复合菌及其在降解长链烷烃中的应用

摘要

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及复合菌及其在降解长链烷烃中的应用。本发明提供了工程解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母的复合菌，较单一菌株而言，该复合菌能协同作用，烷烃降解率更高。工程解脂酵母单菌培养时的烷烃降解率为75.12％；球拟假丝酵母单独降解烷烃的降解率为51.48％且生长状态差；复合菌中单菌生长状态得到改善、烷烃降解效率提高，降解率为81.57％；复合菌进行优化，降解效率进一步提高，降解率为85.49％；同时复合菌中解脂酵母烷烃降解相关基因转录通过动态调整来降低彼此代谢负担，从而协同提高烷烃降解效率。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及复合菌及其在降解长链烷烃中的应用。

背景技术

研究表明，目前发现的石油烃降解微生物有200多种，包括细菌、真菌、酵母、放线菌、霉菌和藻类，目前研究较多的是细菌和真菌。石油烃生物降解具有安全可靠、成本低、处理效果好、无二次污染等特点。目前生物降解大多采用强化土著降解菌株或投加高效降解菌株或菌群来实现。例如，两株促生长的细菌通过促进真菌菌丝的生长，从而提高了该三菌体系对多环芳烃的降解；四株菌的复配体系在降解萘和蒽的同时，还能生产表面活性剂；由分离出的6株石油烃降解菌组成的混合菌群对C8-C35的降解率显著高于单个降解菌的降解率；利用8株霉菌、3株酵母菌和4株细菌分别采取细菌混合培养、真菌混合培养、细菌和真菌混合培养等不同的组合方式进行石油烃降解实验；也有利用解脂酵母工程菌株与铜绿假单胞菌进行复配，其石油烃降解效率可达到91.63％，但其高石油烃降解效率主要取决于铜绿假单胞菌，复配菌株协作效果不明显。

同时由于大多微生物体内酶多为水溶性，因此很难直接将菌株或复配菌群直接作用于石油污染物，需要促溶剂增加进微生物与污染物的接触。表面活性剂能够增溶，且适用性广。有研究表明表面活性剂可提高石油烃降解微生物降解效率。但具有能够生产表面活性剂，且有较高石油烃降解效率和广谱石油烃降解的微生物还很少，实际可用到生物修复中的高效菌株则更少。如何筛选并复配得到降解效率高，性能广谱的菌株仍有待解决。而且，现有的石油烃降解土著或复配菌群，存在菌株间分工不明确、代谢不平衡、竞争与协作共存和相互作用关系错综复杂等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供复合菌及其在降解长链烷烃中的应用。

本发明提供了一种复合菌，包括解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母。

在本发明中，所述球拟假丝酵母为产槐糖脂的球拟假丝酵母。所述在一些具体实施例中，本发明所述的球拟假丝酵母为Candida bombicola ATCC22214菌株。

解脂耶氏酵母可利用槐糖脂提高其烷烃降解效率，本发明将这两种菌复配形成的复合菌能够协作共存、互利互惠。在一些具体的实施例中，工程解脂酵母单菌培养时的烷烃降解率为75.12％；进一步的，菌种复配后的降解率为降解率为81.57％；更进一步的复合菌经优化的降解率可达85.49％。其中，所述的球拟假丝酵母自身代谢产生的槐糖脂可作为表面活性剂，在烷烃降解过程中可充当促溶剂，增加微生物与石油烃的接触，从而提高烷烃降解效率。

在一些具体实施例中，本发明所述的复配菌与单菌转录水平进行比较，复配菌内源与烷烃降解相关的基因在第三天均有大幅度上调。具体的，内源烷烃降解基因为Alk1、Alk2、Alk5和ABC1，Alk1、Alk2、Alk5为烷烃羟化酶编码基因，ABC1为烷烃转运酶编码基因，他们均在烷烃降解过程中其至关重要的作用。进一步的，外源LadA转录水平也有提高。

在本发明中，所述解脂耶氏酵母是以解脂耶氏酵母ATCC 201249为底盘的基因工程菌。进一步的，在一些具体实施例中，所述解脂耶氏酵母表达LadA、AlmA2、ABC1基因中至少一种。本发明中，LadA、AlkM为烷烃羟化酶基因，是经过解脂耶氏酵母密码子优化的，其编码的烷烃羟化酶的酶活力及表达量的提高可以促进菌株降解烷烃。ABC1基因编码产物为烷烃转运蛋白，负责物质的跨膜转运，菌株过表达ABC1，可提高其烷烃降解效率。

本发明所述的复合菌中的解脂耶氏酵母，基因型包括如下所述的任意一种：

ATCC 201249Δku80::PFBAin-LadA-octt,hisG；

ATCC 201249Δku80::PFBAin-AlmA2-octt,hisG；

ATCC 201249harboring PINA1269-ABC1；

ATCC 201249Δku80::PFBAin-LadA-octt,hisG harboring PINA1269-ABC1。

在本发明中，所述的解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母比为(1～4)：(1～4)。

进一步的，本发明所述的比(1～4)：(1～4)为此区间中任意数值组成的比值，本发明对此不做限定。

更进一步的，本发明所述的比是以接种密度进行配比。

在一些具体实施例中，本发明所述的比是通过固定解脂酵母的初始OD

本发明提供了降解石油烃的产品，原料包括本发明所述的复合菌。

进一步的，本发明所述的产品的制剂类型可以为菌粉、颗粒或菌液，本发明对此不做限定，其都可以应用于石油烃的降解中。本发明所述的降解石油烃的产品的制备方法包括将解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母进行混合。可以为，将解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母混合后进行培养制得所述产品。还可以为将解脂耶氏酵母和球拟假丝酵母混合、培养后进行冻干。本发明所述的降解石油烃的产品中，还包括复苏培养基，所述复苏培养基中，碳源包括葡萄糖、蔗糖或TCA中间代谢产物。

本发明提供了所述的复合菌和/或产品在降解石油烃中的应用。进一步的，包括复合菌以冻干粉或菌液形式、产品以菌粉、颗粒或菌液的制剂形式用于石油烃降解，本发明对此不做限定。

本发明中，所述的石油烃包括：正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃等烃类物质和少量其他有机物。本发明以十六烷烃为受试对象，鉴定菌株对石油烃的降解效果。

本发明还提供了一种石油烃的降解方法，包括利用如本发明所述的复合菌，和/或本发明所述的降解石油烃的产品对石油烃进行降解。

具体的，本发明所述的降解方法包括将所述复合菌或所述降解石油烃的产品加入含有石油烃的待降解物中。

本发明所述的降解方法中，所述降解的基质包括葡萄糖、蔗糖或TCA中间代谢产物。其中，所述TCA中间代谢包括琥珀酸、柠檬酸或酮戊二酸。

在一些具体实施例中，所述降解的基质中含有葡萄糖。实验表明，本发明所述的降解方法，添加外源葡萄糖烷烃降解效果最好。更进一步的，以葡萄糖添加量为20g/L的时其烷烃降解效率最好，烷烃降解效率高达85.49％。

在本发明中，所述降解的温度为25～37℃，一些具体实施例中，所述降解的温度为30℃。解脂酵母的适宜培养温度为28～30℃，球拟假丝酵母的适宜培养温度为25～37℃。在一些具体实施例中，本发明所述的降解方法中的复合菌30℃时的正十六烷降解率最高，为81.57％；温度过高或过低都会通过影响其生长或酶活性而降低其烷烃降解效率。

本发明所述的复合菌及所述的石油烃的降解方法，可被用于海洋原油泄露、港口和船舶含油污水排放、餐厨油污废水的处理等方面。

本发明提供的复合菌中包括解脂耶氏酵母和球拟酵母，相对于单一菌株而言，该复合菌能够协同作用，具有较高的石油烃降解率。实验表明：工程解脂酵母单菌培养时的烷烃降解率为75.12％；球拟假丝酵母单独降解烷烃的降解率为51.48％且生长状态差；复合菌中单菌生长状态得到改善、烷烃降解效率提高，降解率为81.57％；复合菌进行优化，降解效率进一步提高，降解率为85.49％；同时复合菌中解脂酵母烷烃降解相关基因转录通过动态调整来降低彼此代谢负担，从而协同提高降解烷烃降解效率。

附图说明

图1示不同浓度槐糖脂对解脂酵母烷烃降解的影响；

图2示复合菌降解正十六烷的研究，(a)为生长曲线；(b)为96h降解率；

图3示在SC-G培养条件下复合菌中菌群数量变化比较图；

图4示解脂酵母与球拟假丝酵母接种比例的优化；

图5示解脂酵母与球拟假丝酵母温度的优化；

图6示复合菌培养基营养成分的优化；

图7示在SC培养条件下复合菌中菌群数量变化比较；

图8示复合菌中YAH13菌株在不同时间相关基因的相对表达量；

图9示Y.lipolytica菌数标准曲线；

图10示C.bombicola菌数标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了特异性菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，LadA是来自于Geobacillus thermodenitrificans NG80-2的烷烃羟化酶，其编码核酸的序列为：atgaccaagaagatccacatcaacgccttcgagatgaactgcgtgggccacatcgcccacggcctgtggcgacatcccgagaaccagcgacaccgatacaccgacctcaactactggaccgagctggcccagctgctggagaagggcaagttcgacgctctgttcctcgccgacgtcgttggcatctacgacgtctaccgacagtcccgagacaccgccgtgcgagaggctgtgcagattcccgtgaacgaccccctgatgctgatctccgctatggcctacgtcaccaagcatctggccttcgccgtcaccttctccaccacctacgagcacccctacggccacgcccgacgaatgtccaccctggaccacctgaccaagggccgaatcgcctggaacgtcgtcacctcccacctgccttccgccgacaagaacttcggcatcaagaagatcctcgagcacgatgagcgatacgacctggccgacgagtacctcgaggtttgctacaagctgtgggagggttcctgggaggacaacgctgtgattcgagacatcgagaacaacatctacaccgacccctccaaggtccacgagatcaaccactccggcaagtacttcgaggtccccggcccccacctgtgcgagccttcccctcagcgaacccccgtcatctaccaggccggcatgtccgagcgaggccgagagttcgccgccaagcacgctgagtgcgtcttcctgggtggcaaggacgttgagactctgaagttttttgttgacgacatccgaaagcgagccaagaagtacggccgaaaccccgaccacatcaagatgttcgccggtatctgcgttatcgtcggcaagacccacgacgaggccatggagaagctgaactccttccagaagtactggtccctggagggccacctggcccactacggtggtggtactggctacgatctgtccaagtactcgtctaacgactacatcggatctatctccgtcggcgagatcattaacaacatgtctaagctggacggtaagtggttcaagctgtctgtgggtactcccaagaaggtcgccgacgagatgcagtacctggtcgaggaggccggcattgatggttttaacctggtccagtacgtcagccctggtactttcgtggacttcatcgagctggtggtccccgagctccagaagcgaggactgtaccgagtcgattacgaggagggtacttaccgagagaagctgtttggcaagggcaactaccgactgcccgatgaccacatcgccgcccgataccgaaacatctcctccaacgtgtaa(SEQ ID NO.1所示)。

本发明中，AlmA2是来自于Acinetobacter sp.M-1的烷烃羟化酶，其编码核酸的序列为：atggagaagcaggtcgatgtcctgatcatcggcgccggtatctccggtatcggcctggctgttcacctgtccaagaactgcccccagcgaaagttcgagatcctggagcgacgagactcctttggcggcacctgggacctgttccgataccctggtatccgatctgactccgacatgtccacctttggcttcaacttcaagccctgggccaaggacaaggtcctggcttctggagccgagattaagggctacctgtctgacgtcatttctgagaaccagctcaaggacaagatccacttcggtcaccgagtcctctccgccaactacgactccgctaagaagaagtgggccgtcgagatcgaggactccaacaagaagaagcagacctggtccgccaacttcgtgatgggctgcaccggttactacaactacgaccagggatacgcccccaagttccccaagcaggaggacttcaagggccagctgatccacccccagcactggcctgagaacctggactacaccggcaagaaggtggtcatcatcggctccggagccaccgctatcaccctggttccttccatggtcaagggcggagccggtcacgttaccatgctccagcgatccccctcctacatcgccaccatcccttccatcgacttcatctacgagaagacccgaaagttcatgtctgaggagactgcctacaagttcacccgagcccgaaacatcggcatgcagcgaggtatctacgccctggctcagaagtaccccaagaccgtccgacgactgctgctgaagggcatcgagctgcagctgaagggcaaggtcgatatgaagcacttcaccccctcctacaacccctgggaccagcgactgtgcgtggttcctgacggagacttgtttaaggccctgcgagagggccaggccaacgttgagactgaccagattgagaagttcaccgccaacggcattcagctcaagtccggcaagcacctggaggctgacatcgtgatttccgccaccggactggagatccagatcctgggaggtgtgaagggaaccatcgacggcaagcccatggacacctcccagcacatgctgtaccagggcgtgatggtcagcgatgttcccaacatggccatgatcattggctacatcaacgcctcctggaccctgaaggtcgatatcgccgccgactacatctgccgactcctgaaccacatggacaagaacggctacgacgaggtcatcgcccacgctgaccctgctctgcgagagcaggacaccatcatgggaaagatgtcctccggttacatcgcccgagccgctgacgttatgcccaagcagggtaagaaggccccctggaagattaccaacaactacctggccgaccgaaaggagctgaaggacgcttcctttaacgacgtggtcctgcagtttcacaagcgaggcgagcaggtcgatcgaaagcccaagctcgtatcctaa(SEQ ID NO.2所示)。

本发明中，ABC1是来自于解脂耶式酵母ATCC 201249的烷烃转运蛋白，其编码核酸的序列为：atggcgcactactacccgtcgggcgtgtcgtcggtcggcaacttcgactcgctagatgtcgagatcagatcgctggccgagggaatggtacacaaacctcaccatcgagaatcgcgatacattttcgaccacacctttgacgacgagtttcgagaagagcatgaggacgaatacgactatgatatgctgcggaagacgtcttttgagaaccccgacgtcaacccttacgtggaggccagtgcggagccggagctggatccctggtcgggcgagttcaactcgcgaaagtggatcaagaccgtgctgggtctcaaggagcgatttggaaacagtaagggaatcacggccggcgtgtcgttcaagaacctgggtgcctacgggtacggcagtcgcagtgactaccagaagacgtttctcaacgtcattgtggccactggagatttgctgcgaagtgctattggcgctaaacggacaagcaaaatccagattctgcgcaagtgcgatggactggtgcttccaggtgaaacctgtgtagttctgggacgtcccggatcaggatgcactacatttctcaagagtattgcttgcgagacgtacggatttcatgtggaggaagagacacaatggaactatcagggtgagtatttgggattatggggctatgaggttatgagggagatggaaataccggaatgaacatcttccaggtggtctattctttcttgttggccgttattttgtgtccacctgattttttttatttttttattttttattttttatttttgtgtgttgcacacattccaatcagtgcagatcactcccaacacggccggtatctaatacctagacccgaatagagtgttctgtacgcgataatcataccaggtgggaatcagaacacaagaacaaagaaagcagatttccgcggagcgcgaaaaacaataaccaataatgaccctactaacgcaggcgtaccacgagatgtcatgacaaagcattgccgaggagaaattgtctacaatgctgaacacgatatccatttccctcacttgacggtcggacagaccctcatgtttgcggctctagcccgaactccccgaaaccgagtgctgggagtgacccgagagcagtatgctcgtcacacccgagatgttaccatggccactctcggtctgtctcacacaatcaacaccaaggttggatccgatctagtgcgtggagtctccggtggagagagaaaacgagtctctattgccgagtccgtcgtctgcggagcgcctctacagtgctgggataactccactcgaggtctggatgctgcgaacgccaccgaattcattcgatctctgcgactttccgcccagatgacaggcgcctccatgtttgtgtctctgtaccaggcttcccaggaggcctacgacatgttcgacaaggtgtgtctgctgtacgagggacgacaaatcttcttcggtaaggccggagaggccacatcatactttgagggtctgggattcgagcgagcccatcgccagaccactggtgattttctgacctcccttacaaaccctgtcgagcgaagaatcaaggctggatgggagaagctcgtgcctcgaactcccgaggagtttgagtctcgatggagatcgtcccgaacacacgctctgttagtttacaacatcgaccgattcaataccactcatcctcttggtggtcagggttatgtcgagttcatgaagctccgaaaggagtctcaggcccgaaatacccgtctgtcgtcgccatatctgctctcctggcccatgcaggttcgtctgtgtctctggagaggcttcttgttggtgagaggagacttgtccatgacgctgatgaccatcattggtaacttcatcatggccctcattctggcatcaatgtactataatttgcgagagtcgactgatgccttcttctcgcgatctgccctgcttttcttggccatgttgctgaacgctatggcctccgttttggagattttcgtgctgtacggacagcgaccactgattgagaaacacaaacgatatgcattgtaccatccctttgcagaatcaatcgcgtcaatgttggttgatttaccgaccaaactggcaactctgatttcagtcaacctcgctctttacttcatgactaacctgagacgaaccccgggtgccttcttcatcttcctgctcttttcgttcacctgtaccatggcaatgtccatgattttccggttcactgcttctgtcaccaagactatggaacaggctctggcccccgcctctgtgctagttttggcactggttatttacactggtttcacgcttcccgtcgattacatgcatggatgggcccgatggatgaattacctcaatcctgttgcttatgcgtttgaggcagtaatggtgaacgagttccgaaacagaaggttcccttgtggactttacgttccttcccggtctttctacaactctgtgcccgctgagtccaagtcttgtgtggctatcggcgccaagctcggccaggactacgtcgatggctccgtgttcatcagcacggcctacaagtacgagactggacacctgtggcgaaacctgggcattctgtgggcctttgctggctttttctgcggcgtctacctgcttgctgccgagtacgtgaccatggcccagtccaagggtgaggttctgctgttcaagcgatcccagcatcgaaagaacctcaaggccaagcctgacaagcgattccaagacgttgagcttggagacaacctcggcgaccacaacttggaccaaaacctcggcgacaaccactcgacgtactcttaccagcaacccatccaggctcagattcccccttctcggtacgcccagcaggctcccatgactcccgctcctatgatgcatgtccccatgactcctggtggcatgctttctcccggtcagcaaatgttctctcccggtcagcaaatgatgacgcctggtcccatgtcacccgcaggcatgatgactcccggttttacatatgtgcccccccatggagacactattcaccaaccgcctaccgttggagacgacatcaactacacgactcccgcgccccaggtgaacttcacccctgccactccagctcagtacactactcccgccaccccagctcagtacaacactcctggcacccctggtattactggtgggtacgagccccctcatggagacactgttcacatgccccccacagttggtgatgacacaaactacattcccaccaaggttcgcaccaacctgtctctcaactcgtccaaatctaacttgcagcactctggagtgttccaatggaccgatgtttgctacgatatcaaggttgctggtgagaacaagcgattgctggaccatatcgacggttacgtgaagcccggtaccctcaccgctctcatgggagcttctggtgctggaaagactactcttcttgatgtgctggctgatcgaaaatccactggtattgttcatggagacatgttggtcaatggccagcagcgaaacgcctctttccagcgaaagaccggatacgttcaacagcaggatttgcatactgccactgccactgttcgtgagtctctcgagttctcagctctgttgcgacagccctcttctgtgtctcgagctgacaagctggcttacgtcgatgaggtcatttctattcttgagatggattcttacgctgatgccgttgttggtgttcctggtgaaggtcttaacgtggaacagcgaaagcgtctgactatcggcgtcgagcttgctgccaagcccgagctgctgcttttcctggatgagcctacctccggtctggattcccagactgcttggtctatcgtctctctgctcaaaaagctggctgccaacggtcaggctatcctgtgtaccatccatcagccctctgccattctgttccaagagtttgatcgacttctgttcctggcagccggtggaaagacagtgtactacggagacctcggtgataaggcgtctctgctcattgaatactttgaaagtaacggtgctgacccttgtcctgataacggtaaccctgccgaatggatgctggaggtaattggtgctgctcctggttcccgggccaagaaggactggccctcagtctggcgatactcccagcttcgacgacaacagcgtgaggaactcgatgatatgcgtcttgcattcaacgctgactctcaggcagctcttgcagttggaggagaagacactgatttcgccgtgtctcagtggacccagctgtactacgttaccaagcgactgctgcagttccactggcgaactccctcctatctgtggtccaagatgactctgtgtattggttgtgctctgttcattggtttctccttctacaagtcggctcgagacattcagggtcttcagaaccaaatgtttagtattttcctcatgttcctgattttcaccacagttgccgagcagattatgcctcttttcatgattcagcgagacttgtacgaggctcgagagcgtgcttccaagacttactcgtggcaggtgttcctcggcggaaatatgctcgcggagcttccctggcagattatcgtggcggttgtcgtcttcttctgcatgtactaccccattggattctatcgaattgcggctgagaaccaccagacacaggagcgaggagctctctacttcctcttcctgctggtcttcttcatttacgactctacctacgctcacatgattggtgtcatgttcaacaaccacgagacggcagccaactttgcatacctgctcttctccttctgtcttatgttctgtggtgtgctggccacgaaggagtccatgcctggattctggatcttcatgtaccgagcgtcgcctctgacatacttcattggcggtttcatggccactggtttggccggaggaaaggtgacatgttcgcaacatgagattttgcagttcaagcctctcaagggcaactcttgtgcacagtacatgaaacccttcctggacaatgctggcatcttcaagggctacctgctcaatgaaactgccaccgacatgtgtcactattgccccatcgagaacgctgatgcctacctcgacaatgcctccattttctatggagaccgatggcgaaactttggcattgtgtttgcctatcccatcttcaacgtttgtgccacctttatgctctactacgttcttcgagttcctggcgtgcgatacaagattgcgtccaaggtccgatggcgacgaaagaagcagtaa(SEQ ID NO.3所示)。

在一些具体实施例中，本发明所述的一种菌株构建方法步骤为：

(1)烷烃羟化酶密码子优化；

(2)烷烃羟化酶基因或羟基转移酶ABC1基因与载体骨架进行整合；

(3)整合体系转化大肠杆菌，经菌落PCR验证筛选正确的转化子；

(4)获得整合载体并NotI酶切获得整合片段；

(5)整合片段转化酵母底盘菌株，获得重组酵母工程菌株。

进一步的，本发明所述的烷烃密码子优化是指经过解脂酵母密码子优化。

更进一步地，本发明所述的烷烃羟化酶基因或羟基转移酶ABC1基因与载体骨架进行整合，是利用同源重组的方式，设计带有同源臂的PCR引物，扩增得到同源臂的目的片段，将片段与载体进行同源重组后转化大肠杆菌。

在一些具体实施例中，本发明所述的整合片段是将构建好的重组质粒经NotI酶切、琼脂糖凝胶电泳后回收正确的目的条带进行酵母基因组整合。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1高效烷烃降解菌株构建

(1)强化烷烃降解路径的解脂底盘的构建

本研究选取解脂耶式酵母ATCC 201249作为出发菌株，将经过解脂耶氏酵母密码子优化后的烷烃羟化酶LadA(序列如SEQ No.1所示)、AlmA2(序列如SEQ No.2所示)基因整合在带有高效人工启动子PHp4d的多拷贝载体PINA1269(序列如SEQ No.4所示)上，该载体为整合型质粒，携带pBR322同源序列。首先PCR扩增得到带有载体同源片段的目的基因，随后利用BamHI/KpnI对多拷贝载体PINA1269进行双酶切，回收得到线性载体PINA1269。将目的片段与线性化载体PINA1269同源重组，构建了新的烷烃羟化模块PHp4d-LadA-xpr2t和PHp4d-AlmA2-xpr2t。连接产物转化大肠杆菌，以表1所列引物进行菌落PCR验证，挑选正确转化子送测，获得多拷贝烷烃羟化菌株EGAH06、EGAH07。提取大肠杆菌质粒，将重组质粒经NotI释放后进行凝胶电泳并回收片段。将目的片段分别转化出发菌株Y，涂布到SC-Leu的固体培养基中，放置到30℃培养箱中培养2-3天。在3个固体平板中分别随机挑取24个单菌落，利用对应引物进行菌落PCR验证，筛选条带正确转化子并送测，获得多拷贝酵母菌株YAH06和YAH07。

表1引物

(2)强化烷烃转运路径的菌株构建

在解脂耶氏酵母中，烷烃转运蛋白ABC1，类似于酵母多效耐药转运蛋白PDR5，被确定为烷烃吸收所必需。因此我们将解脂酵母内源性烷烃转运蛋白ABC1(序列如SEQ No.3所示)过表达于野生型解脂酵母和工程酵母YAH06中，希望能进一步提高烷烃的降解效果。以菌株ATCC 202149基因组为模板进行利用表1所示引物进行PCR扩增，获得带有PINA1269同源臂的目的片段ABC1。将目的片段通过同源重组的方法与线性化多拷贝载体PINA1269进行组装，组装产物转化大肠杆菌，进行菌落PCR验证，挑选条带正确的转化子送测。提取正确的大肠杆菌质粒，将重组质粒经NotI释放后进行凝胶电泳并回收正确片段，线性化载体PINA1269-ABC1分别转化入出发菌株Y和工程酵母YAH06中，分别涂布到SC-Leu或SC-Ura-Leu的固体培养基中，放置到30℃培养箱中培养2-3天。随机挑取单菌落进行菌落PCR验证，筛选条带正确转化子并送测，获得酵母菌株YAH12和YAH13。

对构建菌株烷烃降解率及生长情况进行测定。YAH12和YAH13菌株分别发酵培养96h，所用培养基为SC-葡萄糖+正十六烷(10g/L)，结果显示，过表达解脂酵母内源基因ABC1的菌株YAH12和组合表达ABC1和LadA基因的YAH13生长状态差距不大，工程菌株YAH12和YAH13均实现了提高烷烃降解效果的功能，96h烷烃降解率分别为65.04％和75.12％。在目前已改造菌株中，组合表达的YAH13的96h烷烃降解率最高，是出发菌株Y的1.67倍。

实施例2生物表面活性剂对正十六烷降解的影响

为了验证生物表面活性剂对于菌株降解烷烃的影响，研究测定了解脂酵母在外源添加不同浓度槐糖脂(100mg/L，200mg/L和500mg/L)的条件下正十六烷降解率，在正十六烷降解培养基中摇瓶培养96h，结果如图1所示，在添加500mg/L槐糖脂的情况下，解脂耶式酵母ATCC 201249的96h正十六烷降解率达70.36％，比不添加生物表面活性剂的培养基提高约25％。即本研究证明了槐糖脂生物表面活性剂可以有效促进正十六烷的降解。

实施例3降解正十六烷复合菌的构建

(1).初步探索新复合菌利用正十六烷的情况

将可以产槐糖脂的球拟假丝酵母菌株(CB)分别与Yarrowia lipolytica ATCC201249和本实验室构建的具有良好降烷烃效果的工程菌株YAH06、YAH07、YAH12以及YAH13构建复合菌(表2)，初步探索新复合菌利用正十六烷的情况，结果如图2所示。在同样的培养条件下，菌株在混菌体系比单菌的生长状态更好，其中YAH13+CB的混菌体系96h的OD

表2使用菌株

接下来进一步探究最优复合体系YAH13+CB中混菌关系的改变，将两菌以1：1的比例接种于正十六烷降解培养基中，在适当时间间隔中取样，对两菌菌数进行测定。根据工程Y.lipolytica和产槐糖脂的C.bombicola各自的Actin激动蛋白为参比基因设计引物(表3)，使用稀释涂板与实时定量荧光PCR相结合的的方法对复合体系中的菌体数量进行测定。

稀释涂板计数法步骤为：吸取100μL待测菌液至900μL无菌YPD液体培养基中，在涡旋震荡器中充分振动混匀，成功将菌液稀释10倍。然后，重复上述操作，继续将菌液稀释到102～108倍。最后吸取106、107和108三个稀释倍数的样品各50μL，均匀涂布于固体平板表面，做三组平行。在30℃培养箱中培养两天后，计数固体平板表面的单菌落，根据菌液稀释倍数计算出待测菌液中菌体数量(CFU)。实时荧光定量PCR计数法步骤为：分别吸取100μLY.lipolytica和C.bombicola单菌培养的菌液，利用上述稀释涂板计数法确定菌液的CFU值。然后，分别从梯度体积(1μL、10μL、50μL、100μL、200μL、500μL和1000μL)的菌液中提取基因组DNA，以二菌各自的肌动蛋白基因(ACT)为模版进行qPCR反应，获得相应的Ct值。分别利用各自的Ct值与相对应CFU值建立标准曲线(如图10所示)。以LnCFU为纵坐标，相应的Ct值为横坐标建立标准曲线，作为确定单菌在混菌中数量的依据。

结果如图3所示。YAH13在混菌体系YAH13+CB中的生长要优于C.bombicola，其菌体密度在前72h快速提升，其中在48h到72h生长速率最快，在96h时可以达到6.55×10

表3荧光定量PCR引物

(2).复合菌培养条件的优化

以具有最强降烃能力的YAH13+CB复合菌作为研究对象，对混菌体系接种比例、温度、碳源等培养条件进行优化，结果如图4所示。

共培养体系中不同菌种的数量一定程度上会决定混菌体系降烃效果。因此，为了寻找最佳接种比例，本研究共设置了5个初始接种比例，解脂酵母和球拟假丝酵母两菌比例分别为1：1、1：2、1：4、2：1和4：1。固定解脂酵母的初始OD

解脂酵母的适宜培养温度为28-30℃，而球拟假丝酵母的适宜培养温度为25-37℃，因此本研究共设置五个温度梯度，分别为26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，将YAH13+CB混菌体系在不同温度条件下于正十六烷降解培养基中摇瓶培养96h，探索该复合菌的最佳生长温度，结果如图5所示。当培养温度为30℃时混菌体系的正十六烷降解率最高，为81.57％。在培养温度在28℃和32℃时混菌体系的正十六烷降解率相似，大约为75％，然后当温度下降到26℃时可以观察到正十六烷降解率的明显下降，仅为44.67％，出现该结果的原因可能是因为低温一方面影响菌株生长代谢烷烃，另一方面温度降低会导致烷烃粘度增加，不利于菌株代谢。而当培养温度升高到34℃，混菌体系96h正十六烷的降解率为62.95％，下降程度不高，这可能是因为一方面温度的升高增加了烷烃的溶解度并降低粘度，更有利于菌株吸收降解，另一方面酵母菌株生长因为温度升高而受到一定程度的抑制，从而降低烷烃降解率。

因为球拟假丝酵母的生长受到碳源及TCA中间产物等影响，因此进一步研究外源添加营养物(碳源、氮源和TCA中间产物)对于混菌体系降解正十六烷的影响，结果如图6所示。混菌体系在外源添加20g/L的营养物的条件下，在正十六烷降解培养基中培养96h，其中外源添加葡萄糖的效果最好，正十六烷降解率高达85.49％。其次是外源添加琥珀酸，正十六烷降解率为84.25％。其他外源添加营养物质对于混菌体系降烃效果提升不明显。

为了进一步研究在外源添加葡萄糖条件下混菌体系中两菌数量变化，将两菌以1：1的比例接种于SC(10g/L正十六烷)培养基中，在适当时间间隔中取样，按照相同的方法对两菌菌数进行测定。结果如图7所示，C.bombicola在YAH13+CB混菌体系的生长要明显优于YAH13，其菌体密度也在前72h快速提升，其中在48h到72h生长速率最快，在96h时可以达到23.8×10

(3).复合菌混菌体系中解脂酵母转录水平的分析

在解脂酵母中强化烷烃羟化及转运路径可促进了解脂酵母降解长链烷烃的能力。为了进一步比较研究解脂酵母在单菌培养与人工混菌培养时降烃能力的不同表现，本文进行了更深层次的探究，探究分为两个方面：分别对解脂酵母中烷烃羟化关键酶基因(Alk1、Alk2、Alk5和LadA)以及烷烃转运蛋白ABC1的转录水平进行测定。对照组：YAH13单菌培养96h于SC液体培养基(10g/L正十六烷)；实验组：YAH13和C.bombicola混菌培养96h于SC液体培养基(10g/L正十六烷)。本研究每隔24h提取混菌体系的total RNA，逆转录后进行qPCR反应，以Actin为内参基因，分析对照组和实验组中YAH13降烃相关基因的转录水平。

结果如图8所示，从上述结果中可看出与C.bombicola共培养后，YAH13菌株中与烷烃降解相关的基因的转录水平会发生改变。第一天，只有Alk1基因的表达水平上调1.27倍，其余基因的转录水平相较于单菌体系均有不同程度的降低，说明第一天共培养会导致YAH13菌株中与降烃有关的大部分基因表达下调，这可能是因为培养基中的烷烃部分被C.bombicola降解有关，降低了YAH13的代谢负担。而在第二天YAH13中降烃相关基因表达均有大幅度提升，其中，内源性基因中的Alk1、Alk2、Alk5和ABC1的表达分别是YAH13单菌的8.36、5.22、1.25和11.6倍，外源基因LadA的转录水平是YAH13单菌1.28倍。第三天混菌体系中YAH13菌株中与降烃相关基因转录水平相较于单菌YAH13也有小幅度提升，Alk1、Alk2、LadA和ABC1基因的表达分别是YAH13单菌的4.70、3.57、2.54和1.79倍。针对于混菌体系中YAH13菌株在第二天和第三天时降烃基因表达量上调的结果，可能是因为C.bombicola在亲水碳源和疏水性碳源同时存在的情况下，48h酵母菌株进入稳定期，槐糖脂开始大量生成，而槐糖脂作为生物表面活性剂会提高碳氢化合物的生物利用度。Zhou等人也报告了类似的趋势，他们发现弧菌(Vibrio sp.LQ2)产生的生物表面活性剂不仅能溶解碳氢化合物，还能实现关键降解相关基因的高表达。而第四天混菌体系中YAH13菌株中降烃相关基因表达量明显降低，均低于YAH13单菌体系，这可能是因为96h时混菌体系中C.bombicola在SC培养基条件下的菌株密度远大于YAH13(图7)，混菌体系中的烷烃更多得被C.bombicola降解，YAH13烷烃代谢通路中相关基因表达量下调。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 复合菌及其在降解长链烷烃中的应用

<130> MP22012729

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1323

<212> DNA

<213> 嗜热脱氮土壤芽孢杆菌NG80-2(Geobacillus thermodenitrificans NG80-2)

<400> 1

atgaccaaga agatccacat caacgccttc gagatgaact gcgtgggcca catcgcccac 60

ggcctgtggc gacatcccga gaaccagcga caccgataca ccgacctcaa ctactggacc 120

gagctggccc agctgctgga gaagggcaag ttcgacgctc tgttcctcgc cgacgtcgtt 180

ggcatctacg acgtctaccg acagtcccga gacaccgccg tgcgagaggc tgtgcagatt 240

cccgtgaacg accccctgat gctgatctcc gctatggcct acgtcaccaa gcatctggcc 300

ttcgccgtca ccttctccac cacctacgag cacccctacg gccacgcccg acgaatgtcc 360

accctggacc acctgaccaa gggccgaatc gcctggaacg tcgtcacctc ccacctgcct 420

tccgccgaca agaacttcgg catcaagaag atcctcgagc acgatgagcg atacgacctg 480

gccgacgagt acctcgaggt ttgctacaag ctgtgggagg gttcctggga ggacaacgct 540

gtgattcgag acatcgagaa caacatctac accgacccct ccaaggtcca cgagatcaac 600

cactccggca agtacttcga ggtccccggc ccccacctgt gcgagccttc ccctcagcga 660

acccccgtca tctaccaggc cggcatgtcc gagcgaggcc gagagttcgc cgccaagcac 720

gctgagtgcg tcttcctggg tggcaaggac gttgagactc tgaagttttt tgttgacgac 780

atccgaaagc gagccaagaa gtacggccga aaccccgacc acatcaagat gttcgccggt 840

atctgcgtta tcgtcggcaa gacccacgac gaggccatgg agaagctgaa ctccttccag 900

aagtactggt ccctggaggg ccacctggcc cactacggtg gtggtactgg ctacgatctg 960

tccaagtact cgtctaacga ctacatcgga tctatctccg tcggcgagat cattaacaac 1020

atgtctaagc tggacggtaa gtggttcaag ctgtctgtgg gtactcccaa gaaggtcgcc 1080

gacgagatgc agtacctggt cgaggaggcc ggcattgatg gttttaacct ggtccagtac 1140

gtcagccctg gtactttcgt ggacttcatc gagctggtgg tccccgagct ccagaagcga 1200

ggactgtacc gagtcgatta cgaggagggt acttaccgag agaagctgtt tggcaagggc 1260

aactaccgac tgcccgatga ccacatcgcc gcccgatacc gaaacatctc ctccaacgtg 1320

taa 1323

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> 不动杆菌 (Acinetobacter sp.)

<400> 2

atggagaagc aggtcgatgt cctgatcatc ggcgccggta tctccggtat cggcctggct 60

gttcacctgt ccaagaactg cccccagcga aagttcgaga tcctggagcg acgagactcc 120

tttggcggca cctgggacct gttccgatac cctggtatcc gatctgactc cgacatgtcc 180

acctttggct tcaacttcaa gccctgggcc aaggacaagg tcctggcttc tggagccgag 240

attaagggct acctgtctga cgtcatttct gagaaccagc tcaaggacaa gatccacttc 300

ggtcaccgag tcctctccgc caactacgac tccgctaaga agaagtgggc cgtcgagatc 360

gaggactcca acaagaagaa gcagacctgg tccgccaact tcgtgatggg ctgcaccggt 420

tactacaact acgaccaggg atacgccccc aagttcccca agcaggagga cttcaagggc 480

cagctgatcc acccccagca ctggcctgag aacctggact acaccggcaa gaaggtggtc 540

atcatcggct ccggagccac cgctatcacc ctggttcctt ccatggtcaa gggcggagcc 600

ggtcacgtta ccatgctcca gcgatccccc tcctacatcg ccaccatccc ttccatcgac 660

ttcatctacg agaagacccg aaagttcatg tctgaggaga ctgcctacaa gttcacccga 720

gcccgaaaca tcggcatgca gcgaggtatc tacgccctgg ctcagaagta ccccaagacc 780

gtccgacgac tgctgctgaa gggcatcgag ctgcagctga agggcaaggt cgatatgaag 840

cacttcaccc cctcctacaa cccctgggac cagcgactgt gcgtggttcc tgacggagac 900

ttgtttaagg ccctgcgaga gggccaggcc aacgttgaga ctgaccagat tgagaagttc 960

accgccaacg gcattcagct caagtccggc aagcacctgg aggctgacat cgtgatttcc 1020

gccaccggac tggagatcca gatcctggga ggtgtgaagg gaaccatcga cggcaagccc 1080

atggacacct cccagcacat gctgtaccag ggcgtgatgg tcagcgatgt tcccaacatg 1140

gccatgatca ttggctacat caacgcctcc tggaccctga aggtcgatat cgccgccgac 1200

tacatctgcc gactcctgaa ccacatggac aagaacggct acgacgaggt catcgcccac 1260

gctgaccctg ctctgcgaga gcaggacacc atcatgggaa agatgtcctc cggttacatc 1320

gcccgagccg ctgacgttat gcccaagcag ggtaagaagg ccccctggaa gattaccaac 1380

aactacctgg ccgaccgaaa ggagctgaag gacgcttcct ttaacgacgt ggtcctgcag 1440

tttcacaagc gaggcgagca ggtcgatcga aagcccaagc tcgtatccta a 1491

<210> 3

<211> 5315

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母ATCC 201249(Yarrowia lipolytica ATCC 201249)

<400> 3

atggcgcact actacccgtc gggcgtgtcg tcggtcggca acttcgactc gctagatgtc 60

gagatcagat cgctggccga gggaatggta cacaaacctc accatcgaga atcgcgatac 120

attttcgacc acacctttga cgacgagttt cgagaagagc atgaggacga atacgactat 180

gatatgctgc ggaagacgtc ttttgagaac cccgacgtca acccttacgt ggaggccagt 240

gcggagccgg agctggatcc ctggtcgggc gagttcaact cgcgaaagtg gatcaagacc 300

gtgctgggtc tcaaggagcg atttggaaac agtaagggaa tcacggccgg cgtgtcgttc 360

aagaacctgg gtgcctacgg gtacggcagt cgcagtgact accagaagac gtttctcaac 420

gtcattgtgg ccactggaga tttgctgcga agtgctattg gcgctaaacg gacaagcaaa 480

atccagattc tgcgcaagtg cgatggactg gtgcttccag gtgaaacctg tgtagttctg 540

ggacgtcccg gatcaggatg cactacattt ctcaagagta ttgcttgcga gacgtacgga 600

tttcatgtgg aggaagagac acaatggaac tatcagggtg agtatttggg attatggggc 660

tatgaggtta tgagggagat ggaaataccg gaatgaacat cttccaggtg gtctattctt 720

tcttgttggc cgttattttg tgtccacctg atttttttta tttttttatt ttttattttt 780

tatttttgtg tgttgcacac attccaatca gtgcagatca ctcccaacac ggccggtatc 840

taatacctag acccgaatag agtgttctgt acgcgataat cataccaggt gggaatcaga 900

acacaagaac aaagaaagca gatttccgcg gagcgcgaaa aacaataacc aataatgacc 960

ctactaacgc aggcgtacca cgagatgtca tgacaaagca ttgccgagga gaaattgtct 1020

acaatgctga acacgatatc catttccctc acttgacggt cggacagacc ctcatgtttg 1080

cggctctagc ccgaactccc cgaaaccgag tgctgggagt gacccgagag cagtatgctc 1140

gtcacacccg agatgttacc atggccactc tcggtctgtc tcacacaatc aacaccaagg 1200

ttggatccga tctagtgcgt ggagtctccg gtggagagag aaaacgagtc tctattgccg 1260

agtccgtcgt ctgcggagcg cctctacagt gctgggataa ctccactcga ggtctggatg 1320

ctgcgaacgc caccgaattc attcgatctc tgcgactttc cgcccagatg acaggcgcct 1380

ccatgtttgt gtctctgtac caggcttccc aggaggccta cgacatgttc gacaaggtgt 1440

gtctgctgta cgagggacga caaatcttct tcggtaaggc cggagaggcc acatcatact 1500

ttgagggtct gggattcgag cgagcccatc gccagaccac tggtgatttt ctgacctccc 1560

ttacaaaccc tgtcgagcga agaatcaagg ctggatggga gaagctcgtg cctcgaactc 1620

ccgaggagtt tgagtctcga tggagatcgt cccgaacaca cgctctgtta gtttacaaca 1680

tcgaccgatt caataccact catcctcttg gtggtcaggg ttatgtcgag ttcatgaagc 1740

tccgaaagga gtctcaggcc cgaaataccc gtctgtcgtc gccatatctg ctctcctggc 1800

ccatgcaggt tcgtctgtgt ctctggagag gcttcttgtt ggtgagagga gacttgtcca 1860

tgacgctgat gaccatcatt ggtaacttca tcatggccct cattctggca tcaatgtact 1920

ataatttgcg agagtcgact gatgccttct tctcgcgatc tgccctgctt ttcttggcca 1980

tgttgctgaa cgctatggcc tccgttttgg agattttcgt gctgtacgga cagcgaccac 2040

tgattgagaa acacaaacga tatgcattgt accatccctt tgcagaatca atcgcgtcaa 2100

tgttggttga tttaccgacc aaactggcaa ctctgatttc agtcaacctc gctctttact 2160

tcatgactaa cctgagacga accccgggtg ccttcttcat cttcctgctc ttttcgttca 2220

cctgtaccat ggcaatgtcc atgattttcc ggttcactgc ttctgtcacc aagactatgg 2280

aacaggctct ggcccccgcc tctgtgctag ttttggcact ggttatttac actggtttca 2340

cgcttcccgt cgattacatg catggatggg cccgatggat gaattacctc aatcctgttg 2400

cttatgcgtt tgaggcagta atggtgaacg agttccgaaa cagaaggttc ccttgtggac 2460

tttacgttcc ttcccggtct ttctacaact ctgtgcccgc tgagtccaag tcttgtgtgg 2520

ctatcggcgc caagctcggc caggactacg tcgatggctc cgtgttcatc agcacggcct 2580

acaagtacga gactggacac ctgtggcgaa acctgggcat tctgtgggcc tttgctggct 2640

ttttctgcgg cgtctacctg cttgctgccg agtacgtgac catggcccag tccaagggtg 2700

aggttctgct gttcaagcga tcccagcatc gaaagaacct caaggccaag cctgacaagc 2760

gattccaaga cgttgagctt ggagacaacc tcggcgacca caacttggac caaaacctcg 2820

gcgacaacca ctcgacgtac tcttaccagc aacccatcca ggctcagatt cccccttctc 2880

ggtacgccca gcaggctccc atgactcccg ctcctatgat gcatgtcccc atgactcctg 2940

gtggcatgct ttctcccggt cagcaaatgt tctctcccgg tcagcaaatg atgacgcctg 3000

gtcccatgtc acccgcaggc atgatgactc ccggttttac atatgtgccc ccccatggag 3060

acactattca ccaaccgcct accgttggag acgacatcaa ctacacgact cccgcgcccc 3120

aggtgaactt cacccctgcc actccagctc agtacactac tcccgccacc ccagctcagt 3180

acaacactcc tggcacccct ggtattactg gtgggtacga gccccctcat ggagacactg 3240

ttcacatgcc ccccacagtt ggtgatgaca caaactacat tcccaccaag gttcgcacca 3300

acctgtctct caactcgtcc aaatctaact tgcagcactc tggagtgttc caatggaccg 3360

atgtttgcta cgatatcaag gttgctggtg agaacaagcg attgctggac catatcgacg 3420

gttacgtgaa gcccggtacc ctcaccgctc tcatgggagc ttctggtgct ggaaagacta 3480

ctcttcttga tgtgctggct gatcgaaaat ccactggtat tgttcatgga gacatgttgg 3540

tcaatggcca gcagcgaaac gcctctttcc agcgaaagac cggatacgtt caacagcagg 3600

atttgcatac tgccactgcc actgttcgtg agtctctcga gttctcagct ctgttgcgac 3660

agccctcttc tgtgtctcga gctgacaagc tggcttacgt cgatgaggtc atttctattc 3720

ttgagatgga ttcttacgct gatgccgttg ttggtgttcc tggtgaaggt cttaacgtgg 3780

aacagcgaaa gcgtctgact atcggcgtcg agcttgctgc caagcccgag ctgctgcttt 3840

tcctggatga gcctacctcc ggtctggatt cccagactgc ttggtctatc gtctctctgc 3900

tcaaaaagct ggctgccaac ggtcaggcta tcctgtgtac catccatcag ccctctgcca 3960

ttctgttcca agagtttgat cgacttctgt tcctggcagc cggtggaaag acagtgtact 4020

acggagacct cggtgataag gcgtctctgc tcattgaata ctttgaaagt aacggtgctg 4080

acccttgtcc tgataacggt aaccctgccg aatggatgct ggaggtaatt ggtgctgctc 4140

ctggttcccg ggccaagaag gactggccct cagtctggcg atactcccag cttcgacgac 4200

aacagcgtga ggaactcgat gatatgcgtc ttgcattcaa cgctgactct caggcagctc 4260

ttgcagttgg aggagaagac actgatttcg ccgtgtctca gtggacccag ctgtactacg 4320

ttaccaagcg actgctgcag ttccactggc gaactccctc ctatctgtgg tccaagatga 4380

ctctgtgtat tggttgtgct ctgttcattg gtttctcctt ctacaagtcg gctcgagaca 4440

ttcagggtct tcagaaccaa atgtttagta ttttcctcat gttcctgatt ttcaccacag 4500

ttgccgagca gattatgcct cttttcatga ttcagcgaga cttgtacgag gctcgagagc 4560

gtgcttccaa gacttactcg tggcaggtgt tcctcggcgg aaatatgctc gcggagcttc 4620

cctggcagat tatcgtggcg gttgtcgtct tcttctgcat gtactacccc attggattct 4680

atcgaattgc ggctgagaac caccagacac aggagcgagg agctctctac ttcctcttcc 4740

tgctggtctt cttcatttac gactctacct acgctcacat gattggtgtc atgttcaaca 4800

accacgagac ggcagccaac tttgcatacc tgctcttctc cttctgtctt atgttctgtg 4860

gtgtgctggc cacgaaggag tccatgcctg gattctggat cttcatgtac cgagcgtcgc 4920

ctctgacata cttcattggc ggtttcatgg ccactggttt ggccggagga aaggtgacat 4980

gttcgcaaca tgagattttg cagttcaagc ctctcaaggg caactcttgt gcacagtaca 5040

tgaaaccctt cctggacaat gctggcatct tcaagggcta cctgctcaat gaaactgcca 5100

ccgacatgtg tcactattgc cccatcgaga acgctgatgc ctacctcgac aatgcctcca 5160

ttttctatgg agaccgatgg cgaaactttg gcattgtgtt tgcctatccc atcttcaacg 5220

tttgtgccac ctttatgctc tactacgttc ttcgagttcc tggcgtgcga tacaagattg 5280

cgtccaaggt ccgatggcga cgaaagaagc agtaa 5315

<210> 4

<211> 7076

<212> DNA

<213> 人工序列(aitificial)

<400> 4

cgcctgagtc atcatttatt taccagttgg ccacaaaccc ttgacgatct cgtatgtccc 60

ctccgacata ctcccggccg gctggggtac gttcgatagc gctatcggca tcgacaaggt 120

ttgggtccct agccgatacc gcactacctg agtcacaatc ttcggaggtt tagtcttcca 180

catagcacgg gcaaaagtgc gtatatatac aagagcgttt gccagccaca gattttcact 240

ccacacacca catcacacat acaaccacac acatccacaa tggaacccga aactaagaag 300

accaagactg actccaagaa gattgttctt ctcggcggcg acttctgtgg ccccgaggtg 360

attgccgagg ccgtcaaggt gctcaagtct gttgctgagg cctccggcac cgagtttgtg 420

tttgaggacc gactcattgg aggagctgcc attgagaagg agggcgagcc catcaccgac 480

gctactctcg acatctgccg aaaggctgac tctattatgc tcggtgctgt cggaggcgct 540

gccaacaccg tatggaccac tcccgacgga cgaaccgacg tgcgacccga gcagggtctc 600

ctcaagctgc gaaaggacct gaacctgtac gccaacctgc gaccctgcca gctgctgtcg 660

cccaagctcg ccgatctctc ccccatccga aacgttgagg gcaccgactt catcattgtc 720

cgagagctcg tcggaggtat ctactttgga gagcgaaagg aggatgacgg atctggcgtc 780

gcttccgaca ccgagaccta ctccgttcct gaggttgagc gaattgcccg aatggccgcc 840

ttcctggccc ttcagcacaa cccccctctt cccgtgtggt ctcttgacaa ggccaacgtg 900

ctggcctcct ctcgactttg gcgaaagact gtcactcgag tcctcaagga cgaattcccc 960

cagctcgagc tcaaccacca gctgatcgac tcggccgcca tgatcctcat caagcagccc 1020

tccaagatga atggtatcat catcaccacc aacatgtttg gcgatatcat ctccgacgag 1080

gcctccgtca tccccggttc tctgggtctg ctgccctccg cctctctggc ttctctgccc 1140

gacaccaacg aggcgttcgg tctgtacgag ccctgtcacg gatctgcccc cgatctcggc 1200

aagcagaagg tcaaccccat tgccaccatt ctgtctgccg ccatgatgct caagttctct 1260

cttaacatga agcccgccgg tgacgctgtt gaggctgccg tcaaggagtc cgtcgaggct 1320

ggtatcacta ccgccgatat cggaggctct tcctccacct ccgaggtcgg agactttgtt 1380

gccaacaagg tcaaggagct gctcaagaag gagtaagtcg tttctacgac gcattgatgg 1440

aaggagcaaa ctgacgcgcc tgcgggttgg tctaccggca gggtccgcta gtgtataaga 1500

ctctataaaa agggcccagc cctgctaatg aaatgatgat ttataattta ccggtgtagc 1560

aaccttgact agaagaagca gattgggtgt gtttgtagtg gaggacagtg gtacgttttg 1620

gaaacagtct tcttgaaagt gtcttgtcta cagtatattc actcataacc tcaatagcca 1680

agggtgtagt cggtttatta aaggaaggga gttgtggctg atgtggatag atatctttaa 1740

agctggcgac tgcacccaac gagtgtggtg gtagcttgtt actgtatatt cggtaagata 1800

tattttgtgg ggtttttagt ggtgtttggt aggttagtgt ctggtatatg agttgtaggc 1860

atgacaattt ggaaaggggt ggactttggg aatattgtgg gatttcaata ccttagtttg 1920

tacagggtaa ttgttacaaa tgatacaaag aactgtattt cttttcattt gttttaattg 1980

gttgtatatc aagtccgtta gacgagctca gtgccatggc ttttggcact gtatttcatt 2040

tttagaggta cactacatcc agtgaggtat ggtaaggttg agggcataat gaaggcacct 2100

tgtactgaca gtcacagacc tctcaccgag aattttatga gatatactcg ggttcatttt 2160

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aacagatctc ggcagtctct cggatgtaga attaggtttc cttgaggcga gatgagacgg 2280

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cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2400

tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 2460

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 2520

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ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3000

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