一种同步快速测定尿液中总砷及砷代谢产物含量的方法

摘要

本发明属于毒害有机污染物分析技术领域，公开了一种同步快速测定尿液中总砷及砷代谢产物含量的方法。本发明使用ICP‑MS快速测定人体尿液样品的总砷，快速切换到HPLC‑ICP‑MS进行尿液中砷甜菜碱、三价无机砷、二甲基胂酸、单甲基胂酸和五价无机砷分离和定量分析这五种代谢产物的方法，步骤包括尿液总砷样品的前处理、尿液砷形态样品的前处理、在线分离、定量标准曲线的制备和实际样本检测。本发明可应用到职业暴露于高砷物质的人群尿液样品的分析，当尿液样本的总砷超过预设警戒线时能够快速制备尿砷形态样品并实现准确定量，从而获得砷超标样本中有毒有害的砷代谢产物的各种形态组合和含量，提供暴露人群个体内砷的代谢阶段数据。

说明书

技术领域

本发明属于毒害有机污染物分析技术领域，特别涉及一种同步快速测定尿液中总砷及砷代谢产物含量的方法。

背景技术

砷的意外暴露或长期职业暴露，会造成砷在体内蓄积并产生中毒的现象。砷的毒性作用取决于其化合形态，如无机砷毒性高于有机砷，低价氧化态砷(As

目前，国际上多使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对低浓度的金属进行分析，因其低检出限和高灵敏度和可测试几乎全部金属的优点。而我国目前颁布的关于尿砷以及尿砷形态分析标准，均使用原子荧光法，然而该方法中涉及到氧化还原反应、氢化反应等，均不是直接分析试样中砷类物质的方法，并且使用原子荧光法测定尿砷时，需要将尿样完全消解，才能发生氢化反应，这过程可能会出现误差。而使用ICP-MS法可以直接对砷元素进行分析，尿液无需完全消解，对结果无影响。更进一步使用高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用(HPLC-ICP-MS)，可以直接分析色谱分离的各砷形态物质，结果更加直观也相对更准确，然而，AsB和As

由此，建立ICP-MS法测定尿总砷及HPLC-ICP-MS法测定尿砷形态非常有必要，本发明可实现人群尿液总砷的快速筛查，及进一步分析尿液中AsB,As

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种同步快速测定尿液中总砷与砷代谢产物含量的方法；该方法能在测定尿总砷后快速制备样品进一步分析尿液中AsB、As

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种同步快速测定尿液中总砷及砷代谢产物含量的方法，包括以下操作步骤：

S1.用硝酸稀释砷标准品，制备含梯度浓度的砷离子标准溶液，采用ICP-MS(电感耦合等离子体质谱法)检测，以浓度为x，信号强度为y，同时以基质溶液作为空白，制得总砷标准曲线；所述基质溶液为HNO

使用尿液基质溶液分别配制含梯度浓度的砷甜菜碱(AsB)标准溶液、三价无机砷(As

S2.取尿液样品于聚丙烯离心管中，加入硝酸，在水浴中超声，过滤后制得尿总砷待测样品；同时，取尿液样品于聚丙烯离心管中，使用样品稀释液将尿液样品稀释混匀，过滤后转移至聚丙烯液相样品瓶中，制得尿砷形态代谢物待测样品；

S3.采用ICP-MS分析步骤S2所得尿总砷待测样品，根据步骤S1所得总砷标准曲线，计算尿总砷待测样品中总砷的含量；

S4.当尿总砷待测样品中总砷的含量超过预警线时，立即切换至HPLC-ICP-MS分析模式，采用阴离子交换色谱柱对步骤S2所得尿砷形态代谢物待测样品中的砷形态代谢物进行色谱分离，然后采用HPLC-ICP-MS分析对色谱分离后的砷形态代谢物进行检测，根据色谱峰保留时间与标准品的对照来区分不同的砷形态代谢物，并根据步骤S1所得尿砷形态代谢物标准曲线，对检测得到的色谱峰面积进行浓度的计算，得到尿砷形态代谢物待测样品中砷形态代谢物的浓度。

步骤S1中所述硝酸的浓度为体积百分数1～2％；所述调节pH值是采用NaOH进行调节。

步骤S1中所述人工尿液为市售人工合成尿液，含有氯化钠、氯化镁、氯化钙、硫酸钠、柠檬酸钠、草酸钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化铵、尿素等，pH为5.7，金属本底低。

步骤S2中所述总砷标准曲线为：y＝1470.9x-11.328，R

所述砷甜菜碱标准曲线为：y

所述三价无机砷标准曲线为：y

所述二甲基砷标准曲线为：y

所述单甲基胂酸标准曲线为：y

所述五价无机砷的标准曲线为：y

步骤S2中所述的尿液样品在使用之前是新鲜采集的人尿液样品或者是将-80℃至4℃下存储于聚丙烯冻存管中的人尿液样品取出冷冻环境，在室温下解冻，用混匀仪震荡混匀后待用。

步骤S2中所述的在水浴中超声的温度为20～50℃，时间为5～60分钟；所述样品稀释液为pH值7.8～11.0、浓度12.5～34.0mM的(NH

步骤S3中所述ICP-MS分析的模式为氦气碰撞模式，分析的条件为：选择As

步骤S4中所述阴离子交换色谱柱为小于或等于10μm的阴离子交换色谱柱，柱温10～40℃，进样量10～100μL；所述色谱分离的条件为：流动相A为超纯水，流动相B为10～30mM(NH

步骤S4中所述HPLC-ICP-MS分析是选择As

步骤S4中所述超过预警线是指尿总砷待测样品中总砷的含量超过0.032mg/L(参考WS/T 665-2019《人群尿砷安全指导值》)；所述切换至HPLC-ICP-MS分析模式，具体操作是在仪器控制软件上把进样器从雾化器改为LC，硬件上将ICP-MS样品管从雾化器中拔出，接上色谱柱出口端，连接高效液相色谱模块至电感耦合等离子体质谱仪。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过ICP-MS分析尿液中总砷含量，前处理过程简单快速，分析方法稳定性和准确性高。

(2)本发明通过HPLC-ICP-MS法分析尿液砷形态，与液相色谱-原子荧光法相比，可以对通过色谱分离的全部砷形态物质进行检测，而无需与硼氢化钾反应生成气态砷化合物(原子荧光作为检测器时，目标化合物需要转化为气态，而部分砷形态是无法反应生成气态氢化物)，因此，使用HPLC-ICP-MS可以分析出更多种类的砷形态化合物。

(3)本方法可快速定量尿液中总砷浓度后进一步分析尿砷中不同形态代谢产物的浓度从而了解砷的不同代谢阶段，所使用的HPLC-ICP-MS仪器灵敏度高，且方法简易、快速，定量结果准确。

(4)本发明可应用于职业暴露于砷的人群尿液样品的分析，获得样本中有毒有害的砷代谢产物的各种形态组分和含量，得到砷在体内的代谢阶段，为环境污染物暴露和砷摄入后个体防护提供科学依据。

附图说明

图1为AsB，As

图2为实施例2中100例高暴露组尿砷形态定量分析及五种砷形态物质加和与总砷分析结果对比。

图3为高、中、低暴露(对照)组的砷形态浓度水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

本实施例提供的一种同步快速分析尿液中总砷及五种砷代谢产物含量的方法和应用，包括如下步骤：

S1.制备标准溶液，具体如下：

尿液总砷分析用1％(v/v)HNO

使用人工尿液(市售人工合成尿液，含有氯化钠、氯化镁、氯化钙、硫酸钠、柠檬酸钠、草酸钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化铵、尿素等，pH为5.7，金属本底低)与pH＝8.0的30mM(NH

AsB、As

AsB：y

As

DMA

MMA

As

S2.制备样品，具体如下：

以下尿液样品在使用之前是新鲜采集的人尿液样品或者是将-80℃至4℃下存储于聚丙烯冻存管中的尿液样品取出冷冻环境，在室温下解冻，用混匀仪震荡混匀后待用。

(1)将尿液样品加至离心管中，混匀后取0.5mL尿液样品至聚丙烯离心管，加入4.5mL的1.2％(v/v)HNO

(2)同时取未处理的尿液样品200μL至聚丙烯离心管中，加入800μL的样品稀释液(pH＝8.0，30mM(NH

S3.ICP-MS分析条件

采用ICP-MS分析上述S2所得尿总砷待测样品，根据步骤S1所得总砷标准曲线，计算尿总砷待测样品中总砷的含量；

ICP-MS开机前使用5.0mL/min氦气吹扫碰撞反应池30-60分钟，开机需调谐矩管位置、透镜、分辨率/质量轴，性能报告需要满足仪器检测灵敏度，其中，调谐质量数89的响应大于6000，检测模式为氦气模式。

选择As

S4.HPLC-ICP-MS分析条件

当尿总砷待测样品中总砷的含量超过预警线时，立即切换至HPLC联用模式，采用阴离子交换色谱柱对步骤S2所得尿砷形态代谢物待测样品中的砷形态代谢物进行色谱分离，然后采用HPLC-ICP-MS分析对色谱分离后的砷形态代谢物进行检测，根据色谱峰保留时间与标准品的对照来区分不同的砷形态代谢物，并根据步骤S1所得尿砷形态代谢物标准曲线，对检测得到的色谱峰面积进行浓度的计算，得到尿砷形态代谢物待测样品中砷形态代谢物的浓度。

上述切换至HPLC-ICP-MS分析模式，具体是把进样器从雾化器改为LC，将ICP-MS样品管从雾化器中拔出，接上色谱柱出口端，将样品引入改为LC，更新模块后打开HPLC联用批处理(用预设美国EPA 6020方法)，将采集模式改为TRA，选择As和Cl为待测元素，设置采集时间为12min，调谐参数蠕动泵转速改为0.3rps，雾化器改成0.85L/min，补偿气体改为0.15L/min，碰撞池的He气流量改成4.0mL/min调谐时质量数59的响应大于2000，156/140低于1％。

高效液相色谱分离条件：阴离子交换色谱柱：汉密尔顿PRP-X100(250mm×4.1mm，10μm)或等效柱，保护柱：PRP-X100 Grd。流动相A为超纯水，流动相B为pH＝8.0～8.9，25mM(NH

本实施例五种砷形态的色谱分离如图1所示，在12分钟内可将AsB、As

实施例2

为验证实施例1提供的方法的准确度和精密度，本实施例进行了该方法的加标回收率和重复性实验，并使用国家标准物质GBW09115验证其中的亚砷酸根(As

试验方法：分别在0.5、5、50μg/L的加标水平下，取人工尿液加入低、中、高水平的五种砷形态标液，按实施例1提供的检测方法测定砷形态加标回收率和重复性，以及验证GBW09115中As

表1.砷形态物质的属性、保留时间及回收率

同时，在空白尿液中加入2，10，20μg/L的总砷标准溶液，按照实施例1提供的检测方法测定总砷回收率，回收率在99.5～113％。

实施例3

按实施例1提供的方法，将100例来自有色金属冶炼职业暴露个体的尿样进行分析，预设0.032mg/L为警戒线，结果如图2所示。将五种砷形态物质的加和(ΣAs)与总砷(tAs)对比，均值分别为110±122vs 112±127μg/L，说明分析尿样中AsB，As

此外，在这100例样品中，有77例样本总砷超过预设的警戒线，其中，AsB的浓度范围在0～82.9μg/L，算术平均值为3.76±10.4μg/L，中位数0.817μg/L，说明每例样本中AsB的含量差异大；对人体造成危害的砷形态主要有As

实施例4

为验证实施例1提供的方法适用不同暴露人群范围，将设定高、中、低暴露组(分别为金属冶炼职业暴露于砷的人群、暴露点周边居民人群和对照人群)，随机选取各组40例尿样，将每10例混合而成1例混合样，进行分析。结果如图3所示，可以发现在三组样品中，AsB都占据总砷的一部分，尤其是在中暴露组，说明分离AsB和As

本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。