基于基因编辑技术的Wx突变型蛋白及其基因在植物育种中的应用

摘要

本发明公开了水稻Wx突变型蛋白、突变型基因及其应用，本发明还公开利用基因编辑创制外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的育种方法。本发明首次利用基因编辑技术，对

说明书

技术领域

本发明属于作物遗传育种、作物品质改良新资源创新、优良食味作物育种领域，具体涉及基于基因编辑技术的Wx突变型蛋白及其基因在植物育种中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是中国乃至世界范围内的重要粮食作物，对保障粮食安全具有举足轻重的作用。

稻米品质是指稻米在商品流通中所必须具备的基本特征，包括碾磨品质、外观品质、蒸煮与食味品质和营养品质等四个主要方面，其中以外观品质和蒸煮与食味品质尤为重要。种子胚乳是稻米主的要食用部分，从化学成分上分析，构成胚乳的主要成分是淀粉，一般占胚乳干重的90％，甚至更多，因此，稻米的蒸煮食味品质很大程度上取决于淀粉的理化特性，参与水稻胚乳淀粉合成及调控的基因在稻米品质形成的过程中扮演了极其重要的角色。经过科研工作者大量的研究，人们对稻米蒸煮与食味品质性状的遗传基础已有了较为深入的了解，水稻胚乳淀粉合成的途径、参与的基因或酶己经得到了详细的阐明。其中，参与淀粉合成的酶主要包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶等。

构成稻米的淀粉主要有两类，即直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)。直链淀粉是α-1，4-糖苷键连接而成的葡萄糖聚合体，它是一种线性大分子，没有或很少有分支。一般认为，直链淀粉含量(Amylose Content，AC)是稻米蒸煮、加工以及食用品质的决定因素。水稻Wx基因编码颗粒淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)，是控制直链淀粉合成的主效基因，直接影响水稻胚乳和花粉中直链淀粉的含量。该基因于 1990年被克隆，位于第6染色体的短臂，一般粳型品种中该基因由14个外显子和13 个内含子组成，编码由609个氨基酸组成的蛋白。该基因的不同等位变异决定了稻米的直链淀粉含量，截至目前至少有8个已发表的Wx等位基因。在糯稻中，Wx由于第2 外显子23bp的缺失造成了转录提前终止。在非糯品种中，Wx主要分化为Wx-a和Wx-b 两种等位类型。其中，携带Wx-a的稻米直链淀粉含量都在25％以上，属于高直链淀粉类型。Wx-b主要分布在粳稻品种中，携带该基因稻米的直链淀粉含量属中等至较低水平(15％～18％)，与Wx-a相比，Wx-b的变异是由第一内含子剪接位点处G-T变异造成的，突变降低了前体mRNA的剪接效率从而导致稻米中的直链淀粉含量降低。此外，研究人员还克隆了Wx-in等位基因，证明在第6外显子上发生A-C变异可导致直链淀粉含量降至中等水平(18％～22％)。此外，还有3个“软米基因”即Wx-mq、Wx-mp和 Wx-op相继被克隆(所谓的软米，即指的的稻米AC在8％～12％之间，米饭表面光泽透亮、质地柔软、富有弹性、冷饭不硬、食味品质极佳的稻米)，与Wx-b相比，Wx-mq 在第4(氨基酸序列第158位精氨酸突变为组氨酸)和第5(氨基酸序列第191位络氨酸突变为组氨酸)外显子处存在2处突变，导致直链淀粉含量降到10％左右。另一等位基因Wx-mp在第4外显子发生突变(氨基酸序列第158位精氨酸突变为组氨酸)，位置与Wx-mq相同，第5外显子没有突变，携带该等位基因的稻米直链淀粉含量也在10％左右，另一个软米基因为Wx-op与来源于云南毫屁的Wx-hp，都是由第4外显子的A-G 突变造成的(氨基酸序列第165位天冬氨酸突变为甘氨酸)，前人以根癌土壤杆菌糖原合酶为模型，绘制了Wx-hp的三维结构图，推测突变位于淀粉合成酶催化域，导致淀粉合成能力下降。综上，我们认为人为突变(如利用基因编辑技术)Wx基因编码的淀粉合成酶核心催化域的单个氨基酸，尤其是在3-D模型中与第33-36位(Lys-Ser-Gly-Gly) 氨基酸残基相邻的相关氨基酸(据报道此33-36氨基酸残基的位点是淀粉及糖原合成时与ADP-葡萄糖的结合位)，可能能创制新的突变类型，为满足当前市场对稻米品质的更高要求提供材料支持。

目前，江苏、云南、上海等地的软米粳稻品种如南粳46、南粳9108、楚粳39、沪软1212等，食味品质突出，深受广大消费者的喜爱而广泛种植。其中不少品种都获得全国优质稻品种食味品质鉴评金奖。但是，软米粳稻品种虽然在口感上得到了市场的欢迎和追捧，仍存在两大缺陷：

1、可利用软米资源缺乏与基因型单一，利用常规育种改良效率低。以长三角地区选育的软米品种为例，目前主要都是利用来源日本的关东194的等位变异基因Wx-mp， AC9％左右。利用该种质资源进行软米品种培育，将目标基因导入到优良品种背景中，主要是通过杂交、回交、复交、阶梯杂交等将目标基因导入到背景亲本中。对于质量性状，回交转育是常用的方法，一般需要回交4-6代，加上自交纯合等至少需要3-5代，要改良单个性状并能在生产上发挥作用，至少需要6-8年时间，选育周期长，难以满足市场和老百姓对优质软香米品种的急切需求。如果要挖掘新的软米基因资源，目前主要依靠化学诱变的方法，众所周知，化学突变频率低，前期投入大，筛选获得一个稳定材料就可能需要2-3年，同时化学诱变可能导致野生型材料多个基因突变，应用于生产还需要通过杂交改良，剔除不良基因突变。

2、多数软米粳稻品种稻米外观品质较差。当稻谷水分含量为15％左右时，多数稻米外观呈云雾状，透明度差，俗称半糯或僵米，严重影响其商品性。稻米加工厂通过提高含水量至17％以上可提高稻米的透明度，但是往往造成稻米不耐储藏，甚至霉变。因此，挖掘和利用新的软米基因资源，改变现有软米外观不达标的现状已成为优质育种迫切需要。

基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组及其转录产物进行定点修饰、单碱基编辑、定向敲除或插入目的基因的一种技术。目前，CRISPR/Cas9(CRISPR-associatedprotein 9)介导的基因组编辑技术是其中技术较成熟、发展较迅速、在作物遗传改良中应用较广泛的一种。相对于传统育种，并针对软米育种中存在的缺陷，基因编辑育种有以下几点优势：

1.效率高、周期短。由于粳稻品种农杆菌介导的遗传转化效率较高，我们前期的实验结果表明，10个T

2.可以精准、定向、规模化创制预期的目标基因。常规育种只能从品种资源中筛选具有目标基因的资源，然后通过杂交回交等手段改良现有品种，一般来说，品种资源材料农艺性状较差，因此遗传改良周期更长，而基因组编辑技术可以直接利用农艺性状优良并在生产上大面积推广的水稻品种为背景材料编辑目标基因，目标明确，筛选高效；此外，鉴于目前水稻高效的遗传转化技术，理论上可以在上述背景材料中无限量筛选特定目标基因(如Wx基因)变异中的特定表型(如透明外观)，相比于寻找符合表型条件的自然变异材料或者化学突变材料，此种策略更具可行并且优势明显。以目前江苏省农业科学院构建的抽穗期相关基因多基因编辑体系为例，利用江苏大面积推广的武运粳24、南粳9108为遗传转化背景材料，从中获得了抽穗期60多天、70多天、80多天抽穗的剔除外源标记基因的新材料，相对于野生型，变异类型丰富，抽穗期提早并呈梯度分布，可以扩大优质品种的种植范围，加快优质品种改良进程，极大节约育种成本，凸显了基因编辑分子育种的生命力、创造力。

3.基于CRISPR/Cas9的基因单碱基编辑系统，能进一步实现单碱基编辑。在作物育种与生产中，许多重要的农艺性状是由于单核苷酸多态性或者是显性的功能获得性的点突变引起的，所以简单的基因敲除策略的应用十分有限，单碱基编辑系统的出现能很好解决这个技术难题，同时该策略能避免基因敲除造成的突变蛋白生物学功能丧失导致的极端变异表型，甚至是水稻植株不能正常生长，并最终导致不能应用于育种的情况。单碱基编辑产生的“弱突变”(个别氨基酸替换而非翻译提前终止)不会造成编码蛋白的生物学功能完全丧失，从而不会引起背景材料重要农艺性状的重大改变，将更有利于产生可利用于育种和生产的变异类型。

综上所述，利用基因编辑技术，针对Wx基因第3、4外显子(位于编码的淀粉合成酶核心催化域)设计编辑靶位点进行单碱基编辑，可以高效创制并筛选得到外观透明、直链淀粉含量降低并呈梯度分布的一系列新材料，利用这些材料并明确其具体的基因型可以进一步应用于育种。可以开发相应的基因功能标记，在利用这些材料配制的杂交组合后代中，借助分子标记辅助选择进行基因型选择，对目标性状基因杂合和纯合基因型进行筛选，进而加快目标基因纯合进程。此外，也可以直接利用农艺性状优良并在生产上大面积推广的水稻品种为背景材料对目标基因进行编辑，高效、规模化筛选需要的基因型材料。针对单碱基突变，可以设计酶切靶点标记，但其过程相对繁琐，开发等位基因特异PCR，通过两次PCR就可以区分高和低直链淀粉含量的基因型。

目前，科技人员想获得AC降低至8-12％且外观保持透明的的软米水稻新材料或新基因，需要通过化学或辐射诱变等方式，工作量很大、效果很不理想。同时，采用常规的化学诱变和常规转育育种，其育种年限至少要6-8年，选育周期长，难以满足市场和老百姓对优质软香米品种的急切需求。

同时，并没有相关报道利用基因编辑技术对水稻品种Wx基因进行定点突变创制新的软米等位基因的相关研究。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种水稻Wx突变型蛋白及其核酸或基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞。

本发明还要解决的技术问题是提供了用于鉴定所述的基因或核酸的引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了水稻Wx突变型蛋白、核酸或基因、引物对、所述的表达盒、重组载体或细胞在植物品质改良、品系/品种鉴定、品系/品种创制和/或选育方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种利用基因编辑创制外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的育种方法。本发明首次利用基因编辑技术对水稻品种Wx基因进行单碱基编辑，创制新的软米等位基因，并剔除T-DNA外源序列，获得外观透明、直链淀粉含量适当降低且品质得到改良、能稳定遗传的新材料，一般只需要2年左右时间，相对于化学诱变和常规转育育种，育种年限至少缩短2-6年。因此，基因编辑分子育种具有精准、效率高等常规育种不具备的优势，具有广泛的应用前景。

本发明还要解决的技术问题是提供了鉴定所述的方法获得的植物的方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：水稻Wx突变型蛋白，所述Wx突变型蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于水稻Wx的氨基酸序列的第159位氨基酸发生突变，和/或第178位氨基酸发生突变。

具体的，本发明首次报道了该159位氨基酸由甘氨酸突变为赖氨酸，并具有外观保持透明、直链淀粉含量适当降低等品质改良特性。本发明的第159位氨基酸的突变还可以包括谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸以及终止密码子等19种变异类型。而关于上述的氨基酸的其他变异或提前终止是否影响颗粒淀粉合成酶活性、生理功能以及是否具有品质改良特性，还有待进一步研究证实。

具体的，本发明首次报道了该178位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸，并具有外观保持透明、直链淀粉含量适当降低等品质改良特性。本发明的第178位氨基酸的突变还可以包括甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸以及终止密码子等19种变异类型。而关于上述的氨基酸的其他变异或提前终止是否影响颗粒淀粉合成酶活性、生理功能以及是否具有品质改良特性，还有待进一步研究证实。

本发明所述的水稻Wx突变型蛋白，包括：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有颗粒淀粉合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明内容还包括核酸或基因，其编码所述的突变型蛋白。

其中，所述的核酸或基因，包括：

(a)其编码所述的突变型蛋白；或

(b)在严格条件下与(a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有颗粒淀粉合成酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(c)其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。

本发明内容还包括一种用于鉴定上述的基因或核酸的引物对，所述引物对为Wx1和/或Wx2和/或Wx9和/或Wx10，所述引物对Wx1序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示，所述引物对Wx2序列如SEQ IDNO：20和SEQ ID NO：21所示，所述引物对Wx9序列如SEQ IDNO：20和SEQ ID NO：28所示，所述引物对Wx10序列如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：29所示。

本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的核酸或基因。

本发明内容还包括所述的水稻Wx突变型蛋白、核酸或基因，所述的引物对，所述的表达盒、重组载体或细胞在植物品质改良、品系/品种鉴定、品系品种创制和/或选育方面的应用。

本发明内容还包括获得外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述的核酸或基因；或

2)使植物表达所述的水稻Wx突变型蛋白。

本发明内容还包括一种利用基因编辑创制外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的育种方法，包括以下步骤：

1)Wx基因的克隆及基因编辑的靶位点设计

2)含有目的片段的单碱基编辑载体的构建；

3)具备所述的Wx突变型蛋白、或具备所述的核酸或基因的外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的获得。

4)将目标基因突变的T

5)T-DNA得到剔除的T

其中，所述步骤2)的含有目的片段的单碱基编辑载体的构建方法如下：

A)靶点接头片段制备：接头引物用ddH

B)靶点接头片段连接中间载体：采用pHUE411中间载体、限制性内切酶BsaI进行酶切获得BsaI单酶切的pHUE411载体；采用BsaI单酶切的pHUE411载体、靶点接头片段、T4连接酶进行连接反应并进行大肠杆菌转化，经测序，获得含有靶点接头片段的中间载体质粒。

C)终载体构建：采用pH-nCas9-PBE双元表达载体、限制性内切酶PmeI和AvrII 进行双酶切获得双酶切的pH-nCas9-PBE载体；采用含有靶点接头片段的中间载体、PmeI 和AvrII进行双酶切获得含有靶点接头片段和相应启动子的sgRNA表达盒；采用双酶切的pH-nCas9-PBE载体、sgRNA表达盒、T4连接酶进行连接反应并进行大肠杆菌转化，经测序，获得最终含有目的片段的单碱基编辑载体。

其中，所述步骤3)的外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻获得方法如下：将步骤2)获得的含有目的片段的单碱基编辑载体转入农杆菌EHA105并进行遗传转化，获得T

其中，所述步骤4)的T-DNA片段包括潮霉素磷酸转移酶基因HPT和核酸酶基因nCas9，所述T-DNA片段的剔除，通过对目标基因突变的T

其中，HPT基因检测方法通过以目标基因突变的T

其中，所述步骤5)的目标基因纯合突变植株的获得，是将步骤4)获得的T-DNA 得到剔除的T

本发明内容还包括鉴定所述的方法获得的植物的方法，包括以下步骤：

1)测定所述植物直链淀粉含量是否降低；和/或

2)测定所述植物稻米RVA谱粘滞性指标崩解值是否升高；和/或

3)测定所述植物稻米RVA谱粘滞性指标回复值是否降低；和/或

4)测定所述植物稻米RVA谱粘滞性指标峰值时间是否减小；和/或

5)测定所述植物精米外观是否透明。

有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：

1)本发明首次利用单碱基编辑技术，对Wx基因编码区进行编辑，通过后代的筛选，在T

2)本发明的基因编辑技术育种得到的水稻材料的稻米直链淀粉含量分布在9.8±0.2％～12.9±0.1％之间，相比于野生型的14.4±0.2％，下降了1.5-4.6个百分点，直链淀粉含量降低数值适当，趋势明显，效果显著，能有效改良适口性和食味品质。

3)本发明的基因编辑技术育种得到的水稻材料的稻米崩解值(BDV)分布在943cP～1327cP之间，相比于野生型的862cP，BDV升高数值适当，趋势明显；本发明的基因编辑技术育种得到的水稻材料的稻米回复值(CSV)分布在1010cP～1070cP之间，相比于野生型的1250cP，CSV降低数值适当，趋势明显；本发明的基因编辑技术育种得到的水稻材料的稻米峰值时间(PeT)分布在5.87min～6.13min之间，相比于野生型的 6.2min，PeT减小数值适当，趋势明显。以上述3个指标为代表的稻米RVA谱粘滞性特征优化效果显著，能有效改良蒸煮食味品质。

4)本发明的基因编辑技术育种得到的水稻材料外观透明度好，其精米在含水量为10.1％时，表现同野生型，仍呈现较好的透明状态；而软米对照南粳9108已表现为云雾状，透明度差。

5)本发明根据野生型与突变体在Wx基因第475-476位点的碱基变异，开发了能特异区分野生型(Wx基因475-476位碱基为GG)和突变体(Wx

附图说明

图1基因结构和靶位点示意图。

图2苏垦118背景的T

图3苏垦118背景的T

图4 T

图5直链淀粉含量(AC)测定。

图6RVA各特征值的总体变化及崩解值(BDV)、回复值(CSV)、峰值时间(PeT) 分别和AC之间的相关性分析。

图7精米外观观察。

图8野生型Wx和Wx

图9三维结构预测。A：野生型Wx蛋白；B：突变体Wx

图10功能标记的开发；各个泳道所用DNA模板已在图中标明。泳道M为DNA marker2000，从上至下条带大小分别为2000，1000，750，500，250，100；各泳道对应PCR中所用引物如下：泳道1和7为Wx-1，泳道2和8为Wx-2，泳道3和9为Wx-3，泳道4和10为Wx-4，泳道5和11为Wx-5，泳道6和12为Wx-6，泳道13和19为 Wx-7，泳道14和20为Wx-8，泳道15和21为Wx-9，泳道16和22为Wx-10，泳道 17和23为Wx-11，泳道18和24为Wx-12。

图11Wx1+Wx2和Wx9+Wx10功能标记检测品种；A：PCR所用引物为Wx1；B： PCR所用引物为Wx2；C：PCR所用引物为Wx9；D：PCR所用引物为Wx10。泳道M 为DNA marker 2000，从上至下条带大小分别为2000，1000，750，500，250，100；泳道1～19分别代表苏垦118、118-1-1突变体、118-3-2突变体、118-5-1突变体、118-9-15 突变体、日本晴、南粳9108、黄华占、9311、淮稻5号、常农粳8号、南粳51、连粳7 号、苏秀867、武运粳27号、武运粳29号、徐稻8号、徐稻9号、盐稻16号。

图12金粳818背景T

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明选取的背景材料为苏垦118(购买于江苏苏垦种业有限公司)，该品种是由江苏省农业科学院粮食作物研究所选育的迟熟中粳新品种，全生育期155天左右，适宜江苏省苏中及宁镇扬丘陵地区种植，具有优良的综合农艺性状，已在生产上大面积推广应用，深受市场欢迎。苏垦118株型紧凑，分蘖力较强，叶片淡绿色，群体整齐度好，抗倒性好，成熟期转色好，直链淀粉含量为14％左右，稻米外观透明。本发明通过基于 CRISPR/Cas9的单碱基基因编辑技术对苏垦118的Wx基因进行定点单碱基编辑，获得外观保持透明、直链淀粉含量适当降低呈梯度分布(软米)等外观、蒸煮与食味品质得到改良的多个突变体，以满足市场和老百姓对优质软香米品种迫切需要。

实施例1：遗传转化植物的获得

1、苏垦118 Wx基因克隆及靶位点设计

参考Murray等的CTAB方法，提取苏垦118的基因组DNA(Murray M G，et al.，Nucleic Acids Research，1980，8(19)：4321-4326)。用引物Wx-F： CCCTAGCCACCCAAGAAA(SEQ ID NO：5)，Wx-R：CACCCAGAAGAGTACAACATCA (SEQ ID NO：6)对基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物送往英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。测序结果在NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)数据库进行Blast比对分析，发现苏垦118的Wx基因编码区序列与参考基因组水稻日本晴相同。

根据苏垦118的Wx基因序列，用CRISPR-GE网站(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/) 预测，在第4外显子上设计靶位点wxb#9：CGACTCCACGCTTGTAGCAA(SEQ IDNO：7)，在第5外显子上设计靶位点wxb#24：AAGACCGGTGAGAAGATCTA(SEQ ID NO：8)，两个靶位点在基因上的位置示意如图1。根据前人研究表明(Liu LL，et al.，Plant Mol Biol，2009，71：609-626)，该两个靶位点都位于编码该蛋白的淀粉合成酶核心催化域，各自编辑窗口内的单碱基变异有望形成新的有效突变，获得外观透明、直链淀粉含量不同程度下降的水稻突变体。

2、CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

基因编辑载体构建参考Zong等(Zong Y，et al.，Nat.Biotechnol，2017，35，438-440) 报道方法，按以下步骤进行：

(1)靶点接头制备

根据已设计的靶位点wxb#9和wxb#24序列以及各自反向互补序列，在5’端加接头序列后，4条引物委托南京擎科生物科技有限公司合成，具体序列如下：

wxb#9-F：5’-ggcgCGACTCCACGCTTGTAGCAA-3’(SEQ ID NO：9)；

wxb#9-R：5’-aaacTTGCTACAAGCGTGGAGTCG-3’(SEQ ID NO：10)；

wxb#24-F：5’-ggcgAAGACCGGTGAGAAGATCTA-3’(SEQ ID NO：11)；

wxb#24-R：5’-aaacTAGATCTTCTCACCGGTCTT-3’(SEQ ID NO：12)；

将接头引物wxb#9-F和wxb#9-R用ddH

将接头引物wxb#24-F和wxb#24-R用ddH

(2)靶点接头片段连接中间载体

首先，将中间载体pHUE411(Xing HL et al.，BMC Plant Biol，2014，14，327)用限制性内切酶BsaI进行酶切，所使用的限制性内切酶采购自ThermoFisher，酶切体系如下：

37℃酶切1h后，琼脂糖凝胶电泳并割胶，使用OMEGA DNA回收试剂盒将BsaI 单酶切后载体回收并备用。

其次，采用T4连接酶将上一步自然退火制备得到的靶点接头片段连接进入上述已BsaI单酶切的pHUE411载体中。T4连接酶采购自日本Takara公司，反应体系(10μL) 如下：

短暂离心后将混合体系16℃水浴4h。连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天根)。将1/20的转化细胞均匀涂布在含100mg/L氨苄的LB固体培养基上。37℃培养16h后挑取菌落后，送南京金斯瑞生物科技公司测序。获得的正确插入且测序正确的质粒分别命名为pHUE411-wxb#9-F/R和pHUE411-wxb#24-F/R。

(3)终载体构建

终载体pH-nCas9-PBE为植物双元表达载体，由中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员团队开发(Zong Y，et al.，Nat.Biotechnol，2017，35，438-440)，首先将该载体用限制性内切酶PmeI和AvrII进行双酶切，所使用的限制性内切酶采购自ThermoFisher，酶切体系如下：

37℃酶切1h后，琼脂糖凝胶电泳并割胶，使用OMEGA DNA回收试剂盒将PmeI 和AvrII双酶切后的载体回收并备用。

其次，将上一步得到的pHUE411-wxb#9-F/R和pHUE411-wxb#24-F/R载体分别用限制性内切酶PmeI和AvrII进行双酶切，所使用的限制性内切酶采购自ThermoFisher，酶切体系如下：

37℃酶切1h后，琼脂糖凝胶电泳并割胶，使用OMEGA DNA回收试剂盒将PmeI 和AvrII双酶切后得到OsU3-wxb#9-F/R或OsU3-wxb#24-F/R原件片段的sgRNA表达盒，分别回收并备用。

最后将上述的回收的原件片段，用T4连接酶连接进入PmeI和AvrII双酶切后的pH-nCas9-PBE，T4连接酶采购自日本Takara公司，反应体系(10μL)如下：

短暂离心后将混合体系16℃水浴4h。连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京天根)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后挑取菌落，送南京金斯瑞生物科技公司测序，引物使用测序公共引物M13-F。获得的测序正确的质粒分别命名为pH-nCas9-PBE-wxb#9和 pH-nCas9-PBE-wxb#24。

3、遗传转化植物的获得及基因型鉴定

将上述2个质粒分别转入农杆菌EHA105。采用常规农杆菌介导法转化水稻苏垦118(购买于江苏苏垦种业有限公司)。获得转入pH-nCas9-PBE-wxb#9的阳性T

测序结果表明：转pH-nCas9-PBE-wxb#9的阳性T

转pH-nCas9-PBE-wxb#24的阳性T

实施例2：突变体外源DNA(T-DNA)剔除，基因型再鉴定并筛选纯合植株

本发明构建的定向精准单碱基编辑Wx基因的pH-nCas9-PBE-wxb#9和 pH-nCas9-PBE-wxb#24载体都是双元T-DNA载体，本发明涉及的T-DNA主要包含了潮霉素磷酸转移酶HPT基因和nCas9核酸酶基因，对于水稻基因组而言，此两个基因作为代表的外源DNA需要进行剔除，原因如下：1)潮霉素磷酸转移酶HPT基因主要作用是作为遗传转化过程中的筛选标记，相应编码的潮霉素蛋白是一类抗生素；2)nCas9 基因的主要作用是完成对目标基因靶位点的定点切割，继续保留在植株内可能会引起二次编辑；3)T-DNA随机插入还可能导致非预期的基因突变，不利于性状稳定；4)转基因问题社会敏感度较高，T-DNA剔除材料大众接受程度较高。

通过农杆菌介导转化苏垦118的过程中，T-DNA序列会随机以单拷贝或多拷贝形式插入染色体中，由于水稻是较为严格的自花授粉的同源二倍体植物，同时T-DNA插入位点与其靶位点一般不连锁，因此在技术层面上，可以通过转基因植株自交产生的后代中分离鉴定得到不携带T-DNA的植株，即使连锁也可以通过遗传交换重组筛选到不携带T-DNA的材料。为了获得上述不携带T-DNA的植株，本发明人通过对实施例1 中鉴定得到的B1-68、B2-42、B6-29和B2-21，共计4个株系的T

实施例1中鉴定得到的B1-68株系于培养箱中种植，自交获得T

利用相同方法和步骤进行加代、剔除T-DNA及基因型再鉴定，获得B2-42的T

本发明鉴定到的Wx

同时，本发明首次利用基因编辑技术对水稻品种Wx基因进行单碱基编辑，在2年内获得遗传稳定且剔除T-DNA的新材料，具体为：Wx基因单碱基编辑载体构建及常规粳稻(本实施例中为苏垦118)遗传转化4个月，T

实施例3突变体表型分析

蒸煮与食用品质(Eating and Cooking Quality，ECQ)是影响消费者选择的直接因素，因而是稻米品质构成中最为重要的评价指标。虽然我国出台了国家标准《大米蒸煮食用品质感官评价方法》(GB/T15682-2008)，但由于无法完全排除主观因素的影响，人工品尝的方式仍无法精确鉴定稻米品质。由于淀粉是稻米胚乳的主要组成部分，淀粉的组成与结构是影响稻米ECQ最主要的因素。本实施例利用实施例2中获得的4个T

1、直链淀粉含量测定

前人研究表明AC是决定稻米蒸煮食味品质的重要性状，不仅与米饭的黏性和柔软性有关，还与众多的淀粉理化参数如粘滞性、糊化特性、回生特性密切相关。AC测定具体方法参照参照农业部颁发标准NY147-88进行，4个参比标准样品(AC：1.5％、10.6％、 16.4％和25.6％)购自中国水稻研究所。结果如图5所示，118-1-1为12.9±0.1％，118-3-2 为11.9±0.1％，118-5-1为11.9±0.1％，118-9-15为9.8±0.2％。相比于野生型的14.4±0.2％，基因型相同的118-1-1、118-3-2和118-5-1的AC下降1.5-2.5％，118-9-15的AC下降4.6％。

2、稻米RVA谱粘滞性测定

稻米的RVA谱特征值与稻米的蒸煮食味品质间存在着密切关系，采用快速粘度分析仪(RVA Super 4，NEWPORT SCIENTIFIC，澳大利亚)进行测定，参照美国谷物化学家协会AACC61-01和61-02操作规程进行参数设置。前人研究表明，食味品质好的稻米往往具有较大的崩解值(BDV)，冷饭相对不回生的稻米往往具有较小的回复值 (CSV)，此外，峰值时间PeT是指样品达到峰值黏度所用的时间，一般PeT越小，淀粉粒的膨胀性和破损性越好。结果表1所示，118-1-1、118-3-2、118-5-1和118-9-15的 BDV分别为943cP，946cP，1128cP，1324cP，都显著大于野生型的862cP；118-1-1、 118-3-2、118-5-1和118-9-15的CSV分别为1070cP，1049cP，1067cP，1010cP，都显著小于野生型的1250cP；118-1-1、118-3-2、118-5-1和118-9-15的PeT分别为6.13min，6.07min，6min，5.87min，都显著小于野生型的6.2min。此数据表明，相比于野生型， 4个突变体的食味品质较好，冷饭相对不回生，其淀粉粒在蒸煮过程中的膨胀性和破损性更好。RVA各特征值的总体变化如图6A所示。

上述数据进一步进行相关性分析表明，各样本中BDV与AC表现为极显著负相关，CSV与AC表现为极显著正相关，PeT与AC表现为极显著正相关(图6B)。

表1 RVA谱特征值

3、热力学特性

稻米糊化与蒸煮食味品质有密切关系，糊化温度高的稻米糊化需要更高的蒸煮温度，由DSC仪测定的热力学参数可以精确反映稻米的糊化特性。采用差示热值扫描仪DSC(Q2000，TAInstruments，USA)进行淀粉粒的热力学特性分析。结果如表2所示，各糊化阶段的温度To、Tp在野生型WT中为最大值，Tc在118-1-1中为最大值，To、Tp 和Tc在118-3-2中均为最小值，但是总体差异都不大；糊化焓ΔHgel在118-9-15中最大，在WT中最小，其余差异都不大。以上结果表明，糊化特性在测试样品间存在随机性，118-1-1的糊化温度最大，与RVA仪测定的PaT表现一致。

表2热力学特性

4、精米透明度观察

透明度是衡量稻米外观品质的主要指标之一，本发明利用野生型苏垦118(非软米，透明)和南粳9108(Wx

实施例4共分离及初步功能分析

1、共分离分析

为了验证突变体中AC降低等表型是由于目标基因突变导致的，在遗传上进行共分离分析。利用实施例2中获得的T

结果显示，在118-5-1和93042杂交创制的118个F

在118-9-15和93042杂交创制的131个F

上述结果验证了突变体中AC降低等表型的确是由于目标基因突变导致的。

2、野生型Wx和Wx

如上文所述，水稻Wx基因是控制直链淀粉合成的主效基因，该基因编码颗粒淀粉合成酶。一般而言，Wx酶活性与AC呈正相关关系，AC降低的材料中酶活性相应降低。为了验证这个设想，参照前人的方法进行酶活性检测(Liu DR et al.，Plant Sci，2013，210，141-150)。结果如图8A所示，野生型Wx蛋白酶活性最高，为1011.3±80.3nmol/min/g，突变体蛋白的酶活性显著降低，其中118-1-1、118-3-2和118-5-1中的Wx

上述数据进一步进行相关性分析表明，各样本中Wx酶活性与AC表现为极显著正相关(图8B)。

3、三维结构预测

利用在线网站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)对野生型、Wx

实施例5：Wx突变蛋白及其基因在水稻育种中的应用

1、Wx

分子标记辅助选择有利于加快育种进程。本发明的Wx

经多轮筛选和优化PCR反应条件，如图10所示，发现引物对Wx1和Wx2均具有很好的扩增效率和特异性，可以作为区分野生型、突变体Wx

表3检测突变体基因的分子标记

注：小写字母标出的碱基为错配碱基。

利用Wx1+Wx2、Wx9+Wx10标记检测水稻品种。如图11A-B，发现在检测样品中， 118-1-1、118-3-2和118-5-1不能被Wx1扩增出条带，但是能被Wx2扩增出条带，野生型苏垦118、118-9-15以及其余粳稻或籼稻品种(日本晴、南粳9108、黄华占、9311、淮稻5号、常农粳8号、南粳51、连粳7号、苏秀867、武运粳27号、武运粳29号、徐稻8号、徐稻9号、盐稻16号)能被Wx1扩增出条带，但是不能被Wx2扩增出条带，表明Wx1+Wx2能特异检测出Wx

此外，如图11C-D，118-9-15不能被Wx9扩增出条带，但是能被Wx10扩增出条带，野生型苏垦118、118-1-1、118-3-2、118-5-1以及其余粳稻或籼稻品种能被Wx9扩增出条带，但是不能被Wx10扩增出条带。表明Wx9+Wx10能特异检测出Wx

为了验证Wx1+Wx2、Wx9+Wx10在子标记辅助选择育种中的应用，利用Wx1+Wx2 在实施例4中获得的118-5-1和93042杂交创制的112个F

2、直接利用农艺性状优良水稻品种为背景材料进行转化

金粳818是天津市水稻研究所选育的粳型常规水稻品种，在京津唐粳稻区种植。该品种为AC为16％左右的非软米品种，利用本发明描述的基因编辑的方法可以降低该品种的AC、并在不影响外观品质的前提下改良食味品质。实际所用金粳818来自江苏省农业科学院种质资源平台。

1)所用载体、转化方法和基因型鉴定方法见实施例1。最终获得转入 pH-nCas9-PBE-wxb#9的阳性T

2)突变体T-DNA剔除，纯合加代以及基因型再鉴定方法见实施例2。如图12A-B，筛选获得纯合Wx

3)突变体表型鉴定。AC、RVA谱粘滞性测定及精米透明度观察方法见实施例3。如图12C，野生型AC最大为14.1±0.3％，各个突变体都显著降低，其中818-9-7最低为 7.6±0.1％。如图12D，野生型BDV最小为975cP，各个突变体都显著升高，其中818-9-7 最高为1540cP。如图12E，野生型CSV最大为1295cP，各个突变体都显著降低，其中818-9-7最低为912cP。如图12F，野生型PeT最大为6.27min，各个突变体都显著降低，其中818-9-7最低为5.6min。如图12G所示，在含水量在13.5％时，金粳818精米仍表现为透明，但是南粳9108已表现为云雾状，透明度差；6个突变体表现同金粳818，仍呈现透明状态。

4)酶活性检测方法见实施例4。结果如图12H所示，野生型Wx蛋白酶活性最高，为788.92±16.53nmol/min/g，突变体蛋白的酶活性显著降低，其中818-9-7中的Wx

上述结果表明，在金粳818背景中直接创制Wx

通过上述具体实施例表明，利用基因编辑技术，对Wx基因进行单碱基编辑，通过后代的筛选，在T

表4基因编辑育种方法与传统育种方法的比较

序列表

<110> 江苏省农业科学院、中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 基于基因编辑技术的Wx突变型蛋白及其基因在植物育种中的应用

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1830

<212> DNA

<213> Wx-m1突变型基因(granule-bound starch synthase)

<400> 1

atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240

gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300

ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360

gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420

atcaaggttg cagacaggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtaaagtc 480

gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gaccggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840

aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgca ggaggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440

cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 2

<211> 609

<212> PRT

<213> Wx-m1突变型蛋白(granule-bound starch synthase)

<400> 2

Met Ser Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe

1 5 10 15

Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe

20 25 30

Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu

35 40 45

Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val

50 55 60

Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Tyr Ala Thr Gly

65 70 75 80

Ala Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser

85 90 95

Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met

100 105 110

Ala Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln

115 120 125

Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ala Glu Ile Lys Val Ala

130 135 140

Asp Arg Tyr Glu Arg Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Lys Val

145 150 155 160

Asp Arg Val Phe Ile Asp His Pro Ser Phe Leu Glu Lys Val Trp Gly

165 170 175

Lys Thr Gly Glu Lys Ile Tyr Gly Pro Asp Thr Gly Val Asp Tyr Lys

180 185 190

Asp Asn Gln Met Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala

195 200 205

Pro Arg Ile Leu Asn Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

Gly Glu Asp Val Val Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu

225 230 235 240

Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Ile Tyr Arg Asn

245 250 255

Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe

260 265 270

Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Glu Leu Asn Leu Ser Glu Arg Phe Arg Ser

275 280 285

Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Asp Thr Pro Val Glu Gly Arg Lys

290 295 300

Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly

325 330 335

Cys Glu Leu Asp Asn Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val

340 345 350

Asn Gly Met Asp Val Ser Glu Trp Asp Pro Ser Lys Asp Lys Tyr Ile

355 360 365

Thr Ala Lys Tyr Asp Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ala Lys Ala Leu Asn

370 375 380

Lys Glu Ala Leu Gln Ala Glu Ala Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Ile

385 390 395 400

Pro Leu Ile Ala Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp

405 410 415

Val Met Ala Ala Ala Ile Pro Glu Leu Met Gln Glu Asp Val Gln Ile

420 425 430

Val Leu Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ser

435 440 445

Met Glu Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn

450 455 460

Ala Pro Leu Ala His Leu Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val

465 470 475 480

Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg

485 490 495

Tyr Gly Thr Pro Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr

500 505 510

Val Ile Glu Gly Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp

515 520 525

Cys Lys Val Val Glu Pro Ser Asp Val Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu

530 535 540

Lys Arg Ala Ile Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val

545 550 555 560

Arg Asn Cys Met Asn Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn

565 570 575

Trp Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Val Ala Gly Ser Ala Pro Gly

580 585 590

Ile Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala

595 600 605

Pro

<210> 3

<211> 1830

<212> DNA

<213> Wx-m2突变型基因(granule-bound starch synthase)

<400> 3

atgtcggctc tcaccacgtc ccagctcgcc acctcggcca ccggcttcgg catcgccgac 60

aggtcggcgc cgtcgtcgct gctccgccac gggttccagg gcctcaagcc ccgcagcccc 120

gccggcggcg acgcgacgtc gctcagcgtg acgaccagcg cgcgcgcgac gcccaagcag 180

cagcggtcgg tgcagcgtgg cagccggagg ttcccctccg tcgtcgtgta cgccaccggc 240

gccggcatga acgtcgtgtt cgtcggcgcc gagatggccc cctggagcaa gaccggcggc 300

ctcggtgacg tcctcggtgg cctcccccct gccatggctg cgaatggcca cagggtcatg 360

gtgatctctc ctcggtacga ccagtacaag gacgcttggg ataccagcgt tgtggctgag 420

atcaaggttg cagacaggta cgagagggtg aggtttttcc attgctacaa gcgtggagtc 480

gaccgtgtgt tcatcgacca tccgtcattc ctggagaagg tttggggaaa gattggtgag 540

aagatctacg gacctgacac tggagttgat tacaaagaca accagatgcg tttcagcctt 600

ctttgccagg cagcactcga ggctcctagg atcctaaacc tcaacaacaa cccatacttc 660

aaaggaactt atggtgagga tgttgtgttc gtctgcaacg actggcacac tggcccactg 720

gcgagctacc tgaagaacaa ctaccagccc aatggcatct acaggaatgc aaaggttgct 780

ttctgcatcc acaacatctc ctaccagggc cgtttcgctt tcgaggatta ccctgagctg 840

aacctctccg agaggttcag gtcatccttc gatttcatcg acgggtatga cacgccggtg 900

gagggcagga agatcaactg gatgaaggcc ggaatcctgg aagccgacag ggtgctcacc 960

gtgagcccgt actacgccga ggagctcatc tccggcatcg ccaggggatg cgagctcgac 1020

aacatcatgc ggctcaccgg catcaccggc atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg 1080

gatcctagca aggacaagta catcaccgcc aagtacgacg caaccacggc aatcgaggcg 1140

aaggcgctga acaaggaggc gttgcaggcg gaggcgggtc ttccggtcga caggaaaatc 1200

ccactgatcg cgttcatcgg caggctggag gaacagaagg gccctgacgt catggccgcc 1260

gccatcccgg agctcatgca ggaggacgtc cagatcgttc ttctgggtac tggaaagaag 1320

aagttcgaga agctgctcaa gagcatggag gagaagtatc cgggcaaggt gagggccgtg 1380

gtgaagttca acgcgccgct tgctcatctc atcatggccg gagccgacgt gctcgccgtc 1440

cccagccgct tcgagccctg tggactcatc cagctgcagg ggatgagata cggaacgccc 1500

tgtgcttgcg cgtccaccgg tgggctcgtg gacacggtca tcgaaggcaa gactggtttc 1560

cacatgggcc gtctcagcgt cgactgcaag gtggtggagc caagcgacgt gaagaaggtg 1620

gcggccaccc tgaagcgcgc catcaaggtc gtcggcacgc cggcgtacga ggagatggtc 1680

aggaactgca tgaaccagga cctctcctgg aaggggcctg cgaagaactg ggagaatgtg 1740

ctcctgggcc tgggcgtcgc cggcagcgcg ccggggatcg aaggcgacga gatcgcgccg 1800

ctcgccaagg agaacgtggc tgctccttga 1830

<210> 4

<211> 609

<212> PRT

<213> Wx-m2突变型蛋白(granule-bound starch synthase)

<400> 4

Met Ser Ala Leu Thr Thr Ser Gln Leu Ala Thr Ser Ala Thr Gly Phe

1 5 10 15

Gly Ile Ala Asp Arg Ser Ala Pro Ser Ser Leu Leu Arg His Gly Phe

20 25 30

Gln Gly Leu Lys Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gly Asp Ala Thr Ser Leu

35 40 45

Ser Val Thr Thr Ser Ala Arg Ala Thr Pro Lys Gln Gln Arg Ser Val

50 55 60

Gln Arg Gly Ser Arg Arg Phe Pro Ser Val Val Val Tyr Ala Thr Gly

65 70 75 80

Ala Gly Met Asn Val Val Phe Val Gly Ala Glu Met Ala Pro Trp Ser

85 90 95

Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Leu Gly Gly Leu Pro Pro Ala Met

100 105 110

Ala Ala Asn Gly His Arg Val Met Val Ile Ser Pro Arg Tyr Asp Gln

115 120 125

Tyr Lys Asp Ala Trp Asp Thr Ser Val Val Ala Glu Ile Lys Val Ala

130 135 140

Asp Arg Tyr Glu Arg Val Arg Phe Phe His Cys Tyr Lys Arg Gly Val

145 150 155 160

Asp Arg Val Phe Ile Asp His Pro Ser Phe Leu Glu Lys Val Trp Gly

165 170 175

Lys Ile Gly Glu Lys Ile Tyr Gly Pro Asp Thr Gly Val Asp Tyr Lys

180 185 190

Asp Asn Gln Met Arg Phe Ser Leu Leu Cys Gln Ala Ala Leu Glu Ala

195 200 205

Pro Arg Ile Leu Asn Leu Asn Asn Asn Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Tyr

210 215 220

Gly Glu Asp Val Val Phe Val Cys Asn Asp Trp His Thr Gly Pro Leu

225 230 235 240

Ala Ser Tyr Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Ile Tyr Arg Asn

245 250 255

Ala Lys Val Ala Phe Cys Ile His Asn Ile Ser Tyr Gln Gly Arg Phe

260 265 270

Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Glu Leu Asn Leu Ser Glu Arg Phe Arg Ser

275 280 285

Ser Phe Asp Phe Ile Asp Gly Tyr Asp Thr Pro Val Glu Gly Arg Lys

290 295 300

Ile Asn Trp Met Lys Ala Gly Ile Leu Glu Ala Asp Arg Val Leu Thr

305 310 315 320

Val Ser Pro Tyr Tyr Ala Glu Glu Leu Ile Ser Gly Ile Ala Arg Gly

325 330 335

Cys Glu Leu Asp Asn Ile Met Arg Leu Thr Gly Ile Thr Gly Ile Val

340 345 350

Asn Gly Met Asp Val Ser Glu Trp Asp Pro Ser Lys Asp Lys Tyr Ile

355 360 365

Thr Ala Lys Tyr Asp Ala Thr Thr Ala Ile Glu Ala Lys Ala Leu Asn

370 375 380

Lys Glu Ala Leu Gln Ala Glu Ala Gly Leu Pro Val Asp Arg Lys Ile

385 390 395 400

Pro Leu Ile Ala Phe Ile Gly Arg Leu Glu Glu Gln Lys Gly Pro Asp

405 410 415

Val Met Ala Ala Ala Ile Pro Glu Leu Met Gln Glu Asp Val Gln Ile

420 425 430

Val Leu Leu Gly Thr Gly Lys Lys Lys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Ser

435 440 445

Met Glu Glu Lys Tyr Pro Gly Lys Val Arg Ala Val Val Lys Phe Asn

450 455 460

Ala Pro Leu Ala His Leu Ile Met Ala Gly Ala Asp Val Leu Ala Val

465 470 475 480

Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ile Gln Leu Gln Gly Met Arg

485 490 495

Tyr Gly Thr Pro Cys Ala Cys Ala Ser Thr Gly Gly Leu Val Asp Thr

500 505 510

Val Ile Glu Gly Lys Thr Gly Phe His Met Gly Arg Leu Ser Val Asp

515 520 525

Cys Lys Val Val Glu Pro Ser Asp Val Lys Lys Val Ala Ala Thr Leu

530 535 540

Lys Arg Ala Ile Lys Val Val Gly Thr Pro Ala Tyr Glu Glu Met Val

545 550 555 560

Arg Asn Cys Met Asn Gln Asp Leu Ser Trp Lys Gly Pro Ala Lys Asn

565 570 575

Trp Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Gly Val Ala Gly Ser Ala Pro Gly

580 585 590

Ile Glu Gly Asp Glu Ile Ala Pro Leu Ala Lys Glu Asn Val Ala Ala

595 600 605

Pro

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Wx-F(Artificial Sequence)

<400> 5

ccctagccac ccaagaaa 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Wx-F(Artificial Sequence)

<400> 6

cacccagaag agtacaacat ca 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> wxb#9(Artificial Sequence)

<400> 7

cgactccacg cttgtagcaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> wxb#24(Artificial Sequence)

<400> 8

aagaccggtg agaagatcta 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> wxb#9-F(Artificial Sequence)

<400> 9

ggcgcgactc cacgcttgta gcaa 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> wxb#9-R(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacttgcta caagcgtgga gtcg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> wxb#24-F(Artificial Sequence)

<400> 11

ggcgaagacc ggtgagaaga tcta 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> wxb#24-R(Artificial Sequence)

<400> 12

aaactagatc ttctcaccgg tctt 24

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<212> DNA

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caagcagcag cggtcgg 17

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<212> DNA

<213> Wxb-PCR-R(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgaagtatg ggttgttgtt gagg 24

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<212> DNA

<213> hyg283-F(Artificial Sequence)

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tccggaagtg cttgacatt 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> hyg283-R(Artificial Sequence)

<400> 16

gtcgtccatc acagtttgc 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> nCas9-F(Artificial Sequence)

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cggctacgct gggtacatc 19

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<212> DNA

<213> nCas9-R(Artificial Sequence)

<400> 18

ttctcgttgg gcaggttctt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Wx-1F(Artificial Sequence)

<400> 19

ttccattgct acaagcgtgg 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Wx-1R(Artificial Sequence)

<400> 20

tcatcatgga ttccttcgaa g 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Wx-2F(Artificial Sequence)

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ttccattgct acaagcgtaa 20

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<212> DNA

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ttccattgct acaagcgggg 20

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<212> DNA

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ttccattgct acaagcggaa 20

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ttccattgct acaagcgcgg 20

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ttccattgct acaagcgcaa 20

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atttcaggtt tggggaaaga cc 22

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atttcaggtt tggggaaaga tt 22

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atttcaggtt tggggaaagg cc 22

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<211> 22

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<400> 29

atttcaggtt tggggaaagg tt 22

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atttcaggtt tggggaaagc cc 22

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<400> 31

atttcaggtt tggggaaagc tt 22