基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器及检测方法

摘要

本发明公开了基于ARGET‑ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器及检测方法，该传感器主要由以下原料制备而成：羧基化Fe

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器及检测方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

赭曲霉毒素A(OTA)是毒性最大的食源性真菌毒素之一，是已知的赭曲霉毒素中含量最高、分布最广、毒性最强的，被国际癌症研究机构定位为2B类致癌物质。OTA广泛存在于农作物、饲料及多种药用植物中，具有肾脏毒性、肠道毒性、免疫抑制以及致癌致畸致突变等危害，可导致人类和动物的多种肾脏、肝脏和脑部疾病等。因此检测OTA对提高产业质量和维护人类健康具有重要意义。

目前，开发出了多种检测OTA的方法，包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和生物传感法等。其中生物传感法因其灵敏度高、响应速度快、成本低、操作简单等优点，已广泛应用于食品药物分析、环境监测、生命科学等领域。

本发明以电子转移活化再生催化剂原子转移自由基聚合(ARGET-ATRP)作为信号放大策略，其是一种活性/可控自由基技术，可在一个活性位点上聚合大量的荧光素单体从而有效地提高传感器的灵敏度，且具有催化剂用量少、提高化合物对氧气的耐受性、反应条件温和等优点，受到研究者的广泛青睐。本发明旨在研发基于ARGET-ATRP信号放大策略高灵敏检测OTA的生物传感器，使其具有灵敏度高、选择性好、操作简单，成本低廉等特点，可用于痕量检测OTA。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器及检测方法，该传感器具有灵敏度高、选择性好、操作简便、成本低、环境友好等优点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器，主要由以下原料制备而成：羧基化Fe

进一步，

Apt序列：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACACGCCACCCACACA-3’；

cDNA序列：5’-CCTTTACGCCACCCACACCCGATC-3’。

本发明的技术方案之一是：一种基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)羧基磁珠的修饰

①活化羧基磁珠：将羧基化Fe

②磁珠的修饰：在步骤①的磁珠中加入Apt溶液和PBS缓冲液，混合均匀，反应；

③活化BPAA羧基：将BPAA溶液、EDC溶液和NHS溶液混合均匀，反应；

④cDNA的修饰：将cDNA溶液加入到步骤③的反应液中，反应；

⑤cDNA的固定：将步骤②的磁珠分离、清洗，加入到步骤④的反应液中，反应；反应结束后，将磁珠分离、清洗；

(2)ARGET-ATRP反应

依次向步骤⑤的磁珠中加入CuBr

进一步，EDC溶液浓度为200mM，NHS溶液浓度为50mM，BPAA溶液浓度为10mM，cDNA溶液浓度为1μm/mL，Apt溶液浓度为1μm/mL，FA溶液浓度为20mM，CuBr

进一步，步骤(1)③④中BPAA溶液、EDC溶液、NHS溶液和cDNA溶液的体积比为2:1:1:1；步骤(2)中CuBr

进一步，步骤(1)中：①②③④⑤反应温度均为35～40℃，①②③④反应时间均为1.0～1.5h，⑤反应时间为0.5～1.0h；步骤(2)反应温度为35～40℃，反应时间为80～100min。

进一步，步骤(1)中①⑤清洗为用PBS缓冲液洗涤，重复两次；步骤(2)中清洗步骤为先用DMSO洗涤，重复两次，再用PBS缓冲液洗涤磁珠，重复两次。

进一步，羧基化Fe

本发明的技术方案之一是：一种以ARGET-ATRP为信号放大策略检测赭曲霉毒素A的方法，包括以下步骤：

(1)第一次荧光检测

将权利要求1所得磁珠进行荧光响应值测量；

(2)加入赭曲霉毒素A

将待检测样品溶液和含有Tris-HCl、NaCl、CaCl

(3)第二次荧光检测

将步骤(2)中所得磁珠进行第二次荧光响应值测量；将第二次荧光信号强度减去第一次荧光信号强度，计算赭曲霉毒素A浓度。

进一步，步骤(2)反应温度为35～40℃，反应时间为1.0～1.5h。

本发明的技术方案之一是：一种上述生物传感器在检测赭曲霉毒素A中的应用。

本发明检测原理示意图如图1所示。

本发明的有益效果：

1、本发明使用ARGET-ATRP作为信号放大策略，避免了纳米材料和生物酶(易受外界环境如pH和温度影响)的使用，与传统ATRP反应相比，该反应可用单体广泛，反应条件温和，能够减少重金属离子催化剂的使用。并且使用的具有商业化的引发剂，方便易得。

2、本发明通过酰胺反应将Apt序列固定在羧基化磁珠表面。同时，BPAA通过酰胺反应与cDNA连接。然后，通过碱基互补配对使Apt与cDNA进行结合。随后，发生ARGET-ATRP反应，使大量的FA单体接枝在BPAA活性位点上聚合，从而显著放大了荧光信号。最后，目标物OTA与cDNA竞争Apt，使带荧光信号的cDNA脱落。除此之外，猝灭竞争型荧光生物传感器可以极大地避免非特异性吸附造成的假阳性结果。在优化条件下，所构建的传感器检测限可低至7.6fg/mL。

3、本发明对OTA检测具有高度选择性，适合于在复杂药用植物样本基质中进行检测。同时具有灵敏度高、操作简便、成本低、环境友好等优点，有望应用于中药中其它真菌毒素污染的检测。

附图说明

图1为本发明检测原理示意图。

图2为本发明传感器的可行性研究。

图3为荧光共聚焦表征。A为不加OTA，B为加入OTA。

图4为扫描电子显微镜表征。A为不加OTA，B为加入OTA。

图5为条件优化研究。A为FA单体浓度的优化，B为ARGET-ATRP反应时间的优化。

图6为分析性能研究。

图7为选择性研究。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

适配体序列和cDNA序列购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

适配体序列：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACACGCCACCCACACA-3’(SEQ ID NO.1)。

cDNA序列：5’-CCTTTACGCCACCCACACCCGATC-3’(SEQ ID NO.2)。

羧基化Fe

实施例1：基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器

基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器，主要由以下原料制备而成：羧基化Fe

其制备方法为：

(1)羧基磁珠的修饰

①羧基磁珠预处理：首先吸取20μL羧基化Fe

②活化羧基磁珠：向步骤①中的离心管中加入10μLEDC溶液、10μLNHS溶液和160μLPBS缓冲液，37℃反应1.0h；反应结束后，将离心管置于磁力架上分离MBs，加入200μLPBS缓冲液充分洗涤，将离心管置于磁力架上分离MBs，重复以上步骤2次；

③磁珠的修饰：在步骤②的MBs中加入10μL Apt溶液和90μLPBS缓冲液，混合均匀，在37℃恒温摇床中反应1.0h；

④活化BPAA羧基：另取离心管加入20μLBPAA溶液、10μL EDC溶液、10μLNHS溶液，在37℃恒温摇床中反应1.0h；

⑤cDNA的修饰：将10μL cDNA溶液加入到步骤④的反应液中，在37℃恒温摇床中反应1.0h；

⑥cDNA的固定：将步骤③的离心管置于磁力架上分离MBs，加入200μL PBS缓冲液充分洗涤，将离心管置于磁力架上分离MBs，重复以上步骤2次；将分离的MBs加入到步骤⑤的反应液中，在37℃恒温摇床中反应0.5h；反应结束后，将离心管置于磁力架上分离MBs，加入200μL PBS缓冲液充分洗涤，将离心管置于磁力架上分离MBs，重复以上步骤2次；

(2)ARGET-ATRP反应

依次向步骤⑥的MBs中加入20μL CuBr

其中，EDC溶液浓度为200mM，NHS溶液浓度为50mM，BPAA溶液浓度为10mM，cDNA溶液浓度为1μm/mL，Apt溶液浓度为1μm/mL，FA溶液浓度为20mM，CuBr

实施例2：以ARGET-ATRP为信号放大策略检测赭曲霉毒素A的方法

(1)第一次荧光检测

上述实施例1所制得的MBs，用PBS缓冲液稀释至3mL，在489nm的激发波长(Ex)和2nm的狭缝宽度条件下，用瞬态/稳态荧光分光光度仪检测荧光信号F

(2)加入赭曲霉毒素A

收集上述稀释液中的MBs，加入10μL待检测样品溶液和90μL含有Tris-HCl、NaCl、CaCl

(3)第二次荧光检测

将上述MBs分离后，用200μL PBS缓冲液充分洗涤，置于磁力架上分离，重复洗涤步骤2次。然后，将其用PBS缓冲液稀释至3mL，在激发波长(Ex)为489nm和狭缝宽度为2nm的条件下，用瞬态/稳态荧光分光光度仪检测荧光信号F

实施例3：可行性验证

为了研究以ARGET-ATRP作为信号放大策略高灵敏荧光检测OTA的可行性，本发明比较了不同修饰条件下MBs的荧光强度。结果如图2所示，Apt/cDNA/BPAA/FA修饰后的MBs在489nm处观察到一个强烈的荧光信号峰(曲线d)，Apt/cDNA/BPAA/FA/OTA修饰后的MBs在489nm处有荧光猝灭(曲线f)。而在没有Apt(曲线a)、cDNA(曲线b)、BPAA(曲线c)、FA(曲线e)修饰时，只能检测到一个非常微弱的荧光信号。这是因为没有Apt、cDNA修饰时，ARGET-ATRP反应产生的聚合物无法连接到MBs上；缺少引发剂BPAA或单体FA修饰时，聚合无法启动，无法在MBs上接枝聚合物。而没有OTA修饰时，反应体系缺少竞争物无法产生荧光猝灭信号。以上结果表明，该传感器用于检测OTA是可行的。

实施例4：荧光共聚焦和扫描电子显微镜表征

本研究使用荧光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜对OTA修饰后的MBs进行了表征。首先进行了荧光共聚焦表征。如图3A所示，当MBs上没有OTA修饰时，荧光共聚焦图可以观察到明显的绿色荧光亮点，说明此时大量FA单体被聚合在MBs表面。相反，在图3B中，经OTA修饰后的MBs，其荧光共聚焦图像上只有少量的绿色荧光亮点，说明此时OTA参与了竞争，使带有大量FA单体的cDNA片段脱落。其次进行了扫描电子显微镜表征。如图4A～B所示，当没有修饰OTA时，FA单体聚合物不能被竞争掉，因此，MBs的表面是比较粗糙的。相反，当修饰上OTA后，OTA与cDNA竞争Apt，使带有荧光分子的cDNA脱落，MBs的表面变得相对平滑。荧光共聚焦和扫描电子显微镜的结果证明了OTA可以竞争cDNA片段，与Apt进行特异性结合实现对OTA的检测，说明该传感器用于检测OTA是成功的。

实施例5：实验条件优化

为了使该传感器的分析性能达到最佳，本研究对传感器构建过程中影响荧光强度的几个关键参数进行了优化，包括FA单体浓度与ARGET-ATRP的反应时间。

首先研究了ARGET-ATRP反应中单体FA的浓度对传感器荧光强度的影响。图5A显示，在FA浓度为5～20mM范围内，随着FA浓度的增加，荧光信号逐渐增大，当浓度达到20mM时，传感器的荧光强度达到最大值，继续增加FA浓度荧光强度基本保持不变。这说明，FA单体在MBs表面的聚合密度与传感器的信号放大密切相关。因此，FA的最佳浓度为20mM。

其次研究了ARGET-ATRP的反应时间对传感器荧光强度的影响。图5B显示，在20～120min范围时，荧光强度随着ARGET-ATRP反应时间的增加而不断增大，当反应时间为80min时，荧光强度达到最大，且随着时间的延长，荧光强度未发生明显变化。这说明，此时ARGET-ATRP反应已达到最佳状态。因此，ARGET-ATRP反应的最佳时间为80min。

实施例6：分析性能

为了研究本发明检测OTA的性能，在最佳条件下，对一系列不同浓度的OTA进行检测。如图6所示，OTA的浓度范围为2.00×10

如表1所示，与现有几种检测OTA的方法对比，本发明具有更广泛的检测范围和更低的LOD。

表1

实施例7：选择性实验

为了验证本发明的选择性，在相同条件下，研究了20ng/mL OTA与黄曲霉毒素B

实施例8：重现性及稳定性研究

通过批内和批间实验对本发明的重现性进行了研究。批内和批间(n＝5)的荧光信号强度的变异系数分别为1.8％和4.3％。结果表明，本发明建立的OTA检测方法具有良好的重现性。

为了评估所构建的磁珠的稳定性，本发明进行了储存实验。具体来说，在相同条件下制备了两组修饰磁珠(n＝5)，一组在制备后立即进行荧光测量，另一组在4℃环境中存储两周后进行测量，比较两组荧光强度的平均值。结果显示，存储两周后的修饰磁珠与新制备的磁珠相比仍可以保留高达96.0％的荧光信号。表明本发明所构建的传感器具有良好的稳定性。

实施例9：中药样品中OTA的检测

为了进一步评估该传感器在中药样品分析中的准确性和潜在的应用能力，将三种不同浓度的OTA标准品(20ng/mL、2.0ng/mL、0.2ng/mL)加入到四种中药样品(连翘、黄芪、甘草、苍耳子)中进行荧光检测，计算出回收率并对其进行分析。结果如表2所示，该方法在实际样品中的回收率为93.19～108.39％；这些结果表明，该传感器可用于中药样品中OTA的检测，能够用于评估中药中霉菌毒素的暴露水平。

表2

序列表

<110> 河南中医药大学

<120> 基于ARGET-ATRP信号放大策略的猝灭竞争型荧光生物传感器及检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggacacgcc acccacaca 49

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctttacgcc acccacaccc gatc 24