与荷斯坦牛HH2遗传缺陷相关的InDEL分子标记及其应用

摘要

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与荷斯坦牛HH2遗传缺陷相关的InDEL分子标记及其应用。本发明提供了与荷斯坦牛HH2遗传缺陷相关的InDEL分子标记，其为牛参考基因组GCF_002263795.1第1号染色体上第107172616位的碱基缺失。本发明针对该InDEL分子标记，设计了特异性引物，实现对荷斯坦牛HH2遗传缺陷野生型与突变型的快速准确分型。与传统方法相比，本发明方法具有成本低、快速高效、操作简便的特点，为今后在中国荷斯坦牛群中逐步淘汰HH2隐性有害基因提供技术手段，在牛的遗传疾病的筛查和育种进程中具有重要应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与荷斯坦牛HH2遗传缺陷相关的InDEL分子标记及其应用。

背景技术

遗传缺陷指因遗传物质发生变化从而对动物的生长发育造成影响的一类疾病，主要表现为身体结构缺陷或功能障碍，进而影响生产性能，甚至导致死亡。近年来，基因组选择等现代分子育种技术的应用极大的提高了奶牛的生产性能，使优秀家系种公牛得到广泛使用，产奶量大幅上升，与此同时，对部分公牛使用频率的增加导致了奶牛基因库缩小，群体近交系数增加，造成隐性有害基因纯合的概率加大，从而增加了遗传缺陷的发病风险。很多生产性能优异但是携带有遗传缺陷基因的公牛，在群体中广泛使用的情况极为常见，因此遗传缺陷基因在群体中迅速传播。常见的奶牛遗传缺陷一般为常染色体隐性遗传，杂合子(即携带者)与健康个体无表型差异，隐性纯合子才会表现出明显症状。

HH2(Lethal Holstein Haplotype 2)是荷斯坦牛品种的一种遗传缺陷，呈隐性遗传模式，在临床表现上，HH2携带者与健康个体无表型差异，隐性纯合子则在胚胎时期56天左右死亡，表现为母牛流产(VanRaden et al.2011；McClure et al.2014)。前期研究将HH2缺陷基因定位于牛1号染色体上，由于致病位点及其分子机制尚未被发现，需通过74个SNP标记位点组成的单倍型来间接推测HH2携带者(VanRaden et al.2011；McClure etal.2014)，这一过程通常依赖SNP芯片检测技术，需要专用的芯片检测设备，不仅检测成本高而且耗时长，在普通的分子实验室难以应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了与荷斯坦牛HH2遗传缺陷相关的InDEL分子标记及其应用。

为实现本发明的目的，本发明以中国荷斯坦牛为资源群体，利用全基因组测序技术手段，通过基因组测序原始Reads比对、基因组变异筛查、功能性突变挖掘等流程，发现IFT80基因第12个外显子上存在1bp的缺失为HH2遗传缺陷的候选突变位点，在此基础上设计了PCR分型方法。

本发明首先发现了荷斯坦牛HH2遗传缺陷的候选突变位点，所述候选突变位点是IFT80基因上的一个移码突变，相对于健康荷斯坦牛的IFT80基因的DNA序列，该移码突变位于基因的第12外显子区域，所述片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列第401位碱基T缺失。

具体而言，是在牛参考基因组(GCF_002263795.1)第1号染色体上的第107172616位碱基缺失。实验发现IFT80基因上的移码突变为HH2遗传缺陷的候选突变位点，该突变的杂合子为HH2携带者，纯合子在胚胎发育早期死亡。

根据上述发现，本发明提供了与荷斯坦牛HH2遗传缺陷相关的InDEL分子标记，其为牛参考基因组GCF_002263795.1第1号染色体上第107172616位的碱基缺失。

进一步地，所述InDEL分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第401位的碱基缺失。

进一步地，所述InDEL分子标记如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物扩增得到。

本发明还提供了用于扩增所述的InDEL分子标记的引物组合。

作为优选，当所述引物组合包括SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物时，更有利于筛查荷斯坦牛IFT80基因缺陷。

本发明还提供含有所述的引物组合的试剂或试剂盒。

进一步地，作为一种实施方案，本发明试剂盒的工作步骤如下：

(1)提取待测牛样品的基因组DNA，以其为模板，以SEQ ID NO.2-3所示的引物为扩增引物，进行PCR扩增。PCR的25μL反应体系：金牌Mix快速PCR预混液(浓度1.1X，内含DNApolymerase、dNTP、Buffer等组分；北京擎科新业生物技术有限公司)21μL，2条引物各1μL(浓度均为10μM)，基因组DNA模板2μL(约50ng)。

(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，确定扩增出387bp的条带后，进行双向Sanger测序，若扩增片段测序成功且无双峰，则样品来自荷斯坦牛IFT80基因野生型纯合子；若扩增片段测序成功且存在双峰，则样品来自荷斯坦牛IFT80基因缺陷携带者。

PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃复性15sec；72℃延伸10sec；重复35个循环；最后72℃延伸3min。

本发明还提供所述的InDEL分子标记或所述的引物组合或所述的试剂或试剂盒在荷斯坦牛HH2遗传缺陷的检测中的应用。

本发明还提供所述的InDEL分子标记或所述的引物组合或所述的试剂或试剂盒在牛繁育中的应用。

具体地，所述应用为选育不携带IFT80基因缺陷的荷斯坦牛，或淘汰携带IFT80基因缺陷的荷斯坦牛，或避免携带IFT80基因缺陷的牛进行交配。

本发明还提供所述的InDEL分子标记或所述的引物组合或所述的试剂或试剂盒在口岸检疫对牛遗传物质检验检疫中的应用。所述牛遗传物质包括活牛、冷冻精液、胚胎。

本发明进一步提供一种检测荷斯坦牛HH2遗传缺陷的方法，以待测牛的基因组DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增；若扩增片段测序成功且无双峰，则待测牛为荷斯坦牛IFT80基因野生型纯合子；若扩增片段测序成功且存在双峰，则待测牛为荷斯坦牛IFT80基因缺陷携带者。

作为优选，所述方法包括以下步骤：

(1)以待测牛的基因组DNA为模板，利用SEQ ID NO.2-3所示的引物为扩增引物，进行PCR扩增；

(2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，确定扩增出387bp的条带后进行双向Sanger测序，若扩增片段测序成功且无双峰，则待测牛为荷斯坦牛IFT80基因野生型纯合子；若扩增片段测序成功且存在双峰，则待测牛为荷斯坦牛IFT80基因缺陷携带者携带者。

本发明的有益效果至少体现在以下方面：

(1)本发明以HH2野生型纯合子荷斯坦牛和HH2携带者荷斯坦牛为参考样本，在候选区域内发现一个由IFT80基因外显子上1bp缺失导致的移码突变位点，确定该InDEL分子标记与HH2遗传缺陷关联。

(2)本发明针对该InDEL分子标记，设计了特异性引物，实现对荷斯坦牛HH2遗传缺陷野生型与突变型的快速准确分型。

(3)与传统方法相比，本发明方法具有成本低、快速高效、操作简便的特点。在此之前，HH2携带者的鉴定需要进行SNP芯片检测，技术难度高、耗时过长、花费较大。本发明的方法用普通PCR、Sanger测序就能分型，检测方法简便高效，在普通分子遗传实验室即能完成检测，为今后在中国荷斯坦牛群中逐步淘汰HH2隐性有害基因提供技术手段，在牛的遗传疾病的筛查和育种进程中具有重要应用价值。

附图说明

图1为荷斯坦牛IFT80基因1bp缺失造成移码突变的示意图。

图2为HH2携带者的全基因组测序Reads在IFT80基因移码突变位点位置的Integrative Genomics Viewer(IGV)图像。灰色横线条代表比对到该位点附近的Reads条带，中间黑色横线代表缺失碱基。

图3为HH2野生型和突变型的序列特征及引物设计示意图，下划线为缺失碱基，方框内为正反引物。

图4为荷斯坦牛野生型纯合子与IFT80基因缺陷携带者杂合子在移码突变位点的Sanger测序峰图，图(1)为突变型携带者样本，双峰碱基标记为N；图(2)为野生型样本，图中箭头指向缺失位点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1荷斯坦牛HH2遗传缺陷关联分子标记的挖掘

1、样本采集及基因组DNA的提取

本发明选择8头牛进行全基因组测序。这些样本首先通过牛基因组SNP芯片(NEOGEN GGP Bovine 100K)检测和单倍型分析，确定4头为HH2遗传缺陷携带者，4头为野生型荷斯坦牛个体。采集静脉血，经酚-氯仿法提取基因组DNA。

2、基因组测序和变异检测

对4头HH2携带者和4头野生型荷斯坦牛通过高通量二代测序平台进行全基因组测序。质控后测序数据约443Gb，包括2951802390条Reads。使用BWA软件MEM的方法将测序所得Reads比对到牛参考基因组(ARS-UCD1.2；GCF_002263795.1)上，利用GATK软件完成变异检测和质控。此前基于SNP芯片的研究将HH2遗传缺陷基因初步定位于1号染色体94860836bp-96553339区域(牛UMD 3.1参考基因组)(McClure et al.2014)。鉴于全基因组测序技术能够完整筛查影响蛋白编码基因的功能突变，本发明在已报道基因组区域的基础上扩大候选基因组区域，在1号染色体的82693722bp-107343500bp区域(新公布的牛参考基因组GCF_002263795.1)内检测变异位点，共得到102671个SNP、18003个Indel用于后期分析。

3、功能突变的挖掘

根据荷斯坦牛HH2缺陷基因的呈隐性遗传特性，因果突变位点在携带者中均为突变型杂合子，而在正常牛中为野生型纯合子。根据上述特点在24.64Mb(1号染色体82693722bp-107343500bp)候选区域内筛查变异位点，共筛查出392个SNP位点、52个INDEL位点。使用snpEFF软件对筛选出的变异位点进行注释，发现上述392个SNP位点和51个INDEL位点均存在于基因的非编码区，只有1号染色体上第107172616位碱基T缺失(g.107172616delT，如图1和图2所示)位于IFT80基因编码区第12外显子，属于使基因失去功能的移码突变类型。IFT80基因所编码细胞纤毛内转运蛋白参与小鼠Hedgehog信号传导过程中的重要一环，其功能的缺失会抑制Hedgehog信号在靶细胞内的传导，进而阻止成骨细胞的分化，导致胚胎在发育时期死亡(Wang et al，2013)。据此推测，IFT80基因外显子上的移码突变是荷斯坦牛HH2遗传缺陷单倍型的候选因果突变位点。

实施例2荷斯坦牛IFT80基因移码突变位点的检测与分型

设计特异性引物进行PCR扩增和Sanger测序，通过序列的差异进行突变位点的检测和分型。

1、特异性引物设计

参照牛IFT80基因的参考基因组序列(GCF_002263795.1)和基因移码突变位点在该基因上的位置，使用Primer Premier 5软件，在变异位点的附近设计出1对特异性PCR引物(如图3所示)：

正向引物5’-TTTCTTTTCCTACCTCCA-3’，

反向引物5’-TTCATCAGCTTTGTCTTT-3’。

2、PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳

PCR反应体系：总体积25μL，其中PCR预混液21μL(金牌Mix，北京擎科新业生物技术有限公司)，正反引物各1μL(浓度均为10μM)，模板DNA2μL(约为50ng)。PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃复性15sec；72℃延伸10sec；重复35个循环；最后72℃延伸3min。

对扩增后的PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照胶检测，若扩增出的主条带图像清晰，亮度适中，且基本无杂带，说明本次扩增出来的基因序列浓度与特异性均良好。

所用PCR仪器为Bio-Rad T100型，电泳仪为北京君意东方电泳设备有限公司JY600+型，照胶仪来自Alpha Innotech公司。

3、Sanger测序

PCR产物经电泳验证特异性良好后，利用PCR引物进行双向Sanger测序，测序结果在软件Chromas上进行观察与分析。

由于携带者中的突变位点基因型为杂合子，其Sanger测序峰图在突变位点后为双峰形状，而野生型不存在该突变位点，峰图为正常单峰形状。IFT80基因野生型和突变型在位点附近的Sanger测序结果比较见图4。

8个全基因组测序样本(源自实施例1中的8头牛)经PCR产物Sanger测序验证，二者结果完全一致，即HH2携带者在1号染色体上第107172616位碱基存在1bp缺失，造成IFT80基因移码突变。

通过对8个测序样本的统计检验(Fisher精确检测，R软件fisher.test函数)，结果见下表1，该IFT80基因移码突变位点与HH2关联性达到显著水平(P＝0.02857)。

表1

由此可见，利用上述PCR引物结合Sanger测序可以用于筛查HH2遗传缺陷携带者。

4、突变检测方法应用

新采集26头中国荷斯坦公牛的冷冻精液，利用高盐法提取冻精中的基因组DNA。经牛SNP芯片检测和单倍型分析显示，26头荷斯坦公牛中包括10头HH2携带者和16头野生型。利用本发明公开的PCR引物结合Sanger测序方法，检测上述26头公牛的IFT80基因1bp缺失突变位点(g.107172616delT)，测序分型结果与SNP芯片分析结果完全一致(见表2)，Fisher精确检验(R软件fisher.test函数)显示该位点与HH2关联性达到极显著水平(P＝1.883×10

表2

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与荷斯坦牛HH2遗传缺陷相关的InDEL分子标记及其应用

<130> KHP211111021.0

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taatactgct tcataaaaca aatagagtct gtcattaaaa gattcactga attgtaaatt 60

acatgattat ttattgcttt tgtatagata tgcttcttta ggaaaggaaa tgaattataa 120

tattaaagga atcaaaactt tatagggtgg tgattatgaa cattttcatt tttcttttcc 180

tacctccatc aaacaacaaa ggcctaggaa acaaatcaga acaaccaagt gttgactttt 240

caggttgttt ttatatttcg ttctttatat atctatgtct tattattgtt ttaattgtaa 300

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ttgcttatgt atattcatgt attttttata cttacatatt t 1001

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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