多种T细胞、一种或多 种NK细胞和/或一种或多种巨噬细胞是特异性的。在一些实施方案中， scFv对于结合选自以下的靶标是特异性的：B7-H4、BTLA、CD3、CD4、 CD8、CD16a、CD25、CD27、CD28、CD32、CD56、CD137、CTLA-4、GITR、HVEM、ICOS、LAG3、NKG2D、OX40、PD-1、TIGIT、TIM3 或VISTA。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。 在一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，试剂是抗肿 瘤剂。在一些实施方案中，试剂是毒素或其片段。在一些实施方案中， 试剂经由接头与多特异性可活化抗体缀合。在一些实施方案中，试剂 经由可切割接头与AB缀合。在一些实施方案中，试剂经由包括至少一 种CM1-CM2底物序列的接头与AB缀合。在一些实施方案中，接头是 不可切割接头。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施 方案中，试剂是核酸损伤剂，诸如DNA烷化剂或DNA嵌入剂，或其 它DNA损伤剂。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施 方案中，试剂是选自表4中所列的试剂。在一些实施方案中，试剂是 多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一 些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中， 试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基 阿里他汀D(MMAD)。在一些实施方案中，试剂是美登木素生物碱或 美登木素生物碱衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。 在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些 实施方案中，试剂是加利车霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试 剂是吡咯并苯并二氮杂

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体还包括可检测部分。在 一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体天然含有一个或多个二 硫键。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体可以进行工程改造以 包括一个或多个二硫键。

本发明还提供了编码本文所述的多特异性可活化抗体的分离的核 酸分子，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本发明提供了通过在 导致表达可活化抗体的条件下培养细胞来产生多特异性可活化抗体的 方法，其中所述细胞包含这样的核酸分子。在一些实施方案中，所述 细胞包含这样的载体。

本发明还提供了通过以下制备本发明的多特异性可活化抗体的方 法：(a)在导致表达多特异性可活化抗体的条件下培养包含编码多特异 性可活化抗体的核酸构建体的细胞，和(b)回收多特异性可活化抗体。

本发明还提供了多特异性可活化抗体和/或多特异性可活化抗体组 合物，其至少包括特异性结合第一靶标或第一表位的第一抗体或其抗 原结合片段(AB1)和结合第二靶标或第二表位的第二抗体或其抗原结 合片段(AB2)，其中至少AB1与掩蔽部分(MM1)偶联或以其它方式连接， 使得MM1的偶联降低AB1结合其靶标的能力。在一些实施方案中， MM1经由MMP和SP的CM1-CM2底物与AB1偶联，其中MMP和 SP中的至少一种与AB1的靶标在受试者中的治疗部位或诊断部位处共 定位。本文提供的多特异性可活化抗体在循环中是稳定的，在预期的 治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并 且当被活化时展现与相应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与AB1 的靶标的结合。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含在MM1和 CM1-CM2底物之间的连接肽。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含在CM1-CM2底物和 AB1之间的连接肽。

在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接 肽(LP2)，且未切割状态下的多特异性可活化抗体的至少一部分具有如 下的N-端至C-端的结构排列：MM1-LP1-CM1-CM2底物-LP2-AB1或 AB1-LP2-CM1-CM2底物-LP1-MM1。在一些实施方案中，两个连接肽 不需要彼此相同。

在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一种包括选自(GS)

在一些实施方案中，可活化抗体包括CM1和CM2之间的连接肽 (LP′)。

在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)、第二连接 肽(LP2)和CM1和CM2之间的连接肽(LP′)，且未切割状态下的多特异 性可活化抗体的至少一部分具有如下的N-端至C-端的结构排列： MM1-LP1-CM1-CM2底物-LP2-AB1或AB1-LP2-CM1-CM2底物 -LP1-MM1，在一些实施方案中，连接肽不需要彼此相同。

在一些实施方案中，LP′是GG。在一些实施方案中，LP′is GGSGGS (SEQ ID NO：350)。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括特异性结合第 一靶标或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和特异性结合 第二靶标或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施 方案中，多特异性可活化抗体中的每个AB独立地选自单克隆抗体、结 构域抗体、单链、Fab片段、F(ab′)

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个AB对于与其相 应的靶标或表位的结合具有约100nM或更低的解离常数。

在一些实施方案中，MM1与其相应的AB的结合的解离常数大于 AB与其相应的靶标或表位的结合的解离常数。

在一些实施方案中，MM1与其相应的AB的结合的解离常数不大 于AB与其相应的靶标或表位的结合的解离常数。

在一些实施方案中，当多特异性可活化抗体在切割状态下时，MM1 不干扰其相应的AB结合相应的靶标或表位或不与其相应的AB竞争结 合相应的靶标或表位。

在一些实施方案中，MM1是约2-40个氨基酸长的多肽。在一些实 施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM是不超过40个氨基酸长 的多肽。

在一些实施方案中，MM1的多肽序列不同于相应的AB的靶标的 序列。

在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的 结合配偶体具有不超过50％同一性。在一些实施方案中，MM1的多肽 序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过25％同一性。 在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合 配偶体具有不超过10％同一性。

在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表 位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常 数(K

在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表 位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常 数(K

在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表 位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常 数(K

在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表 位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常 数(K

在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表 位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常 数(K

在一些实施方案中，MM1是选自本文公开的MM的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括：第二掩蔽部 分(MM2)，其当所述多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB2 与其靶标的结合；和与AB2偶联的额外可切割部分(CM′)，其中CM′ 是起第二蛋白酶的底物的作用的CM1-CM2底物或多肽。在一些实施方 案中，CM′是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，CM′ 是CM1-CM2底物，其中CM1-CM2底物中的CM1和CM2各自独立地 不超过15个氨基酸的长度。

在一些实施方案中，MMP蛋白酶、SP蛋白酶和/或第二蛋白酶与 第二靶标或表位在组织中共定位，且其中当多特异性可活化抗体暴露 于MMP蛋白酶、SP蛋白酶和/或第二蛋白酶时MMP蛋白酶、SP蛋白 酶和/或第二蛋白酶切割多特异性可活化抗体中的CM′。在一些实施方 案中，MMP蛋白酶、SP蛋白酶和/或第二蛋白酶与第一靶标或表位和 第二靶标或表位在组织中共定位。在一些实施方案中，MMP蛋白酶、 SP蛋白酶和/或第二蛋白酶是相同的MMP蛋白酶和相同的SP蛋白酶。 在一些实施方案中，MMP蛋白酶、SP蛋白酶和/或第二蛋白酶不是相 同的MMP蛋白酶且不是相同的SP蛋白酶。在一些实施方案中， CM1-CM2底物和CM′是相同的MMP蛋白酶和相同的SP蛋白酶的不 同的底物。在一些实施方案中，切割CM′的蛋白酶选自表6中所示的 那些。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体(例如，MM1和至少MM2) 中的MM各自与其相应的AB的结合的解离常数大于AB与其相应的 靶标或表位的结合的解离常数。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的MM各自与其相应 的AB的结合的解离常数不大于AB与其相应的靶标或表位的结合的解 离常数。

在一些实施方案中，当多特异性可活化抗体在切割状态下时，多 特异性可活化抗体中的每个MM不干扰其相应的AB结合相应的靶标 或表位或不与其相应的AB竞争结合相应的靶标或表位。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM是约2-40 个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每 个MM是不超过40个氨基酸长的多肽。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序 列不同于相应的AB的靶标的多肽序列。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序 列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过50％同一性。在 一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序列与相 应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过25％同一性。在一些实 施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序列与相应的AB 的任何天然的结合配偶体具有不超过10％同一性。

在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标 或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解 离常数(K

在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标 或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解 离常数(K

在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标 或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解 离常数(K

在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标 或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解 离常数(K

在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标 或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解 离常数(K

在一些实施方案中，MM各自是选自本文公开的MM的氨基酸序 列。

在一些实施方案中，切割CM1-CM2底物序列的蛋白酶与多特异性 可活化抗体中的AB1的靶标在组织中共定位，且当多特异性可活化抗 体暴露于蛋白酶时MMP蛋白酶和/或SP蛋白酶(即，MMP蛋白酶和SP 蛋白酶中的至少一种)切割多特异性可活化抗体中的CM1-CM2底物。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括多于一种CM1-CM2 底物序列，且切割至少一种CM1-CM2底物序列的MMP蛋白酶和/或 SP蛋白酶与多特异性可活化抗体中的AB区域的至少一种的靶标在组 织中共定位，且当多特异性可活化抗体暴露于蛋白酶时MMP蛋白酶和 /或SP蛋白酶切割多特异性可活化抗体中的CM1-CM2底物。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少2倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少3倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少4倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少5倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少10倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少20倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少40倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少50倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少100倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

在一些实施方案中，每个CM1-CM2底物位于多特异性可活化抗体 中，使得在未切割状态下，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标 的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数 的至少200倍，而当在切割状态下，AB结合其靶标。

本发明还提供了包括多特异性可活化抗体的组合物和方法，所述 多特异性可活化抗体至少包括特异性结合靶标的第一抗体或抗体片段 (AB1)和第二抗体或抗体片段(AB2)，其中多特异性可活化抗体中的至 少第一AB与降低AB1结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM1)偶联。在 一些实施方案中，每个AB与降低其相应的AB对每个靶标的能力的 MM偶联。例如，在双特异性可活化抗体实施方案中，AB1与降低AB1 结合其靶标的能力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，且AB2与降低AB2结 合其靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方案中，多 特异性可活化抗体包含多于两个AB区域；在这样的实施方案中，对于 多特异性可活化抗体中的每个AB，AB1与降低AB1结合其靶标的能 力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，AB2与降低AB2结合其靶标的能力的 第二掩蔽部分(MM2)偶联，AB3与降低AB3结合其靶标的能力的第三 掩蔽部分(MM3)偶联等等。

在一些实施方案中，多特异性可活化抗体还包括作为MMP蛋白酶 和SP蛋白酶的底物的至少一种CM1-CM2底物，其中CM1-CM2底物 连接MM与AB。例如，在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少 包括特异性结合靶标的第一抗体或抗体片段(AB1)和第二抗体或抗体 片段(AB2)，其中多特异性可活化抗体中的至少第一AB经由第一 CM1-CM2底物与降低AB1结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM1)偶联。 在一些双特异性可活化抗体实施方案中，AB1经由第一CM1-CM2底 物与MM1偶联，且AB2经由第二CM1-CM2底物与降低AB2结合其 靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方案中，多特异 性可活化抗体包含多于两个AB区域；在这些实施方案的一些中，对于 多特异性可活化抗体中的每个AB，AB1经由第一CM1-CM2底物与 MM1偶联，AB2经由第二CM1-CM2底物与MM2偶联，且AB3经由 第三CM1-CM2底物与降低AB3结合其靶标的能力的第三掩蔽部分 (MM3)偶联等等。

本发明还提供了包括非结合空间部分(NB)或非结合空间部分的结 合配偶体(BP)的可活化抗体，其中BP招募或以其它方式将NB吸引至 可活化抗体。本文提供的可活化抗体包括例如包括非结合立体部分 (NB)、CM1-CM2底物和结合靶标的抗体或抗体片段(AB)的可活化抗体； 包括非结合空间部分的结合配偶体(BP)、CM1-CM2底物和AB的可活 化抗体；和包含已经招募NB的BP、CM1-CM2底物和结合靶标的AB 的可活化抗体。其中NB与可活化抗体的CM1-CM2底物和AB共价连 接或通过与可活化抗体的CM1-CM2底物和AB共价连接的BP相互作 用而缔合的可活化抗体在本文中称为“含有NB的可活化抗体”。可活 化或可变换的意指可活化抗体当可活化抗体在抑制、掩蔽或未切割状 态下(即，第一构象)时展现与靶标的第一结合水平，且当可活化抗体在 未抑制、未掩蔽和/或切割状态下(即，第二构象，即，活化的抗体)时 展现与靶标的第二结合水平，其中第二靶标结合水平大于第一靶标结 合水平。与常规抗体治疗剂相比，可活化抗体组合物可以展现增加的 生物利用度和更有利的生物分布。

在一些实施方案中，可活化抗体提供降低的毒性和/或不良副作用， 如果AB未被掩蔽或以其它方式被抑制免于结合非治疗部位和/或非诊 断部位，则所述毒性和/或不良副作用可以其它方式由在这样的部位处 的结合导致。

在一个实施方案中，可活化抗体包括非结合立体部分(NB)； CM1-CM2底物；和特异性结合靶标的抗体或抗体片段(AB)，其中NB 是不特异性结合AB的多肽；CM1-CM2底物是包括酶的底物(S)的多肽； CM1-CM2底物被定位，使得在未切割状态下，NB干扰AB与靶标的 结合，且在切割状态下，NB不干扰AB与靶标的结合；且NB不抑制 酶对CM1-CM2底物的切割。如本文和全文所用，术语多肽是指包括至 少两个氨基酸残基的多肽，包括较大多肽、全长蛋白及其片段，且术 语多肽不限于单链多肽，并且可以包括多单体，例如，多链、多肽。 在多肽具有较短长度(例如，总共小于50个氨基酸)的情况下，术语肽 和多肽在本文中可互换使用，并且在多肽具有较长长度(例如，50个氨 基酸或更多)的情况下，术语多肽和蛋白在本文中可互换使用。

在一个实施方案中，可活化抗体包括非结合立体部分(NB)； CM1-CM2底物；和特异性结合靶标的抗体或抗体片段(AB)，其中(i)NB 包括不特异性结合AB的多肽；(ii)CM1-CM2底物是包括酶的底物(S) 的最长达50个氨基酸长度的多肽；(iii)CM1-CM2底物被定位，使得在 未切割状态下，NB干扰AB与靶标的结合，且在切割状态下，NB不 干扰AB与靶标的结合；且(iv)NB不抑制酶对CM1-CM2底物的切割。 例如，CM1-CM2底物的CM1底物序列和CM2底物序列各自独立地具 有最多达15个氨基酸的长度。

在一个实施方案中，可活化抗体包括非结合立体部分(NB)； CM1-CM2底物；和特异性结合靶标的抗体或抗体片段(AB)，其中(i)NB 包括不特异性结合AB的多肽；(ii)CM1-CM2底物是包括酶的底物(S) 的多肽；(iii)CM1-CM2底物被定位，使得在未切割状态下，NB干扰AB与靶标的结合，且在切割状态下，NB不干扰AB与靶标的结合； (iv)NB不抑制酶对CM1-CM2底物的切割；且(v)未切割状态下的可活 化抗体具有如下的N-端至C-端的结构排列：NB-CM1-CM2底物-AB 或AB-CM1-CM2底物-NB。

在一个实施方案中，可活化抗体包括非结合立体部分(NB)； CM1-CM2底物；和特异性结合靶标的抗体或抗体片段(AB)，其中(i)NB 包括不特异性结合AB的多肽；(ii)CM1-CM2底物是包括酶的底物(S) 的多肽；(iii)CM1-CM2底物被定位，使得在未切割状态下，NB干扰AB与靶标的结合，且在切割状态下，NB不干扰AB与靶标的结合， 且其中与切割的AB结合靶标的能力相比，切割的可活化抗体中的NB 使AB结合靶标的能力降低至少50％、例如至少60％、至少70％、至 少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至 少97％、至少98％、至少99％、至少100％；且(iv)NB不抑制酶对 CM1-CM2底物的切割。例如使用如本文所述的测定法或体外靶标置换 测定法，例如PCT公开号WO 2009/025846和WO2010/081173中描述 的测定法，确定AB结合靶标的能力的降低。

在一个实施方案中，可活化抗体包括非结合立体部分(NB)的结合 配偶体；CM1-CM2底物；和特异性结合靶标的抗体或抗体片段(AB)， 其中BP是当暴露于NB时结合其的多肽；NB不特异性结合AB； CM1-CM2底物是包括酶的底物(S)的多肽；CM1-CM2底物被定位，使得在未切割状态下在NB寸智能的情况下，NB干扰AB与靶标的结合， 且在切割状态下，NB不干扰AB与靶标的结合且BP不干扰AB与靶 标的结合；且NB和BP不抑制酶对CM1-CM2底物的切割。在该实施 方案的一些实施方案中，可活化抗体的BP与NB任选地结合。在一个 实施方案中，NB在体内由可活化抗体的BP招募。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 被配制成组合物。在这些实施方案中的一些中，组合物还包括NB，其 中NB与包括BP、CM1-CM2底物和AB的可活化抗体共同配制。在该 实施方案的一些实施方案中，BP选自白蛋白结合肽、纤维蛋白原结合 肽、纤连蛋白结合肽、血红蛋白结合肽、转铁蛋白结合肽、免疫球蛋 白结构域结合肽和其它血清蛋白结合肽。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，NB是可溶性 球状蛋白。在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，NB是 在血流中循环的蛋白。在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实 例中，NB选自白蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、血红蛋白、转铁蛋白、 免疫球蛋白结构域和其它血清蛋白。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，CM1-CM2底 物是包括蛋白酶的底物(S)的多肽。在这些可活化抗体实施方案中任一 个的一些实例中，蛋白酶与靶标在组织中共定位，且当可活化抗体暴 露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化抗体中的CM1-CM2底物。在这些可 活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，CM1-CM2底物是最多达50 个氨基酸长的多肽。在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例 中，CM1-CM2底物是包括长达15个氨基酸的长度、例如3个氨基酸 长、4个氨基酸长、5个氨基酸长、6个氨基酸长、7个氨基酸长、8个 氨基酸长、9个氨基酸长、10个氨基酸长、11个氨基酸长、12个氨基 酸长、13个氨基酸长、14个氨基酸长或15个氨基酸长的底物的多肽。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，未切割状态 下的可活化抗体具有如下的N-端至C-端的结构排列：NB-CM1-CM2 底物-AB、AB-CM1-CM2底物-NB、BP-CM1-CM2底物-AB或 AB-CM1-CM2底物-BP。在其中可活化抗体包括BP且可活化抗体在相 应的NB存在下的实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的 N-端至C-端的结构排列：NB：BP-CM1-CM2-AB、NB：BP-CM2-CM1-AB、 AB-CM1-CM2-BP：NB或AB-CM2-CM1-BP：NB，其中“：”代表NB和 BP之间的相互作用，例如结合。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 包括特异性结合给定靶标的抗体或其抗原结合片段，并且是单克隆抗 体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab′)

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 包括包含本文呈现的氨基酸序列的可变重链区和包含本文呈现的氨基 酸序列的可变轻链区的组合。在一些实施方案中，在一些实施方案中， 可活化抗体包括包含与本文呈现的氨基酸序列具有至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基 酸序列的可变重链区和包含与本文呈现的氨基酸序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性 的氨基酸序列的可变轻链区的组合。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 还包括与AB缀合的试剂。在一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些 实施方案中，试剂是抗肿瘤剂。在一些实施方案中，试剂是毒素或其 片段。在一些实施方案中，试剂经由接头与AB缀合。在一些实施方案 中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，试剂经由不可切割接头 与AB缀合。在一些实施方案中，试剂是选自表3中所列的试剂。在一 些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，试剂是核酸 损伤剂，诸如DNA烷化剂或DNA嵌入剂，或其它DNA损伤剂。在 一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿 里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生 物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实 施方案中，试剂是单甲基阿里他汀D(MMAD)。在一些实施方案中， 试剂是美登木素生物碱或美登木素生物碱衍生物。在一些实施方案中， 试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin) 或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是加利车霉素或其衍生物。在 一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 还包括可检测部分。在一些实施方案中，可检测部分是诊断剂。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 还包括间隔区。在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中， 可活化抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，信号肽经由间隔区与 可活化抗体缀合。在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中， 间隔区直接连接至可活化抗体的MM。

在一些实施方案中，可活化抗体的血清半衰期比相应的抗体的血 清半衰期更长；例如，可活化抗体的pK比相应的抗体的pK更长。在 一些实施方案中，可活化抗体的血清半衰期类似于相应的抗体的血清 半衰期。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清 半衰期是至少15天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化 抗体的血清半衰期是至少12天。在一些实施方案中，当施用于生物体 时，可活化抗体的血清半衰期是至少11天。在一些实施方案中，当施 用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少10天。在一些实施方 案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少9天。在 一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至 少8天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清 半衰期是至少7天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化 抗体的血清半衰期是至少6天。在这些可活化抗体实施方案中任一个 的一些实例中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少5 天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰 期是至少4天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体 的血清半衰期是至少3天。在一些实施方案中，当施用于生物体时， 可活化抗体的血清半衰期是至少2天。在一些实施方案中，当施用于 生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少24小时。在一些实施方案 中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少20小时。在 一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至 少18小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血 清半衰期是至少16小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可 活化抗体的血清半衰期是至少14小时。在一些实施方案中，当施用于 生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少12小时。在一些实施方案 中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少10小时。在 一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至 少8小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血 清半衰期是至少6小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可 活化抗体的血清半衰期是至少4小时。在一些实施方案中，当施用于 生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少3小时。

本发明还提供了编码任何这些可活化抗体的分离的核酸分子，以 及包括这些分离的核酸序列的载体。本发明提供了通过在导致表达可 活化抗体的条件下培养细胞来产生可活化抗体的方法，其中所述细胞 包含这样的核酸序列。在一些实施方案中，所述细胞包含这样的载体。

含有NB的可活化抗体对靶标的解离常数(K

当含有NB的可活化抗体在靶标存在下时，与AB当其不与NB或 NB：BP缔合时与靶标的特异性结合相比，AB与靶标的特异性结合被降 低或抑制。当含有NB的可活化抗体在靶标存在下时，与亲本AB与靶 标的特异性结合相比，AB与靶标的特异性结合被降低或抑制。当与未 与NB或NB：BP缔合的AB与靶标的结合或亲本AB与靶标的结合相 比时，当在体内和/或在体外测量时，含有NB的可活化抗体结合靶标 的能力降低，例如降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％持续至少2、4、6、8、 12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、 45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11或12个月或更长。

当含有NB的可活化抗体在靶标存在下、但在修饰剂(例如蛋白酶 或其它酶)不存在下时，与AB当其不与NB或NB：BP缔合时与靶标的 特异性结合相比，AB与靶标的特异性结合被降低或抑制。当含有NB 的可活化抗体在靶标存在下、但在修饰剂(例如蛋白酶、其它酶、还原 剂或光)不存在下时，与亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与靶标 的特异性结合被降低或抑制。当与未与NB或NB：BP缔合的AB与靶 标的结合或亲本AB与靶标的结合相比时，当在体内和/或在体外测量 时，含有NB的可活化抗体结合靶标的能力降低，例如降低至少50％、 60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或甚至100％持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、 72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180 天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 包括与AB缀合以产生可活化抗体缀合物的试剂。在可活化抗体缀合物 的一些实施方案中，试剂是治疗剂。在一些实施方案中，试剂是诊断 剂。在一些实施方案中，试剂是可检测标记物。在可活化抗体缀合物 的一些实施方案中，试剂是抗肿瘤剂。在可活化抗体缀合物的一些实 施方案中，试剂是毒素或其片段。在可活化抗体缀合物的一些实施方 案中，试剂经由接头与AB缀合。在可活化抗体缀合物的一些实施方案 中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，试剂经由不可切割接头 与AB缀合。在一些实施方案中，试剂是微管抑制剂。在一些实施方案中，试剂是核酸损伤剂，诸如DNA烷化剂或DNA嵌入剂，或其它DNA 损伤剂。在一些实施方案中，试剂是选自表3中所列的试剂。在一些 实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他 汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。 在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方 案中，试剂是单甲基阿里他汀D(MMAD)。在一些实施方案中，试剂 是美登木素生物碱或美登木素生物碱衍生物。在一些实施方案中，试 剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin) 或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是加利车霉素或其衍生物。在 一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂

在这些可活化抗体实施方案中任一个的一些实例中，可活化抗体 是双重靶标结合可活化抗体。这样的双重靶标结合可活化抗体含有可 以结合相同或不同靶标的两个Ab。在具体实施方案中，双重靶向可活 化抗体含有双特异性抗体或抗体片段。

双重靶标结合可活化抗体被设计为具有可被切割剂切割的 CM1-CM2底物，所述切割剂与能够结合可活化抗体的AB的靶标中的 一者或两者共定位于靶组织中。具有多于一个针对相同或不同靶标的AB的双重靶标结合可活化抗体可以被设计为具有多于一个CM1-CM2 底物，其中第一CM1-CM2底物可被第一靶组织中的切割剂切割，且其 中第二CM1-CM2底物可被第二靶组织中的切割剂切割，其中靶标中的 一种或多种结合可活化抗体的AB。在一个实施方案中，第一和第二靶 组织在空间上分离，例如在生物体中的不同部位。在一个实施方案中， 第一和第二靶组织是时间上分离的相同组织，例如在两个不同时间点 的相同组织，例如第一时间点是当组织是早期肿瘤时，且第二时间点 是当组织是晚期肿瘤时。

本发明还提供了编码本文所述的可活化抗体的核酸分子。本发明 还提供了包含这些核酸的载体。本文所述的可活化抗体通过在导致可 活化抗体表达的条件下培养细胞来产生，其中所述细胞包括这些核酸 分子或载体。

本发明还提供了制备可活化抗体的方法。在一个实施方案中，所 述方法包括以下步骤：(a)在导致表达所述可活化抗体的条件下培养包 括编码所述可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中所述可活化抗体包 括(i)非结合立体部分(NB)；(ii)CM1-CM2底物；和(iii)特异性结合靶标 的抗体或其抗原结合片段(AB)，其中(1)NB不特异性结合AB；(2) CM1-CM2底物是包括酶的底物(S)的多肽；(3)CM1-CM2底物被定位， 使得在未切割状态下，NB干扰AB与靶标的结合，且在切割状态下， NB不干扰AB与靶标的结合；且(4)NB不抑制酶对CM1-CM2底物的 切割；且(b)回收可活化抗体。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)在导致表达所述 可活化抗体的条件下培养包括编码所述可活化抗体的核酸构建体的细 胞，其中所述可活化抗体包括(i)非结合立体部分(NB)的结合配偶体(BP)； (ii)CM1-CM2底物；和(iii)特异性结合靶标的抗体或其抗原结合片段 (AB)，其中(1)NB不特异性结合AB；(2)CM1-CM2底物是包括酶的底 物(S)的多肽；(3)CM1-CM2底物被定位，使得在未切割状态下在NB 寸智能的情况下，NB干扰AB与靶标的结合，且在切割状态下，NB 不干扰AB与靶标的结合且BP不干扰AB与靶标的结合；且(4)NB和 BP不抑制酶对CM1-CM2底物的切割；且(b)回收可活化抗体。在该实 施方案的一些实施方案中，可活化抗体的BP与NB结合。

应理解，本发明的治疗实体的施用将与合适的载体、赋形剂和并 入制剂中以提供改进的转移、递送、耐受性等的其它试剂一起施用。 大多数合适的制剂可见于所有制药化学家已知的药典：Remington′s Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack PublishingCompany，Easton，PA (1975))，特别是其中Blaug，Seymour的第87章。这些制剂包括例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离 子)的囊泡(诸如Lipofectin

包括缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的本发明的 治疗制剂用于预防、治疗或以其它方式改善与异常靶标表达和/或活性 相关的疾病或病症。例如，包括缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的 可活化抗体的本发明的治疗制剂用于治疗或改善炎症、炎性病症、自 身免疫疾病和/或癌症或其它肿瘤病况。在一些实施方案中，癌症是其 中表达靶标的实体肿瘤或血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是 其中表达靶标的实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症是其中表达靶标 的血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，靶标在薄壁组织上(例如，在癌 症中，通常实施器官或组织的功能的器官或组织的部分)表达。在一些 实施方案中，靶标在细胞、组织或器官上表达。在一些实施方案中， 靶标在基质(即，细胞、组织或器官的结缔支持构架)上表达。在一些实 施方案中，靶标在成骨细胞上表达。在一些实施方案中，靶标在内皮(血 管系统)上表达。在一些实施方案中，靶标在癌干细胞上表达。在一些 实施方案中，缀合可活化抗体的试剂是微管抑制剂。在一些实施方案 中，缀合可活化抗体的试剂是核酸损伤剂。

与用于诊断或治疗与靶标表达和/或活性(诸如例如异常的靶标表 达和/或活性)相关的疾病或病症的任何已知方法相关地确定预防、改善 或治疗的有效性。在受试者中延长受试者的存活或以其它方式延迟与 靶标表达和/或活性(例如异常的靶标表达和/或活性)相关的疾病或病症 的进展表明缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体赋予临床 益处。

缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体可以以药物组合 物的形式施用。制备这样的组合物中涉及的原理和考量以及组分选择 的指导提供于例如Remington：The Science and Practice Of Pharmacy第 19版(Alfonso R.Gennaro，等人编辑)MackPub.Co.，Easton，Pa.：1995； Drug Absorption Enhancement：Concepts，Possibilities，Limitations，and Trends，Harwood Academic Publishers，Langhorne，Pa.，1994；和Peptide and Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences，Vol.4)，1991， M.Dekker，New York。

在其中使用抗体片段的一些实施方案中，选择特异性结合靶标蛋 白的结合结构域的最小片段。例如，根据抗体的可变区序列，可设计 保留结合靶标蛋白序列的能力的肽分子。这样的肽可经化学合成和/或 通过重组DNA技术产生。(参见例如，Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，90：7889-7893(1993))。所述制剂还可含有所治疗的特定适应症所 必需的超过一种活性化合物，例如，在一些实施方案中，具有补充活 性的那些，它们不会不利地彼此影响。在一些实施方案中或另外，组 合物可包含提高其功能的试剂，诸如例如细胞毒性剂、细胞因子、化 学治疗剂或生长抑制剂。这样的分子以对预期目的有效的量合适地组 合存在。

活性成分也可被包封在微囊中，所述微囊在胶体药物递送系统(例 如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒和纳米囊)或大乳剂中例如通 过凝聚技术或通过界面聚合(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊和 聚-(异丁烯酸甲酯)微囊)制备。

待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过无菌滤膜过滤容易 实现。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有抗体 的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型物的形式，例如， 膜或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基- 异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773，919)、L-谷氨酸 和v乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解 的乳酸-羟乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOT

在一些实施方案中，缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化 抗体含有可检测标记。使用完整抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab)

本发明的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还可用 于各种诊断性和预防性制剂。在一个实施方案中，将缀合的抗体、可 活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于处于发生一种或多种前述病症 的风险的患者。患者或器官对一种或多种前述病症的素因可使用基因 型、血清学或生物化学标记物确定。

在一个实施方案中，将缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活 化抗体施用于诊断患有与一种或多种前述病症相关的临床适应症的人 个体。在诊断后，施用缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体以减轻或逆转临床适应症的影响。

本发明的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还可用 于检测患者样品中的靶标且因此可用作诊断剂。例如，本发明的抗体 和/或可活化抗体及其缀合版本用于体外测定法，例如，ELISA，以检 测患者样品中的一种或多种靶标水平。

在一个实施方案中，本发明的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合 的可活化抗体固定在固体支持物(例如，微量滴定板的孔)上。固定的缀 合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体用作测试样品中可存在 的任何靶标的捕获抗体。将固定的抗体与患者样品接触之前，将固体 支持物清洗，和用封闭试剂诸如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。

随后，将孔用疑似含有抗原的测试样品或用含有标准量的抗原的 溶液处理。此样品是例如来自疑似具有被认为是病理诊断的循环抗原 水平的受试者的血清样品。在洗去测试样品或标准品后，固体支持物 用可检测标记的第二抗体处理。标记的第二抗体用作检测抗体。测量 可检测标记的水平，测试样品中靶抗原的浓度通过与自标准样品产生 的标准曲线相比较来测定。

应理解，基于在体外诊断测定法中使用本发明的抗体和其缀合版 本获得的结果，可能基于靶抗原的表达水平将受试者的疾病分期。对 于给定的疾病，从诊断为处于疾病进展中的各种阶段和/或处于疾病的 治疗处理中的各个点的受试者获取血液样品。使用对进展或治疗的各 阶段提供统计学显著结果的一组样品，指定可被认为是各阶段的特征 的抗原的浓度范围。

缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还可用于诊断和/ 或成像方法。在一些实施方案中，这样的方法为体外方法。在一些实 施方案中，这样的方法为体内方法。在一些实施方案中，这样的方法 为原位方法。在一些实施方案中，这样的方法为离体方法。例如，具 有酶促可切割的CM1-CM2底物的可活化抗体可用于检测能够切割 CM1-CM2底物的酶的存在或不存在。这样的可活化抗体可用于诊断， 其可包括通过在给定宿主生物体的给定细胞或组织中测量的活化的抗 体(即，由可活化抗体的切割所产生的抗体)的累积，体内检测(例如定 性或定量)酶活性(或者在一些实施方案中，还原电位增加的环境，诸如 其可提供二硫键的还原)。活化的抗体的这样的累积不仅表明所述组织 表达酶活性(或增加的还原电位，取决于CM1-CM2底物的性质)，而且 还表明所述组织表达活化的抗体结合的靶标。

例如，可选择CM1-CM2底物为在肿瘤部位处、在病毒或细菌感染 部位处、在生物学限制的部位处(诸如在脓肿中、在器官中等)等存在的 基质金属蛋白酶(MMP)和丝氨酸蛋白酶(SP)的蛋白酶底物。AB可以是 结合靶抗原的AB。使用如本文公开的方法，或当适当时，本领域技术 人员熟悉的方法，可检测的标记(例如荧光标记或放射性标记或放射性 示踪剂)可与AB或抗体和/或可活化抗体的其它区域缀合。合适的可检 测的标记在上述筛选方法的文中进行讨论，且其它具体的实例在下文 提供。使用对疾病状态的蛋白或肽特异性的AB以及在目标疾病组织中 其活性升高的MMP，可活化抗体将表现出相对于其中CM1-CM2底物 特异性的酶不以可检测的水平存在或以比在疾病组织中低的水平存在 或无活性(例如，呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，对疾病组织的结 合率增加。因为小的蛋白和肽从血液中通过肾过滤系统快速清除，且 因为对CM1-CM2底物特异性的酶不以可检测的水平存在(或在非疾病 组织中以较低水平存在或以无活性构象存在)，在疾病组织中活化的多 特异性抗体的累积相对于非疾病组织提高。

在另一个实例中，可活化抗体可用于检测样品中切割剂的存在或 不存在。例如，在可活化抗体含有对酶切割敏感的CM1-CM2底物的情 况下，可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中酶的存在。在另 一个实例中，在可活化抗体含有对还原剂切割敏感的CM1-CM2底物的 情况下，可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中还原条件的存在。为了便于在这些方法中分析，可活化抗体可经可检测标记，且可 结合至支持物(例如，固体支持物，诸如载片或珠粒)。可检测的标记可 置于在切割后不释放的可活化抗体的部分上，例如可检测的标记可以 是直到发生切割时才可检测的猝灭的荧光标记或其它标记。测定法可 如下进行：例如通过使固定的可检测标记的可活化抗体与疑似含有酶 和/或还原剂的样品接触足以发生切割的一段时间，然后洗涤以除去过 量的样品和污染物。然后通过在与样品接触之前可活化抗体的可检测 信号的变化，例如由于样品中的切割剂切割可活化抗体导致的可检测 信号的存在和/或增加，评价在样品中切割剂(例如酶或还原剂)的存在 或不存在。

这样的检测方法可适合于还提供当切割时能够结合可活化抗体的 AB的靶标的存在或不存在的检测。因此，所述测定法可适合于评价切 割剂的存在或不存在和目标靶标的存在或不存在。切割剂的存在或不 存在可通过上述可活化抗体的可检测的标记的存在和/或增加来检测， 且靶标的存在或不存在可通过检测靶标-AB复合物，例如通过使用可 检测标记的抗靶标抗体来检测。

可活化抗体还可用于原位成像以验证可活化抗体活化(例如通过蛋 白酶切割)和与特定靶标的结合。原位成像是能够在生物样品诸如细胞 培养物或组织切片中定位蛋白水解活性和靶标的技术。使用该技术， 可能基于可检测的标记(例如荧光标记)的存在证实与给定靶标的结合 和蛋白水解活性两者。

这些技术可用于源自疾病部位(例如肿瘤组织)或健康组织的任何 冷冻细胞或组织。这些技术还可用于新鲜细胞或组织样品。

在这些技术中，可活化抗体用可检测的标记进行标记。可检测的 标记可以是荧光染料(例如荧光团、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸 若丹明(TRITC)、Alexa

已与标记的可活化抗体温育的样品中标记的检测表明，样品含有 靶标和含有对可活化抗体的CM1-CM2底物特异性的基质金属蛋白酶 (MMP)和一种丝氨酸蛋白酶(SP)。在一些实施方案中，MMP的存在可 使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文描述的那些和/或通过使用对蛋白酶特 异性的试剂(例如抗体诸如A11，其对蛋白酶基质蛋白酶(MT-SP1)特异 性并抑制基质蛋白酶的蛋白水解活性；参见例如，公开于2010年11 月11日的国际公开号WO2010/129609来证实。使用广谱蛋白酶抑制 剂诸如本文描述的那些和/或通过使用更有选择性的抑制剂的相同方法 可用于鉴定对可活化抗体的CM1-CM2底物特异性的MMP和SP。在一些实施方案中，靶标的存在可使用对靶标特异性的试剂(例如另一种 抗体)来证实，或可检测的标记可与未标记的靶标竞争。在一些实施方 案中，未标记的可活化抗体可用于通过标记的第二抗体或更复杂的检 测系统进行的检测。

类似的技术也可用于体内成像，其中在受试者(例如哺乳动物，包 括人类)中荧光信号的检测表明疾病部位包含靶标和包含对可活化抗体 的CM1-CM2底物特异性的MMP和SP。

这些技术还可用于试剂盒和/或用作试剂以基于可活化抗体中的蛋 白酶特异性CM1-CM2底物在各种细胞、组织和生物体中检测、鉴定或 表征蛋白酶活性。

本发明提供了在各种诊断和/或预防适应症中使用抗体和/或可活 化抗体的方法。例如，本发明提供了通过如下检测受试者或样品中切 割剂和目标靶标的存在或不存在的方法：(i)使受试者或样品与可活化 抗体接触，其中可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、被切割剂切割的 CM1-CM2底物和特异性结合目标靶标的抗原结合结构域或其片段 (AB)，其中未切割的非活化状态下的可活化抗体具有如下的N-端至C- 端的结构排列：MM-CM1-CM2底物-AB或AB-CM1-CM2底物-MM； (a)其中MM是抑制AB与靶标的结合的肽，且其中MM不具有AB的 天然存在的结合配偶体的氨基酸序列且不是AB的天然结合配偶体的 修饰形式；且(b)其中在未切割的非活化状态下，MM干扰AB与靶标 的特异性结合，且在切割的活化状态下，MM不干扰AB特异性结合靶 标或不与AB1竞争特异性结合靶标；和(ii)测量受试者或样品中的活化 的可活化抗体的水平，其中受试者或样品中的活化的可活化抗体的可 检测水平表明切割剂和靶标存在于受试者或样品中，且其中受试者或 样品中的活化的可活化抗体的不可检测水平表明切割剂、靶标或切割 剂和靶标两者不存在和/或不充分地存在于受试者或样品中。在一些实 施方案中，可活化抗体是与治疗剂缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，可活化抗体不与试剂缀合。在一些实施方案中，可活化抗体包 含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实 施方案中，测量受试者或样品中的可活化抗体的水平使用特异性结合 可活化抗体的第二试剂来实现，其中所述试剂包含可检测标记。在一 些实施方案中，第二试剂是包含可检测标记的抗体。

本发明还提供了通过如下检测受试者或样品中切割剂的存在或不 存在的方法：(i)在目标靶标(例如靶标)存在的情况下使受试者或样品与 可活化抗体接触，其中可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、被切割剂切割 的CM1-CM2底物和特异性结合目标靶标的抗原结合结构域或其片段 (AB)，其中未切割的非活化状态下的可活化抗体具有如下的N-端至C- 端的结构排列：MM-CM1-CM2底物-AB或AB-CM1-CM2底物-MM； (a)其中MM是抑制AB与靶标的结合的肽，且其中MM不具有AB的 天然存在的结合配偶体的氨基酸序列且不是AB的天然结合配偶体的 修饰形式；且(b)其中在未切割的非活化状态下，MM干扰AB与靶标 的特异性结合，且在切割的活化状态下，MM不干扰AB特异性结合靶 标或不与AB1竞争特异性结合靶标；和(ii)测量受试者或样品中的活化 的可活化抗体的水平，其中受试者或样品中的活化的可活化抗体的可 检测水平表明切割剂存在于受试者或样品中，且其中受试者或样品中 的活化的可活化抗体的不可检测水平表明切割剂不存在和/或不充分地 存在于受试者或样品中。在一些实施方案中，可活化抗体是与治疗剂 缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，可活化抗体不与试剂缀合。 在一些实施方案中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施方案中， 可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，测量受试者或样品中的可 活化抗体的水平使用特异性结合可活化抗体的第二试剂来实现，其中 所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，第二试剂是包含可检 测标记的抗体。

本发明还提供了用于检测受试者或样品中切割剂和靶标的存在或 不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少可活化抗体，所 述可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、被切割剂切割的CM1-CM2底物和 特异性结合目标靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中未切割的 非活化状态下的可活化抗体具有如下的N-端至C-端的结构排列： MM-CM1-CM2底物-AB或AB-CM1-CM2底物-MM；(a)其中MM是抑 制AB与靶标的结合的肽，且其中MM不具有AB的天然存在的结合 配偶体的氨基酸序列且不是AB的天然结合配偶体的修饰形式；且(b)其中在未切割的非活化状态下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，且 在切割的活化状态下，MM不干扰AB特异性结合靶标或不与AB竞争 特异性结合靶标；和(ii)测量受试者或样品中的活化的可活化抗体的水 平，其中受试者或样品中的活化的可活化抗体的可检测水平表明切割 剂存在于受试者或样品中，且其中受试者或样品中的活化的可活化抗 体的不可检测水平表明切割剂不存在和/或不充分地存在于受试者或样 品中。在一些实施方案中，可活化抗体是与治疗剂缀合的可活化抗体。 在一些实施方案中，可活化抗体不与试剂缀合。在一些实施方案中， 可活化抗体包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，测量受试者或样品中的可活化抗体的水平使 用特异性结合可活化抗体的第二试剂来实现，其中所述试剂包含可检 测标记。在一些实施方案中，第二试剂是包含可检测标记的抗体。

本发明还提供了通过如下检测受试者或样品中切割剂的存在或不 存在的方法：(i)使受试者或样品与可活化抗体接触，其中可活化抗体 包含掩蔽部分(MM)、被切割剂切割的CM1-CM2底物、特异性结合靶 标的抗原结合结构域(AB)和可检测标记，其中未切割的非活化状态下 的可活化抗体具有如下的N-端至C-端的结构排列：MM-CM1-CM2底 物-AB或AB-CM1-CM2底物-MM；其中MM是抑制AB与靶标的结合 的肽，且其中MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列 且不是AB的天然结合配偶体的修饰形式；其中在未切割的非活化状态 下，MM干扰AB与靶标的特异性结合，且在切割的活化状态下，MM 不干扰AB特异性结合靶标或不与AB1竞争特异性结合靶标；且其中 可检测标记位于可活化抗体的部分上，其在切割CM1-CM2底物后释放； 和(ii)测量受试者或样品中的可检测标记的水平，其中受试者或样品中 的可检测标记的可检测水平表明切割剂不存在和/或不充分地存在于受 试者或样品中，且其中受试者或样品中的可检测标记的不可检测水平 表明切割剂存在于受试者或样品中。在一些实施方案中，可活化抗体 是与治疗剂缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，可活化抗体不与 试剂缀合。在一些实施方案中，可活化抗体包含可检测标记。在一些 实施方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，测量受试者 或样品中的可活化抗体的水平使用特异性结合可活化抗体的第二试剂 来实现，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，第二试 剂是包含可检测标记的抗体。

本发明还提供了用于检测受试者或样品中切割剂和靶标的存在或 不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少用于使受试者或 生物样品接触的本文所述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体(缀合 治疗剂的可活化抗体)以及用于检测受试者或生物样品中的活化的可活 化抗体和/或缀合的可活化抗体的水平的装置，其中受试者或生物样品 中的活化的可活化抗体的可检测水平表明切割剂和靶标存在于受试者 或生物样品中，且其中受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的不 可检测水平表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在和/或不充分 地存在于受试者或生物样品中，使得在受试者或生物样品中不能检测 到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割。

本发明还提供了通过如下检测受试者或样品中切割剂的存在或不 存在的方法：(i)在靶标存在的情况下使受试者或生物样品与可活化抗 体接触，且(ii)测量受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的水平， 其中受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平表明切割 剂存在于受试者或生物样品中，且其中受试者或生物样品中的活化的 可活化抗体的不可检测水平表明切割剂不以可检测水平存在和/或不充 分地以可检测水平存在于受试者或生物样品中，使得在受试者或生物 样品中不能检测到可活化抗体的蛋白酶切割。这样的可活化抗体包括 掩蔽部分(MM)、被切割剂切割的CM1-CM2底物和特异性结合靶标的 抗原结合结构域或其片段(AB)，其中未切割(即非活化)状态下的可活化 抗体具有如下的N-端至C-端的结构排列：MM-CM1-CM2底物-AB或 AB-CM1-CM2底物-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标的结合的肽， 且其中MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；且(b) 其中未切割状态下的可活化抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合， 且其中切割(即活化)状态下的可活化抗体的MM不干扰AB特异性结合 靶标或竞争AB特异性结合靶标。在一些实施方案中，可活化抗体是与 治疗剂缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，可活化抗体不与试剂 缀合。在一些实施方案中，可检测标记与掩蔽部分连接。在一些实施 方案中，可检测标记与蛋白酶切割位点N-端的可切割部分。在一些实 施方案中，AB的单一抗原结合位点被掩蔽。在其中本发明的抗体具有 至少两个抗原结合位点的一些实施方案中，至少一个抗原结合位点被 掩蔽且至少一个抗原结合位点未被掩蔽。在一些实施方案中，所有抗 原结合位点都被掩蔽。在一些实施方案中，测量步骤包括使用包含可 检测标记的二级试剂。

本发明还提供了用于检测受试者或样品中切割剂和靶标的存在或 不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少本文所述的可活 化抗体和/或缀合的可活化抗体，其用于使受试者或生物样品与可活化 抗体在靶标存在的情况下接触以及测量受试者或生物样品中的活化的 可活化抗体的水平，其中受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可检测水平表明切割剂存在于受试者或生物样品中，且其中受试者或 生物样品中的活化的可活化抗体的不可检测水平表明切割剂不以可检 测水平存在和/或不充分地以可检测水平存在于受试者或生物样品中， 使得在受试者或生物样品中不能检测到可活化抗体的蛋白酶切割。这 样的可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、被切割剂切割的CM1-CM2底物 和特异性结合靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中未切割(即非 活化)状态下的可活化抗体具有如下的N-端至C-端的结构排列： MM-CM1-CM2底物-AB或AB-CM1-CM2底物-MM；(a)其中MM是抑 制AB与靶标的结合的肽，且其中MM不具有AB的天然存在的结合 配偶体的氨基酸序列；且(b)其中未切割状态下的可活化抗体的MM干 扰AB与靶标的特异性结合，且其中切割(即活化)状态下的可活化抗体 的MM不干扰AB特异性结合靶标或竞争AB特异性结合靶标。在一 些实施方案中，可活化抗体是与治疗剂缀合的可活化抗体。在一些实 施方案中，可活化抗体不与试剂缀合。在一些实施方案中，可检测标 记与掩蔽部分连接。在一些实施方案中，可检测标记与蛋白酶切割位 点N-端的可切割部分。在一些实施方案中，AB的单一抗原结合位点 被掩蔽。在其中本发明的抗体具有至少两个抗原结合位点的一些实施 方案中，至少一个抗原结合位点被掩蔽且至少一个抗原结合位点未被 掩蔽。在一些实施方案中，所有抗原结合位点都被掩蔽。在一些实施 方案中，测量步骤包括使用包含可检测标记的二级试剂。

本发明还提供了用于检测受试者或样品中切割剂的存在或不存在 的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少用于使受试者或生物样 品接触的本文所述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体以及用于检测 受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体的水 平的装置，其中可活化抗体包括位于可活化抗体的部分上的可检测标 记，所述可检测标记在切割CM1-CM2底物后释放，其中受试者或生物 样品中的活化的可活化抗体的可检测水平表明切割剂不存在和/或不充 分地存在于受试者或生物样品中，使得在受试者或生物样品中不能检 测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割，且其中受试者或生物样 品中的活化的可活化抗体的不可检测水平表明切割剂以可检测水平存 在于受试者或生物样品中。

本发明提供了通过如下检测受试者或样品中切割剂和靶标的存在 或不存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体接触，其中可 活化抗体包括位于可活化抗体的部分上的可检测标记，所述可检测标 记在切割CM1-CM2底物后释放，且(ii)测量受试者或生物样品中的活 化的可活化抗体的水平，其中受试者或生物样品中的活化的可活化抗 体的可检测水平表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在和/或不 充分地存在于受试者或生物样品中，使得在受试者或生物样品中不能 检测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割，且其中受试者或生物 样品中的活化的可活化抗体的降低的可检测水平表明切割剂和靶标存 在于受试者或生物样品中。可检测标记的降低水平为，例如，降低约 5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、 约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、 约85％、约90％、约95％和/或约100％。这样的可活化抗体包括掩蔽 部分(MM)、被切割剂切割的CM1-CM2底物和特异性结合靶标的抗原 结合结构域或其片段(AB)，其中未切割(即非活化)状态下的可活化抗体 具有如下的N-端至C-端的结构排列：MM-CM1-CM2底物-AB或 AB-CM1-CM2底物-MM；(a)其中MM是抑制AB与靶标的结合的肽， 且其中MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；且(b) 其中未切割状态下的可活化抗体的MM干扰AB与靶标的特异性结合， 且其中切割(即活化)状态下的可活化抗体的MM不干扰AB特异性结合 靶标或竞争AB特异性结合靶标。在一些实施方案中，可活化抗体是与 治疗剂缀合的可活化抗体。在一些实施方案中，可活化抗体不与试剂 缀合。在一些实施方案中，可活化抗体包含可检测标记。在一些实施 方案中，可检测标记位于AB上。在一些实施方案中，测量受试者或样 品中的可活化抗体的水平使用特异性结合可活化抗体的第二试剂来实 现，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，第二试剂是 包含可检测标记的抗体。

本发明还提供了用于检测受试者或样品中切割剂和靶标的存在或 不存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少用于使受试者或 生物样品接触的本文所述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体以及用 于检测受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体的水平的装置，其中受试者或生物样品中的活化的可活化抗体的可 检测水平表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在和/或不充分地 存在于受试者或生物样品中，使得在受试者或生物样品中不能检测到 可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割，且其中受试者或生物样品中 的活化的可活化抗体的降低的可检测水平表明切割剂和靶标存在于受 试者或生物样品中。可检测标记的降低水平为，例如，降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、 约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、 约90％、约95％和/或约100％。

本发明还提供了通过如下检测受试者或样品中切割剂的存在或不 存在的方法：(i)使受试者或生物样品与可活化抗体接触，其中可活化 抗体包括位于可活化抗体的部分上的可检测标记，所述可检测标记在 切割CM1-CM2底物后释放；且(ii)测量受试者或生物样品中的可检测 标记的水平，其中受试者或生物样品中的可检测标记的可检测水平表 明切割剂不以可检测水平存在和/或不充分地以可检测水平存在于受试 者或生物样品中，使得在受试者或生物样品中不能检测到可活化抗体 的蛋白酶切割，且其中受试者或生物样品中的可检测标记的降低的可 检测水平表明切割剂存在于受试者或生物样品中。可检测标记的降低 水平为，例如，降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约 30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、 约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。 这样的可活化抗体包括掩蔽部分(MM)、被切割剂切割的CM1-CM2底 物和特异性结合靶标的抗原结合结构域或其片段(AB)，其中未切割(即 非活化)状态下的可活化抗体具有如下的N-端至C-端的结构排列： MM-CM1-CM2底物-AB或AB-CM1-CM2底物-MM；(a)其中MM是抑 制AB与靶标的结合的肽，且其中MM不具有AB的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列；且(b)其中未切割状态下的可活化抗体的MM干 扰AB与靶标的特异性结合，且其中切割(即活化)状态下的可活化抗体 的MM不干扰AB特异性结合靶标或竞争AB特异性结合靶标。在一 些实施方案中，可活化抗体是与治疗剂缀合的可活化抗体。在一些实 施方案中，可活化抗体不与试剂缀合。在一些实施方案中，可活化抗 体包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB上。在一 些实施方案中，测量受试者或样品中的可活化抗体的水平使用特异性 结合可活化抗体的第二试剂来实现，其中所述试剂包含可检测标记。 在一些实施方案中，第二试剂是包含可检测标记的抗体。

本发明还提供了用于检测受试者或样品中目标切割剂的存在或不 存在的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少用于使受试者或生 物样品接触的本文所述的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体以及用于 检测受试者或生物样品中的活化的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体 的水平的装置，其中可活化抗体包括位于可活化抗体的部分上的可检 测标记，所述可检测标记在切割CM1-CM2底物后释放，其中受试者或 生物样品中的可检测标记的可检测水平表明切割剂、靶标或切割剂和 靶标两者不存在和/或不充分地存在于受试者或生物样品中，使得在受 试者或生物样品中不能检测到可活化抗体的靶标结合和/或蛋白酶切割， 且其中受试者或生物样品中的可检测标记的降低的可检测水平表明切 割剂和靶标存在于受试者或生物样品中。可检测标记的降低水平为， 例如，降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约 35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、 约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和/或约100％。

在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可活化抗体包括可检测 标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可检测标记包括成像 剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或 基于配体的标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，成像剂包 含放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，放射性同 位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，造影剂包含 碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，酶包含辣 根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的 一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白 (CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光 蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法和试剂 盒的一些实施方案中，发光标记包含N-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍 生物。在这些方法的一些实施方案中，标记包含Alexa

在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在 这些方法和试剂盒的一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案 中，所述受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例 如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，所 述受试者是啮齿动物。

在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体内方法。在这些方 法的一些实施方案中，所述方法是原位方法。在这些方法的一些实施 方案中，所述方法是离体方法。在这些方法的一些实施方案中，所述 方法是体外方法。

在一些实施方案中，原位成像和/或体内成像可在鉴定哪些患者来 治疗的方法中使用。例如，在原位成像中，使用可活化抗体来筛选患 者样品，以鉴定在适当位置(例如在肿瘤部位)具有适当蛋白酶和靶标的 那些患者。

在一些实施方案中，原位成像用于鉴定或以其它方式精选适合于 用本发明的可活化抗体治疗的患者群体。例如，对于靶标(例如靶标) 和切割所测试的可活化抗体的CM1-CM2底物中的底物的蛋白酶两者 测试阳性(例如，将活化的抗体累积于疾病部位)的患者被鉴定为用包含 这样的CM1-CM2底物的这样的可活化抗体治疗的合适的候选者。同样， 对于靶标(例如靶标)和切割使用这些方法所测试的可活化抗体中的 CM1-CM2底物中的底物的蛋白酶中任一者或两者测试阴性的患者可 能被鉴定为另一种形式的疗法的合适候选者。在一些实施方案中，就 第一可活化抗体而言测试阴性的这样的患者可以用包含不同的CM1-CM2底物的其它可活化抗体进行测试，直至鉴定出用于治疗的合 适的可活化抗体(例如，包含在疾病部位处被患者切割的CM1-CM2底 物的可活化抗体)。在一些实施方案中，然后向患者施用治疗有效量的 患者对于其测试阳性的缀合的可活化抗体。

在一些实施方案中，体内成像用于鉴定或以其它方式精选适合于 用本发明的可活化抗体治疗的患者群体。例如，对于靶标(例如靶标) 和切割所测试的可活化抗体的CM1-CM2底物中的底物的蛋白酶两者 测试阳性(例如，将活化的抗体累积于疾病部位)的患者被鉴定为用包含 这样的CM1-CM2底物的这样的可活化抗体治疗的合适的候选者。同样， 测试阴性的患者可能被鉴定为另一种形式的疗法的合适候选者。在一 些实施方案中，就第一可活化抗体而言测试阴性的这样的患者可以用 包含不同的CM1-CM2底物的其它可活化抗体进行测试，直至鉴定出用 于治疗的合适的可活化抗体(例如，包含在疾病部位处被患者切割的 CM1-CM2底物的可活化抗体)。在一些实施方案中，然后向患者施用 治疗有效量的患者对于其测试阳性的缀合的可活化抗体。

在方法和试剂盒的一些实施方案中，所述方法或试剂盒用于鉴定 或以其它方式精选适合于用本发明的可活化抗体治疗的患者群体。例 如，对于靶标(例如靶标)和切割这些方法中所测试的可活化抗体的 CM1-CM2底物中的底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为用包 含这样的CM1-CM2底物的这样的可活化抗体治疗的合适的候选者。同 样，对于靶标(例如靶标)和切割使用这些方法所测试的可活化抗体中的 CM1-CM2底物中的底物的蛋白酶两者测试阴性的患者可能被鉴定为 另一种形式的疗法的合适候选者。在一些实施方案中，这样的患者可 以用其它可活化抗体进行测试，直至鉴定出用于治疗的合适的可活化 抗体(例如，包含在疾病部位处被患者切割的CM1-CM2底物的可活化 抗体)。在一些实施方案中，对于靶标(例如靶标)中任一者测试阴性的 患者被鉴定为用包含这样的CM1-CM2底物的这样的可活化抗体治疗 的合适的候选者。在一些实施方案中，对于靶标(例如靶标)中任一者测 试阴性的患者被鉴定为不是用包含这样的CM1-CM2底物的这样的可 活化抗体治疗的合适的候选者。在一些实施方案中，这样的患者可以 用其它可活化抗体进行测试，直至鉴定出用于治疗的合适的可活化抗 体(例如，包含在疾病部位处被患者切割的CM1-CM2底物的可活化抗 体)。在一些实施方案中，可活化抗体是与治疗剂缀合的可活化抗体。 在一些实施方案中，可活化抗体不与试剂缀合。在一些实施方案中， 可活化抗体包含可检测标记。在一些实施方案中，可检测标记位于AB 上。在一些实施方案中，测量受试者或样品中的可活化抗体的水平使 用特异性结合可活化抗体的第二试剂来实现，其中所述试剂包含可检 测标记。在一些实施方案中，第二试剂是包含可检测标记的抗体。

在一些实施方案中，方法或试剂盒用于鉴定或以其它方式精选适 合于用本发明的抗靶标可活化抗体和/或缀合的可活化抗体(例如，缀合 治疗剂的可活化抗体)治疗、随后通过将该可活化抗体和/或缀合的可活 化抗体施用于有需要的受试者来治疗的患者群体。例如，对于靶标(例 如靶标)和切割这些方法中所测试的可活化抗体和/或缀合的可活化抗 体的CM1-CM2底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为用包含这 样的CM1-CM2底物的这样的抗体和/或这样的缀合的可活化抗体治疗 的合适的候选者，且然后向所述患者施用治疗有效量的所测试的可活 化抗体和/或缀合的可活化抗体。同样，对于靶标(例如靶标)和切割使 用这些方法所测试的可活化抗体中的CM1-CM2底物中的底物的蛋白 酶中任一者或两者测试阴性的患者可能被鉴定为另一种形式的疗法的 合适候选者。在一些实施方案中，这样的患者可以用其它抗体和/或缀 合的可活化抗体进行测试，直至鉴定出用于治疗的合适的抗体和/或缀 合的可活化抗体(例如，包含在疾病部位处被患者切割的CM1-CM2底 物的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体)。在一些实施方案中，然后向 患者施用治疗有效量的患者对于其测试阳性的可活化抗体和/或缀合的 可活化抗体。

在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，MM是具有约4至40个 氨基酸的长度的肽。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可活化 抗体包含接头肽，其中接头肽位于MM和CM1-CM2底物之间。在这 些方法和试剂盒的一些实施方案中，可活化抗体包含接头肽，其中接 头肽位于AB和CM1-CM2底物之间。在这些方法和试剂盒的一些实施 方案中，可活化抗体包含第一接头肽(L1)和第二接头肽(L2)，其中第一 接头肽位于MM和CM1-CM2底物之间，且第二接头肽位于AB和 CM1-CM2底物之间。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，L1和L2各自是约1-20个氨基酸长的肽，且其中L1和L2各自不需要是相同 的接头。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，LP1和LP2中的一 种或两者包含甘氨酸-丝氨酸聚合物。在这些方法和试剂盒的一些实施 方案中，LP1和LP2中的至少一种包含选自(GS)n、(GSGGS)n(SEQID NO：381)和(GGGS)n(SEQ ID NO：382)的氨基酸序列，其中n是至少1 的整数。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，LP1和LP2中的至 少一种包含具有式(GGS)n的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在 这些方法和试剂盒的一些实施方案中，L1和L2中的至少一种包含选自以下的氨基酸序列：Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：383)、 Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ IDNO：384)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：385)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：386)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO：387)和Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO：388)。

在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，AB包含选自本文呈现的 交叉反应性抗体序列的抗体或抗体片段序列。在这些方法和试剂盒的 一些实施方案中，AB包含Fab片段、scFv或单链抗体(scAb)。

在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，切割剂是与靶标在受试 者或样品中共定位的蛋白酶，且CM1-CM2底物是起蛋白酶的底物作用 的多肽，其中当可活化抗体暴露于蛋白酶时，蛋白酶切割可活化抗体 中的CM1-CM2底物。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中， CM1-CM2底物中的CM1底物序列和CM2底物序列各自独立地是最多 达15个氨基酸长的多肽。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中， CM1-CM2底物与AB的N-端偶联。在这些方法和试剂盒的一些实施方 案中，CM1-CM2底物与AB的C-端偶联。在这些方法和试剂盒的一些 实施方案中，CM1-CM2底物与AB的VL链的N-端偶联。

本发明的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体用于诊断和预防制剂 中。在一个实施方案中，将可活化抗体施用于处于发展上述炎症、炎 性病症、癌症或其它病症中的一种或多种的风险中的患者。

可以使用基因型、血清学或生物化学标记物来确定患者或器官对 一种或多种前述疾病的倾向。

在一些实施方案中，将可活化抗体和/或缀合的可活化抗体施用于 诊断患有与一种或多种前述病症相关的临床适应症的人个体。在诊断 后，施用可活化抗体和/或缀合的可活化抗体以减轻或逆转临床适应症 的影响。

本发明的可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还可用于检测患者样 品中的靶标且因此可用作诊断剂。例如，本发明的可活化抗体和/或缀 合的可活化抗体用于体外测定法，例如，ELISA，以检测患者样品中的 靶标水平。

在一个实施方案中，本发明的可活化抗体固定在固体支持物(例如， 微量滴定板的孔)上。固定的可活化抗体用作测试样品中可存在的任何 靶标的捕获抗体。将固定的抗体与患者样品接触之前，将固体支持物 清洗，和用封闭试剂诸如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异 性吸附。

随后，将孔用疑似含有抗原的测试样品或用含有标准量的抗原的 溶液处理。此样品是例如来自疑似具有被认为是病理诊断的循环抗原 水平的受试者的血清样品。在洗去测试样品或标准品后，固体支持物 用可检测标记的第二抗体处理。标记的第二抗体用作检测抗体。测量 可检测标记的水平，测试样品中靶抗原的浓度通过与自标准样品产生 的标准曲线相比较来测定。

应理解，基于在体外诊断测定法中使用本发明的抗体获得的结果， 可能基于靶抗原的表达水平将受试者的疾病分期。对于给定的疾病， 从诊断为处于疾病进展中的各种阶段和/或处于疾病的治疗处理中的各 个点的受试者获取血液样品。使用对进展或治疗的各阶段提供统计学 显著结果的一组样品，指定可被认为是各阶段的特征的抗原的浓度范围。

可活化抗体和/或缀合的可活化抗体还可用于诊断和/或成像方法。 在一些实施方案中，这样的方法为体外方法。在一些实施方案中，这 样的方法为体内方法。在一些实施方案中，这样的方法为原位方法。 在一些实施方案中，这样的方法为离体方法。例如，具有酶促可切割 的CM1-CM2底物的可活化抗体可用于检测能够切割CM1-CM2底物的 酶的存在或不存在。这样的可活化抗体可用于诊断，其可包括通过在 给定宿主生物体的给定细胞或组织中测量的活化抗体(即，由可活化抗 体的切割所产生的抗体)的累积，体内检测(例如定性或定量)酶活性(或 者在一些实施方案中，还原电位增加的环境，诸如其可提供二硫键的 还原)。活化的抗体的这样的累积不仅表明所述组织表达酶活性(或增加 的还原电位，取决于CM1-CM2底物的性质)，而且还表明所述组织表 达活化的抗体结合的靶标。

例如，可选择CM1-CM2底物为在肿瘤部位处、在病毒或细菌感染 部位处、在生物学限制的部位处(诸如在脓肿中、在器官中等)等存在的 蛋白酶的蛋白酶底物。AB可以是结合靶抗原的AB。使用本领域技术 人员熟悉的方法，可检测的标记(例如荧光标记或放射性标记或放射性 示踪剂)可与AB或可活化抗体的其它区域缀合。合适的可检测的标记 在上述筛选方法的文中进行讨论，且其它具体的实例在下文提供。使 用对疾病状态的蛋白或肽特异性的AB以及在目标疾病组织中其活性 升高的蛋白酶，可活化抗体将表现出相对于其中CM1-CM2底物特异性 的酶不以可检测的水平存在或以比在疾病组织中低的水平存在或无活 性(例如，呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，对疾病组织的结合率增 加。因为小的蛋白和肽从血液中通过肾过滤系统快速清除，且因为对 CM1-CM2底物特异性的酶不以可检测的水平存在(或在非疾病组织中 以较低水平存在或以无活性构象存在)，在疾病组织中活化的抗体的累 积相对于非疾病组织提高。

在另一个实例中，可活化抗体可用于检测样品中切割剂的存在或 不存在。例如，在可活化抗体含有对酶切割敏感的CM1-CM2底物的情 况下，可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中酶的存在。在另 一个实例中，在可活化抗体含有对还原剂切割敏感的CM1-CM2底物的 情况下，可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中还原条件的存在。为了便于在这些方法中分析，可活化抗体可经可检测标记，且可 结合至支持物(例如，固体支持物，诸如载片或珠粒)。可检测的标记可 置于在切割后不释放的可活化抗体的部分上，例如可检测的标记可以 是直到发生切割时才可检测的猝灭的荧光标记或其它标记。测定法可 如下进行：例如通过使固定的可检测标记的可活化抗体与疑似含有酶 和/或还原剂的样品接触足以发生切割的一段时间，然后洗涤以除去过 量的样品和污染物。然后通过在与样品接触之前可活化抗体的可检测 信号的变化，例如由于样品中的切割剂切割可活化抗体导致的可检测 信号的存在和/或增加，评价在样品中切割剂(例如酶或还原剂)的存在 或不存在。

这样的检测方法可适合于还提供当切割时能够结合可活化抗体的 AB的靶标的存在或不存在的检测。因此，所述测定法可适合于评价切 割剂的存在或不存在和目标靶标的存在或不存在。切割剂的存在或不 存在可通过上述可活化抗体的可检测的标记的存在和/或增加来检测， 且靶标的存在或不存在可通过检测靶标-AB复合物，例如通过使用可 检测标记的抗靶标抗体来检测。

可活化抗体还可用于原位成像以验证可活化抗体活化(例如通过蛋 白酶切割)和与特定靶标的结合。原位成像是能够在生物样品诸如细胞 培养物或组织切片中定位蛋白水解活性和靶标的技术。使用该技术， 可能基于可检测的标记(例如荧光标记)的存在证实与给定靶标的结合 和蛋白水解活性两者。

这些技术可用于源自疾病部位(例如肿瘤组织)或健康组织的任何 冷冻细胞或组织。这些技术还可用于新鲜细胞或组织样品。

在这些技术中，可活化抗体用可检测的标记进行标记。可检测的 标记可以是荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸若丹明 (TRITC))、近红外(NIR)染料(例如

已与标记的可活化抗体温育的样品中标记的检测表明，样品含有 靶标和含有对可活化抗体的CM1-CM2底物特异性的蛋白酶。在一些实 施方案中，蛋白酶的存在可使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文描述的那 些和/或通过使用对蛋白酶特异性的试剂(例如抗体诸如A11，其对蛋白 酶基质蛋白酶(MT-SP1)特异性并抑制基质蛋白酶的蛋白水解活性；参 见例如，公开于2010年11月11日的国际公开号WO 2010/129609)来 证实。使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文描述的那些和/或通过使用更有 选择性的抑制剂的相同方法可用于鉴定对可活化抗体的CM1-CM2底 物特异性的一种蛋白酶或一类蛋白酶。在一些实施方案中，靶标的存 在可使用对靶标特异性的试剂(例如，另一种抗体)来证实，或可检测的 标记可与未标记的靶标竞争。在一些实施方案中，未标记的可活化抗 体可用于通过标记的第二抗体或更复杂的检测系统进行的检测。

类似的技术也可用于体内成像，其中在受试者(例如哺乳动物，包 括人类)中荧光信号的检测表明疾病部位包含靶标和包含对可活化抗体 的CM1-CM2底物特异性的蛋白酶。

这些技术还可用于试剂盒和/或用作试剂以基于多特异性可活化抗 体中的蛋白酶特异性CM1-CM2底物在各种细胞、组织和生物体中检测、 鉴定或表征蛋白酶活性。

在一些实施方案中，原位成像和/或体内成像可用于鉴定那些患者 来治疗的方法。例如，在原位成像中，使用可活化抗体来筛选患者样 品，以鉴定在适当位置(例如在肿瘤部位)具有适当蛋白酶和靶标的那些 患者。

在一些实施方案中，原位成像用于鉴定或以其它方式精选适合于 用本发明的可活化抗体治疗的患者群体。例如，对于靶标和切割所测 试的可活化抗体的可切割部分(CM1-CM2底物)中的底物的蛋白酶两者 测试阳性(例如，将活化的抗体累积于疾病部位)的患者被鉴定为用包含 这样的CM1-CM2底物的这样的可活化抗体治疗的合适的候选者。同样， 对于靶标和切割使用这些方法所测试的可活化抗体中的CM1-CM2底 物中的底物的蛋白酶中任一者或两者测试阴性的患者被鉴定为另一种 形式的疗法(即，不适合于用所测试的可活化抗体治疗)的合适候选者。 在一些实施方案中，就第一可活化抗体而言测试阴性的这样的患者可 以用包含不同的CM的其它可活化抗体进行测试，直至鉴定出用于治 疗的合适的可活化抗体(例如，包含在疾病部位处被患者切割的 CM1-CM2底物的可活化抗体)。

在一些实施方案中，体内成像用于鉴定或以其它方式精选适合于 用本发明的可活化抗体治疗的患者群体。例如，对于靶标和切割所测 试的可活化抗体的可切割部分(CM1-CM2底物)中的底物的蛋白酶两者 测试阳性(例如，将活化的抗体累积于疾病部位)的患者被鉴定为用包含 这样的CM1-CM2底物的这样的可活化抗体治疗的合适的候选者。同样， 测试阴性的患者被鉴定为另一种形式的疗法(即，不适合于用所测试的 可活化抗体治疗)的合适候选者。在一些实施方案中，就第一可活化抗 体而言测试阴性的这样的患者可以用包含不同的CM的其它可活化抗 体进行测试，直至鉴定出用于治疗的合适的可活化抗体(例如，包含在 疾病部位处被患者切割的CM1-CM2底物的可活化抗体)。

本发明的缀合的抗体、可活化抗体和/或缀合的可活化抗体(在本文 中也称为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物和同源物，可并 入适合于给药的药物组合物中。如本文所用，术语“药学上可接受的 载体”意图包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包 衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。合适的载体描述于 最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，其为本领域的标准参 考科教书，其通过引用并入本文。这样的载体或稀释剂的合适的实例 包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。 也可使用脂质体和非水媒介物诸如固定油。用于药物活性物质的这样 的介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂 与活性化合物不相容，考虑其在组合物中的使用。

本发明的药物组合物经配制以与其预期施用途径相容。施用途径 的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮 (即局部)、经粘膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或 混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、固定 油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂、抗细菌剂诸如苯甲醇 或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂 诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐， 和用于调节张力的试剂诸如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱诸如盐酸或 氢氧化钠调节pH。可将胃肠外制剂包封在用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情 况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。 对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL

无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物并入含有上文列举 的成分之一或成分的组合(根据需要)的合适的溶剂中，随后无菌过滤而 制备。通常，分散体通过将活性化合物并入含有基础分散介质和来自 上文列举的那些的所需的其它成分的无菌媒介物制备。在用于制备无 菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其自它们之前的无菌过滤溶液产生活性成分加任何其它所需成分的粉 末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可包封在明 胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可掺 有赋形剂和以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用 液体载体制备，用作漱口剂，其中液体载体中的化合物经口施用，并 漱口和吐出或咽下。可包括药学上相容的粘合剂和/或辅助材料作为组 合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或 具有类似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶； 赋形剂诸如淀粉或乳糖；崩解剂诸如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润 滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶态二氧化硅；甜味剂诸如 蔗糖或糖精；或矫味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调料。

对于通过吸入施用，化合物以气溶胶喷雾剂的形式从含有合适的 抛射剂例如气体诸如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器递送。

全身性施用还可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮 施用，适合于待渗透屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常是 本领域已知的，和对于经粘膜施用，包括例如去污剂、胆汁盐和夫西 地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经 皮施用，将活性化合物配制成本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝 胶剂或霜剂。

化合物还可以用于直肠递送的栓剂(例如，用常规栓剂基料诸如可 可脂和其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备。

在一个实施方案中，活性化合物用将保护化合物免于快速从身体 清除的载体制备，诸如控制释放制剂，包括植入体和微囊递送系统。 可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、 聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法对 本领域技术人员而言是显而易见的。所述材料还可市售获得自AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc。脂质体混悬液(包括具有针对 病毒抗原的单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接 受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国 专利号4,522,811中所述。

为了易于施用和剂量均匀，特别有利的是以剂量单位形式配制口 服或胃肠外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指作为单元剂量适 合于待治疗的受试者的物理离散单位；各单位含有经计算以产生所需 治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药用载体。本发明的剂量单 位形式的规格由活性化合物的独特性质和待实现的特定治疗效果以及配制此活性化合物用于治疗个体的本领域固有的限制来支配，并直接 依赖于它们。

所述药物组合物以及用于施用的说明书可包括在容器、包或分配 器中。

本发明将在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要 求中描述的本发明的范围。

实施例

实施例1.基质金属蛋白酶(MMP)和丝氨酸蛋白酶(SP)可切割的抗 Jagged可活化抗体

本实施例表明结合Jagged靶标(例如Jagged 1和/或Jagged 2)的可 活化抗体的生成和评估，其中可活化抗体在至少一种基质金属蛋白酶 (MMP)和至少一种丝氨酸蛋白酶存在的情况下被活化。

本文所述的研究使用以下底物序列，其中LP′是CM1和CM2之间 的连接肽。对于CM1-CM2底物1001/LP′/0001，LP′是GGSGGS(SEQ ID NO：350)，且对于下表中的所有其它CM1-CM2，LP′是GG：

如下进行抗Jagged可活化抗体轻链的构建。

如下所述将CM1-CM2底物并入Jagged可活化抗体载体(描述于 PCT公开号WO2013/192550中)。使用标准分子生物学技术，使用编码 CM1-CM2底物的正向(F)引物(参见表A)和反向(R)引物CX1198来扩增 Jagged可活化抗体的底物和VL结构域，并随后使用XhoI和BsiWI限 制性位点克隆入可活化抗体载体。所得载体编码以下抗Jagged可活化 抗体轻链。

表A：用于构建CM1-CM2表达载体的引物

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

核苷酸序列

氨基酸序列

如下评估抗Jagged CM1-CM2可活化抗体体外结合和活化。

抗Jagged可活化抗体由瞬时转染的HEK-293细胞表达，并通过蛋 白A色谱法从培养上清液中纯化。为了验证抗Jagged CM1-CM2可活 化抗体可以被MMP和丝氨酸蛋白酶两者活化，将纯化的可活化抗体用 uPA和/或MMP14消化，随后通过ELISA评估其结合人Jagged1-Fc 的能力。在4℃下在Hank氏平衡盐溶液pH 7.4(HBSS)(Teknova#H8057) 中以1微克/ml用人Jag1-Fc(R&D#1277-JG-050)将ELISA平板(Greiner Bio-One#655061)包被过夜；如本文所用，微克也通过ug和μg表示。 在室温(RT)下，在HBSS中用2％脱脂奶粉(NFDM)将平板封闭1小时。 除去封闭，并将抗Jagged抗体4D11、抗Jagged CM1-CM2可活化抗体 或消化的可活化抗体在2％NFDM/HBSS中添加至指定浓度中，并在室 温下温育1小时。将ELISA平板用过量HBSS，0.05％TWEEN(HBSS-T) 洗涤3次，然后添加在2％NFDM/HBSS中稀释至1∶30,000的小鼠抗人 IgG，F’

图1表明抗Jagged CM1-CM2可活化抗体(a)在通过uPA或MMP14 切割之前被有效地掩蔽，并(b)显示等效于当被uPA或MMP14或uPA 和MMP14的组合切割时的抗体的结合。

如下在非荷瘤裸鼠中评估含有CM1-CM2底物药代动力学的抗 Jagged可活化抗体。

作为掩蔽物和底物的稳定性的替代物，在非荷瘤小鼠中，将含有 CM1-CM2底物2001和1001/LP′/0001的抗Jagged可活化抗体的药代动 力学与非Jagged抗体的药代动力学进行比较。由于在正常组织中 Jagged 1/2的结合，小鼠/人交叉反应性抗Jagged抗体在小鼠中显示快 速清除。如果抗Jagged CM1-CM2可活化抗体在循环中保持掩蔽(稳定)， 则可活化抗体应当避免靶标介导的清除并显示延长的血清半衰期。

如下评估抗Jagged抗体和可活化抗体的血浆药代动力学。如表B 中所示，每组由2个5只小鼠的组群组成。向小鼠给予一个静脉内剂 量的5mg/kg所示化合物。在异氟烷麻醉下，通过眼眶后途径，在剂量 后24小时、96小时和10天从组群1收集肝素锂化血浆，同时在48小 时、7天和14天从组群2收集血浆。使用人IgG夹心ELISA检测总血 浆人IgG水平。简言之，在4℃下将ELISA平板(Costar 3590Fisher Scientific目录号07-200-35)用1ug/ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的 AffiniPure山羊抗人IgG F(ab’)2片段特异性，(JacksonImmunoResearch 目录号109-006-097)包被过夜。将平板在室温(RT)下用Superblock(ScyTek Laboratories目录号AAA500)封闭1小时。去除封闭物，并将 标准品(测试物品)和测试样品(血浆样品)的适当稀释物添加至平板并在 室温下温育1小时。将ELISA平板用过量PBS，0.05％TWEEN(PBS-T) 洗涤3次-097)，然后添加稀释至1∶25,000的AffiniPure山羊抗人IgG F

如图2中所示，抗Jagged抗体被快速清除，并且到第10天时低于 测定的检测限值。相反，抗Jagged CM1-CM2可活化抗体1001/LP′/0001 和2001显示显著延长的半衰期，表明可活化抗体保持稳定并且在循环 中被良好掩蔽。

表B.抗Jagged CM1-CM2可活化抗体2001和1001/LP′/0001的药 代动力学分析的组和给药。

如下进行含有抗Jagged CM1-CM2底物的可活化抗体药物缀合物 的安全性和效力的体内评估。

在人乳腺癌细胞系HCC1806异种移植肿瘤模型中评估含有抗 Jagged CM1-CM2底物的2001可活化抗体药物缀合物(其包含经由 SPDB接头与美登木素生物碱DM4(参见例如US 7,276,497)缀合的抗 Jagged 2001可活化抗体)的效力。在对数期生长期间收获HCC1806细 胞，并以5 x 10

图3显示PBS、同种型-SPDB-DM4、抗Jagged-SPDB-DM4药物缀 合物(ADC)和抗Jagged 2001可活化抗体药物缀合物处理的动物的组平 均肿瘤体积±平均值的标准偏差(SEM)。对照组(PBS或同种型 -SPDB-DM4)都未显示肿瘤生长抑制，而抗Jagged ADC和抗Jagged 2001可活化抗体药物缀合物组都显示肿瘤消退。用抗Jagged ADC处理 的动物显示如通过重量损失所测量的显著的副作用，如图4中所示。 然而，用抗Jagged 2001可活化抗体药物缀合物处理的动物没有显示重 量损失(也显示于图4中)，表明抗Jagged CM1-CM2可活化抗体药物缀 合物的活性定位至肿瘤。

表C：HCC1806研究的组和剂量时间表

表 C：HCC1806研究的组和剂量时间表

实施例2.基质金属蛋白酶(MMP)和丝氨酸蛋白酶(SP)可切割的抗 EGFR可活化抗体

本实施例表明结合表皮生长因子受体(EGFR)的可活化抗体的生成 和评估，其中可活化抗体在至少一种基质金属蛋白酶(MMP)和至少一 种丝氨酸蛋白酶存在的情况下被活化。

使用与实施例1中用于生成可活化抗Jagged抗体的方法相似的方 法生成本实施例中使用的可活化抗EGFR抗体。

本文所述的研究使用以下底物序列，其中LP′是CM1和CM2之间 的连接肽。对于下表中的所有CM1-CM2底物，LP′是GGSGGS(SEQ ID NO：350)：

抗EGFR重链(Hc)：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 0001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 0001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的EGFR 0002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 0002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 1001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 1001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 1002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 1002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 2001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 2001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 2002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 2002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 0001/LP′/1001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 0001/LP′/1001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 1001/LP′/0001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 1001/LP′/0001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 0002/LP′/1001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 0002/LP′/1001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 1001/LP′/0002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 1001/LP′/0002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 0001/LP′/1002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 0001/LP′/1002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 1002/LP′/0001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 1002/LP′/0001可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 0002/LP′/1002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 0002/LP′/1002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 1002/LP′/0002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

抗EGFR 1002/LP′/0002可活化抗体轻链：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

在本文所述的研究中使用以下材料。

试剂和菌株：不经修改地使用人u-PA(Research&Diagnostics Systems，Inc.)。不经修改地使用人matriptase(Research&Diagnostics Systems，Inc.)。人MMP14(Research&Diagnostics Systems，Inc.)按照提 供的方案被活化且不经修改地使用。使用MMP14缓冲液HCM(50mM HEPES(pH 6.8)，10mM CaCl

使用以下方法来评估可活化抗体中的体外底物活性。

底物蛋白水解：如下确定可活化抗体中的底物被u-PA、matriptase 和/或MMP14切割的能力。在PBS pH7.2中在蛋白酶存在或不存在的 情况下，将样品在37℃下温育过夜16-24小时。制备蛋白酶消化物以 维持9∶1的可活化抗体：蛋白酶比率。通过毛细管电泳、ELISA或 SDS-PAGE证实蛋白水解。

底物切割动力学(k

其中C是产物转化率，t是时间，且p是蛋白酶浓度(M)，其假定 底物浓度低于K

可以使用以下方法来评估本文所述的可活化抗体的体内底物稳定 性。

本部分描述了当将实施方案的底物并入EGFR可活化抗体并注射 入小鼠时评估其体内稳定性的实验方法。

三只裸鼠(Crl：NU-Foxnlnu)在第0天以12.5mg/kg接受含有2001、 2002、0001/LP′/1001、1001/LP′/0001、1001/LP′/0002、0001/LP′/1002 或0002/LP′/1002底物的每种EGFR可活化抗体的单一IP剂量。在第4 天(剂量后～96小时)将小鼠通过C02窒息进行安乐死，并且立即收集血 液作为血浆-EDTA并储存在-80℃。

通过使用磁珠的抗人IgG免疫沉淀从血浆纯化EGFR可活化抗体。 如k

使用以下方法来评估可活化抗体的体内效力。

本部分描述了用于评估包含matriptase-可切割底物、MMP14-可切 割底物或实施方案的底物(即可通过matriptase和MMP14切割的底物) 的EGFR可活化抗体在体内有效的实验方法。在第0天以12.5mg/kg 将包含可通过matriptase和/或MMP14中的任一者或两者切割的0001、0002、1001、2001、2002、0001/LP′/1001或1001/LP′/0001的底物序列 的七种EGFR可活化抗体腹膜内(i.p.)施用于携带H292异种移植肿瘤的 (肺癌)小鼠。在第8天(剂量后～192小时)，将小鼠进行眼眶后采血。立 即收集血液作为血浆-EDTA并储存在-80℃。通过使用磁珠的抗人IgG 免疫沉淀从血浆纯化EGFR可活化抗体。通过毛细管电泳制备洗脱的 EGFR可活化抗体用于分析。简言之，将5μl洗脱的IgG加入7μl含 有2-巯基乙醇的蛋白Express样品缓冲液中。循环稳定性的定量与产品 转化的定量相同。

在第8天，含有matriptase-可切割底物或MMP14-可切割底物(0001、 0002或1001)的三种EGFR可活化抗体表明范围为14％至15％的平均 百分比(％)活化值，且含有实施方案的底物(2001、2002、0001/LP′/1001 或1001/LP′/0001)、即被matriptase和MMP14可切割的底物的四种 EGFR可活化抗体表明28％至33％的平均％活化值。平均％活化被计 算为((测试组的乘积转化总和)*100％)/(测试组中的动物数)。

含有0001、0002、1001、2001、2002、0001/LP′/1001或1001/LP′/0001 的底物序列的所有七种EGFR可活化抗体还含有包含氨基酸序列 CISPRGCPDGPYVMY(SEQ ID NO：168)的掩蔽部分和包含轻链(SEQ ID NO：111)和重链(SEQ ID NO：108)的抗EGFR抗体C225v5抗体。可活 化抗体的轻链的构型是掩蔽部分-底物-C225v5的轻链。

在第21天，含有matriptase-可切割底物或MMP14-可切割底物 (0001、0002或1001)的三种EGFR可活化抗体表明范围为41％至57 ％的肿瘤生长抑制，如通过平均百分比(％)抑制所测量，且含有实施方 案的底物(2001、2002、0001/LP′/1001或1001/LP′/0001)、即被matriptase 和MMP14可切割的底物的四种EGFR可活化抗体表明范围为77％至 80％的肿瘤生长抑制，如通过平均％抑制所测量。平均％抑制被计算 为(平均值(C)-平均值(C0))-(平均值(T)-平均值(T0))/(平均值(C)- 平均值(C0))*100％，其中T是目前测试组值，T0是目前测试组初始值， C是对照组值，且C0是对照组初始值。在该研究中，EGFR抗体西妥 昔单抗在第21天表明86％抑制。

实施例3.抗EGFR可活化抗体的原位成像

本实施例描述了未标记的抗EGFR可活化抗体的原位成像的用途。 使用特异性结合可活化抗体的AB部分的二抗检测切割和结合。

如下进行未标记的抗EGFR可活化抗体3954-2001-C225v5在H292 肺癌肿瘤组织上的活化和结合的原位成像：将冷冻的组织切片放置在 载玻片上。将含有未标记的抗EGFR可活化抗体的溶液施加在组织上， 并且例如在室温(约22-24℃)下在含有150mM NaCl、10μMZnCl

实施例4.额外基质金属蛋白酶(MMP)和丝氨酸蛋白酶(SP)可活化 抗体

本实施例证明在至少一种基质金属蛋白酶(MMP)和至少一种丝氨 酸蛋白酶存在的情况下活化的额外底物序列的生成和评估。

本文所述的研究使用以下底物序列：

如上述实施例2中所述测定底物2001、1004/LP′/0001、1004/LP′/0003、2003、2004或2005被人matriptase和/或人uPA切割 的能力。

与底物2001相比，底物2003表明matriptase的切割动力学的大约 50倍增加，并且与底物1004/LP′/0001相比，底物2005表明matriptase 的切割动力学的大约50倍增加。

与2001和1004/LP′/0001相比，底物2003和2005也分别表明uPA 动力学的约3-至4倍范围内的适度增加。发现底物2003和2005也在 小鼠uPA存在的情况下被切割。

将底物2003、2004和2005并入以下可活化抗体中：

抗EGFR重链：

氨基酸序列：

抗EGFR轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2003可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 2003可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2005可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

具有间隔区序列的抗EGFR 2005可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

上面显示的所有抗EGFR可活化抗体中使用的底物被人matriptase、 人uPA、人基质金属蛋白酶14(MMP14)和人基质金属蛋白酶9(MMP9) 切割。

该部分描述了在nu/nu小鼠中使用H292异种移植肿瘤在H292肿 瘤效力研究中评估上面显示的各种抗EGFR可活化抗体。H292肿瘤效 力研究描述于实施例2中，并且还描述于PCT公开号WO 2013/163631 中。

在本研究中，使用对照静脉注射免疫球蛋白(IVIG)、抗EGFR抗体 西妥昔单抗、本文被称为抗EGFR 2001可活化抗体的抗EGFR可活化 抗体(其包括SEQ ID NO：108的重链序列和SEQ ID NO：449的轻链序 列)；本文被称为抗EGFR 2003可活化抗体的抗EGFR可活化抗体(其 包括SEQ ID NO：108的重链序列和SEQ ID NO：472的轻链序列)；或本 文被称为抗EGFR 2005可活化抗体的抗EGFR可活化抗体(其包括SEQ ID NO：108的重链序列和SEQ IDNO：474的轻链序列)如下表中所示将 小鼠分组和给药：

通过在施用后的各个时间点测量肿瘤体积(TV mm

该部分描述了使用就图4中所示的数据而言与实施例2中描述的 那些类似的方法在毒理学研究中评估各种抗Jagged可活化抗体。

在本研究中，在用对照静脉内免疫球蛋白(IVIG)、20mg/Kg剂量的 本文被称为4D11的抗Jagged抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列 和SEQ ID N0：162的轻链序列)、10mg/kg剂量的4D11抗体、5mg/kg 剂量的4D11抗体、本文被称为抗Jagged 2001可活化抗体的抗Jagged 可活化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：420的轻 链序列)、本文被称为抗Jagged 1004/LP′/0001可活化抗体的抗Jagged 可活化抗体(其包括SEQID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：432的轻 链序列)、本文被称为抗Jagged 1004/LP′/0003可活化抗体的抗Jagged 可活化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID N0：424的轻 链序列)、本文被称为抗Jagged 2003可活化抗体的抗Jagged可活化抗 体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID N0：477的轻链序列， 如下文所示)和本文被称为抗Jagged 2005可活化抗体的抗Jagged可活 化抗体(其包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQID NO：479的轻链序 列，如下文所示)施用后，根据DBA/1小鼠的体重(BW)损失测量毒性。

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

在图9中所示的研究中，如下表中所示将小鼠分组和给药：

结果在图9中显示为在研究期间的各个时间点的相对体重(BW)变 化百分比(％)。

结果在图10中显示为在研究期间的各个时间点的相对体重(BW) 变化百分比(％)。

如图8A-8F、图9和图10中所示，包括本发明的可切割底物的可 活化抗体是安全和有效的。具体而言，2003底物已经证明与2001底物 相当的效力和与IVIG相当的安全性，并且2005底物已经证明与亲本 相当的效力和与低4倍给药的亲本相当的安全性。

实施例5.额外基质金属蛋白酶(MMP)和丝氨酸蛋白酶(SP)可活化 抗体

本实施例证明在至少一种基质金属蛋白酶(MMP)和至少一种丝氨 酸蛋白酶存在的情况下活化的额外底物序列的生成和评估。

本文所述的研究使用以下底物序列：

本领域普通技术人员将理解，本文呈现的核苷酸序列是示例性的， 并且技术人员也可以使用其它密码子组合和/或简并核苷酸序列来表达 相同的肽序列。

将底物2006-2014和底物3006-3014并入以下可活化抗体中：

抗EGFR重链：

氨基酸序列：

抗EGFR轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2006可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2007可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2008可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2009可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2010可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2011可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2012可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2013可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 2014可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3006可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3007可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3008可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3009可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3010可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3011可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3012可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3013可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

抗EGFR 3014可活化抗体轻链：

氨基酸序列：

含有底物2006(SEQ ID NO：483)、底物2007(SEQ ID NO：484)、底 物2008(SEQ IDNO：485)、底物2009(SEQ ID NO：486)、底物2010(SEQ ID NO：487)、底物2011(SEQ ID NO：488)、底物2012(SEQ ID NO：489)、 底物2013(SEQ ID NO：490)，2014(SEQ ID NO：555)、底物3006(SEQ ID NO：515)、底物3007(SEQ ID NO：516)、底物3008(SEQ ID NO：517)、 底物3009(SEQ ID N0：518)、底物3010(SEQ ID NO：519)、底物3011 (SEQ ID NO：520)、底物3012(SEQ ID NO：521)、底物3013(SEQ ID NO：522)或底物3014(SEQ ID NO：557)的底物序列的所有十八种EGFR 可活化抗体也含有包含氨基酸序列CISPRGCPDGPYVMY(SEQ ID NO：168)的掩蔽部分和包含轻链(SEQ ID NO：111)和重链(SEQ ID NO：108)的抗EGFR抗体C225v5抗体。可活化抗体的轻链的构型是掩 蔽部分-底物-C225v5的轻链。

使用与本文所述的技术相似的技术通过人matriptase对包含底物 2001、2006-2010和2012的抗EGFR可活化抗体的切割表现出范围为 6E+02至2E+04的k

该部分描述了在nu/nu小鼠中使用H292异种移植肿瘤在H292肿 瘤效力研究中评估上面显示的各种抗EGFR可活化抗体。H292肿瘤效 力研究描述于实施例2中，并且还描述于PCT公开号WO 2013/163631 中，其各自的内容通过引用全文并入本文。

在本研究中，使用对照PBS、可活化抗体(其包括SEQ ID NO：108 的重链序列和SEQID NO：111的轻链序列)；抗EGFR C225v5-3954-2001可活化抗体、抗EGFR C225v5-3954-2006可活化抗 体、抗EGFR C225v5-3954-2007可活化抗体等如下表中所示将小鼠分 组和给药，如下表中所示：

通过在施用后的各个时间点测量肿瘤体积(TV mm

该部分描述了使用就图4中所示的数据而言与实施例2中描述的 那些类似的方法在毒理学研究中评估各种抗Jagged可活化抗体。

在本研究中，20mg/kg剂量抗Jagged抗体指的是本文的4D11(其 包括SEQ ID NO：67的重链序列和SEQ ID NO：162的轻链序列)，10 mg/kg剂量的4D11抗体，5mg/kg剂量的4D11抗体，抗Jagged可活 化抗体指的是本文的抗Jagged 2006可活化抗体(其包括SEQ IDNO：67 的重链序列和SEQ ID NO：507-514的轻链序列如下所示)。

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

氨基酸序列

含有底物2006(SEQ ID NO：483)、底物2007(SEQ ID NO：484)、底 物2008(SEQ IDNO：485)、底物2009(SEQ ID NO：486)、底物2010(SEQ ID NO：487)、底物2011(SEQ ID NO：488)、底物2012(SEQ ID NO：489)、 底物2013(SEQ ID NO：490)，2014(SEQ ID NO：555)；底物3006(SEQ ID NO：515)；底物3007(SEQ ID NO：516)；底物3008(SEQ ID NO：517)； 底物3009(SEQ ID NO：518)；底物3010(SEQ ID NO：519)；底物3011 (SEQ ID NO：520)；底物3012(SEQ ID NO：521)；底物3013(SEQ ID NO：522)；或底物3014(SEQ ID NO：557)的底物序列的所有十八种抗 Jagged可活化抗体也含有包含氨基酸序列的掩蔽部分和包含轻链(SEQ IDNO：162)和重链(SEQ ID NO：67)的抗Jagged抗体4D11抗体。可活化 抗体的轻链的构型是掩蔽部分-底物-4D11的轻链。

在本研究中，如下表中所示将小鼠分组和给药：

结果在图13中显示为在研究期间的各个时间点的相对体重(BW) 变化百分比(％)。

如图11A-11H、图12和图13中所示，包括本发明的可切割底物 的可活化抗体是安全和有效的。

实施例6.体内成像

将7至9周龄的雌性无胸腺nu/nu(Charles River Laboratories)小鼠 皮下接种5×10

其它实施方案

尽管本发明已经结合其详述进行描述，但前述描述旨在说明而不 是限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求的范围所定 义。其它方面、优点和修改在以下的范围之内。