一种基于LAMP和Multi-LAMP的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组

摘要

本发明公开了一种基于LAMP和Multi‑LAMP的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组，属于生命科学及医学领域。本发明的试剂组包含核苷酸序列SEQ ID NO.1‑56所示的用于鉴定14种种属的引物、14种种属的DNA、LAMP反应试剂等，14种种属分别为牛、叙利亚仓鼠、猫、狗、人、小鼠、鸡、猪、中国仓鼠、大鼠、兔、豚鼠、绿猴、恒河猴。本发明不需要提取样品DNA，样品经过快速裂解后，可以直接在水浴锅中进行LAMP反应，结果肉眼可读。本发明可以在一管中同时检测出13种种属的细胞。

说明书

技术领域

本发明属于生命科学及医学领域，主要涉及到一种实验用细胞种属，及其他种属交叉污染的快速检测试剂组。

背景技术

细胞是生命科学和医学领域体外研究的重要模型，为了确保相关研究的正确性和可重复性，细胞的种属必须是正确的，且没有其他种属污染。原代细胞在分离的时候，细胞系在建系的时候，取材错误，耗材共用会导致交叉污染。永生化的细胞因为具备无限传代的能力，在传代的过程中，操作失误也很容易引入其它细胞，导致污染。在细胞培养相关研究的早期，人们就意识到了细胞种属来源鉴定和交叉污染检测的重要性，一旦身份错误的细胞被使用，相关研究无效，造成各种资源，时间和金钱的浪费。错误的实验结论如果用于临床，后果会非常严重。

目前关于细胞种属鉴定及交叉污染检测的技术主要有同工酶法和PCR法。在过去的五六十年，同工酶检测一直是种属鉴定的标准方法，该方法是基于不同种属间同工酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD，乳酸脱氢酶LD，核苷磷酸化酶NP，苹果酸脱氢酶MD)电泳条带数量和大小的差异来鉴定细胞的种属。同工酶分析需要优化实验条件，包括电泳、显色时间来确定合适的条带迁移距离，以及选择合适的酶的组合来判断预期物种。有些物种的条带相似，很难区分，因此电泳结果的分析需要跟一组已知物种进行比对，才能确定种属来源。此外，商业化的试剂盒已于2015年停止销售，用于配制电泳缓冲液的药品在管控范围内，很难购买。这些因素限制了同工酶电泳在细胞种属鉴定中的应用。

细胞种属鉴定的PCR法是最近20年发展起来的，该方法通过PCR仪扩增种属特异性基因获得不同大小的条带，通过琼脂糖凝胶电泳来判断细胞的种属来源，跟同工酶法相比较，检测速度较快，相关试剂容易购买，但是需要PCR仪，DNA成像仪。

环介导等温扩增法LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)是一种新型的核酸扩增技术，针对目的基因设计4条引物，恒温反应几十分钟，就能肉眼判断实验结果。该方法比PCR法更简单，灵敏度更高，不需要价格万元以上的PCR仪，普通的水浴锅，就能满足实验需求。目前还没有人将LAMP用于细胞种属鉴定和交叉污染的检测中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LAMP和Multi-LAMP的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组，本发明的目的还在于提供所述试剂组的使用方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于LAMP和Multi-LAMP的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组，包含下述表1中所示的14种种属的LAMP引物。

表1. 14种种属的LAMP引物

进一步地，所述的试剂组还包含不同种属的DNA。

进一步地，所述的试剂组还包含LAMP反应试剂。所述的LAMP反应试剂包含Bst DNA聚合酶、dNTP、缓冲液。所述的缓冲液优选为含2.5mM Mg

进一步地，所述的试剂组还包括染料。常用于LAMP反应的染料包括孔雀绿、SYBRGreen I、Picogreen、羟基溴酚蓝等。更进一步地，所述的染料为孔雀绿。

进一步地，所述的试剂组还包含细胞裂解液。所述的细胞裂解液的配方优选为：2％Triton X-100，1％SDS，5％蔗糖，25mM Tris-HCl，pH＝7.4。

使用上述试剂组进行已知细胞种属及交叉污染鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)收集待检细胞，加入细胞裂解液，裂解后的液体直接用于下述反应。

(2)取6个EP管；

其中3个EP管用于LAMP反应，分别加入待检细胞所属种属的LAMP引物、Bst DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、孔雀绿，再各分别加入水作为阴性对照、加入待检细胞所属种属DNA作为阳性对照、加入裂解后的液体作为样品；

另3个EP管用于Multi-LAMP反应，分别加入非待检细胞所属种属的13种种属LAMP引物混合物、Bst DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、孔雀绿，再各分别加入水作为阴性对照、加入非待检细胞所属种属的13种种属DNA混合物作为阳性对照、加入裂解后的液体作为样品。

(3)将配制好的6管试剂置于60-65℃孵育35-40分钟。

(4)反应结束后，观察每管的颜色，用于LAMP反应的样品与阳性对照颜色一致，则待检细胞为所属种属细胞；用于Multi-LAMP反应的样品与阴性对照颜色一致，则说明待检细胞无其它种属细胞污染。

使用上述试剂组进行未知细胞种属及交叉污染鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)收集待检细胞，加入细胞裂解液，裂解后的液体直接用于下述反应。

(2)取42个EP管，按照每3个EP管一组对应一个种属，分别为阴性对照、阳性对照、样品管，各组分别加入Bst DNA聚合酶、dNTP、缓冲液、孔雀绿、相应种属的LAMP引物；阴性对照、阳性对照、样品管中分别加入水、对应种属的DNA、上述裂解后的液体。

(3)将配制好的42管试剂置于60-65℃孵育35-40分钟。

(4)反应结束后，根据样品与不同种属阳性对照、阴性对照的颜色，确定待检细胞的种属以及是否有交叉污染。

本发明的优点和有益效果：

1、不需要提取样品DNA，样品经过快速裂解后，可以直接用于LAMP反应。

2、不需要大型设备PCR仪和DNA成像仪，水浴锅中反应，结果肉眼可读。

3、可以在一管中同时检测出13种种属的细胞。

附图说明

图1为实施例1中待检人源细胞的LAMP和Multi-LAMP实验结果。

图2为实施例2中14种物种阳性对照(模板为物种DNA)的LAMP结果。

图3为实施例2中14种物种阴性对照(模板为超纯水)的LAMP结果。

图4为实施例2中待检未知细胞的LAMP结果。

具体实施方式

本发明针对14种常用细胞(牛，叙利亚仓鼠，猫，狗，人，小鼠，鸡，猪，中国仓鼠，大鼠，兔，豚鼠，绿猴，恒河猴)的种属，选取细胞色素氧化酶，ATP合酶为目标基因，设计种属特异性LAMP引物，如上表1所示。

通常，LAMP反应需要设计4-6条引物来扩增目的基因。为了避免LAMP反应的假阳性，表1中提到的引物都是经过大量筛选后，确定具备足够的种属特异性。

为了快速鉴定14种种属细胞(牛，叙利亚仓鼠，猫，狗，人，小鼠，鸡，猪，中国仓鼠，大鼠，兔，豚鼠，绿猴，恒河猴)，制备14个LAMP反应试剂组和14个Multi-LAMP反应试剂组，组分如表2所示。Multi-LAMP反应是指将多个种属的引物按照比例混合后，加到同一个管子中，当出现相应种属的DNA模板后，扩增反应就会开始。为了防止引物交联，影响引物与目的模板的配对，提高引物的灵敏度，所有种属的引物序列都是经过大量比对调整，引物浓度都是经过大量筛选，先2、3组引物混合，再5、6组引物混合，最后13组引物混合在一起。

对于未知种属来源细胞的鉴定，LAMP反应试剂组的组分如表3所示。

表2. 14种种属鉴定的LAMP反应试剂组

表3.未知种属鉴定的LAMP反应试剂组

上述表2、3中的LAMP反应预混液各组分浓度为：1U Bst酶/50μL，0.25mM dNTP，0.1％孔雀绿，含2.5mM Mg

上述表2中Multi-LAMP反应预混液各组分浓度为：1U Bst酶/50μL，0.25mM dNTP，0.1％孔雀绿，含2.5mM Mg

表4.交叉污染检测用引物混合比例(表中比例关系为摩尔比)

每个LAMP反应试剂组中，除了表2和表3中提到的成分，还配有细胞裂解液。细胞裂解液的配方为：2％Triton X-100，1％SDS，5％蔗糖，25mM Tris-HCl，pH＝7.4。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1人源细胞种属及交叉污染的鉴定

实验试剂：待检人源细胞，人源细胞LAMP试剂组，超纯水。

实验器材：水浴锅，加样枪，枪头。

实验步骤：

(1)收集待检细胞，细胞数量1×10

(2)加入细胞裂解液100μL，室温裂解5分钟，裂解后的液体，可以直接用于LAMP反应。

(3)取6个干净的1.5mL EP管，分别标记为“人-”、“人+”、“人样品”、“混-”、“混+”、“混样品”。

(4)在“人-”、“人+”、“人样品”管中分别加入49μL试剂2(人源细胞LAMP反应预混液：酶，dNTP，缓冲液，孔雀绿，人LAMP引物)，在“混-”、“混+”、“混样品”管中分别加入49μL试剂4(非人源细胞Multi-LAMP反应预混液：酶，dNTP，缓冲液，孔雀绿，非人源13种种属LAMP引物混合物)。

(5)在“人-”和“混-”管中分别加入1μL超纯水，作为阴性对照；在“人+”管中加入1μL试剂1(阳性对照：人DNA)，在“混+”管中加入1μL试剂3(阳性对照：非人源13种种属DNA混合物)，作为阳性对照；在“人样品”和“混样品”管中，分别加入裂解好的样品1μL。

(6)将配制好的6管试剂，放入水浴锅中，65℃孵育40分钟。

(7)反应结束后，观察每管颜色的变化。如图1所示，待检细胞“人样品”与“人+”管颜色一致，说明待检细胞为人源细胞；待检细胞“混样品”与“混-”管颜色一致，说明待检细胞无其它种属细胞污染。

实施例2未知细胞种属及交叉污染的鉴定

实验试剂：待检未知细胞，未知种属细胞LAMP试剂组，超纯水。

实验器材：水浴锅，加样枪，枪头。

实验步骤：

(1)收集待检细胞，细胞数量1×10

(2)加入细胞裂解液100μL，室温裂解5分钟，裂解后的液体，可以直接用于LAMP反应。

(3)取42个干净的1.5mL EP管，14个为阴性对照，14个为阳性对照，14个为样品管，分别标记好。

(4)所有EP管，按照每3个一组(阴性，阳性，样品各一管)，对应一个种属，分别加入14个种属的LAMP反应预混液49μL。

(5)在14个阴性对照管中再分别加入1μL超纯水，作为阴性对照；在14个阳性对照管中再加入对应种属的DNA，作为阳性对照；在14个样品管中，再分别加入裂解好的样品1μL。

(6)将配制好的42管试剂，放入水浴锅中，65℃孵育40分钟。

(7)反应结束后，观察每管颜色的变化(图2、图3、图4)。如图4所示，待检细胞仅仅与“小鼠+”管颜色一致，说明待检细胞为小鼠细胞，且无其它种属细胞污染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种基于LAMP和Multi-LAMP的快速检测细胞种属及交叉污染的试剂组

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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