Cx43表达相关的生物分子、脓毒症治疗靶点及预后标志物

摘要

本发明实施例提供了一种与Cx43表达相关的生物分子、脓毒症治疗靶点及脓毒症预后标志物。其中，该生物分子包括：如SEQ ID No.1所示的序列；或者如SEQ ID No.1所示的序列中的至少一个碱基发生变异，与SEQ ID No.1所示的序列具有作用于相同靶分子的变异序列；或者包含如SEQ ID No.1所示的序列或者其变异序列的RNA片段。该生物分子与Cx43的表达相关，参与到脓毒症的分子调控机制之中，能够作为脓毒症治疗靶点或者脓毒症的预后标志物使用。

说明书

【技术领域】

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种与Cx43表达相关的生物分子、脓毒症治疗靶点及预后标志物。

【背景技术】

脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome,SIRS)。其可能由任何部位的感染引起，临床上常见于肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等。

脓毒症的病情凶险，病死率高。有调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。

近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30％～70％。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁

但脓毒症的根本发病机制目前尚未明确，可能涉及到复杂的全身炎症网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关。

因此，迫切需要提供合适的脓毒症相关靶点或者标志物，以便于改善脓毒症的诊疗效果。。

【发明内容】

本发明实施例提供一种与Cx43表达相关的生物分子、脓毒症治疗靶点及预后标志物，旨在解决现有技术中对脓毒症发病机制尚不明确的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：一种生物分子。

其中，该生物分子包括：

如SEQ ID No.1所示的序列；或者

如SEQ ID No.1所示的序列中的至少一个碱基发生变异，与SEQ ID No.1所示的序列具有作用于相同靶分子的变异序列；或者

包含如SEQ ID No.1所示的序列或者其变异序列的RNA片段。

可选地，所述靶分子为可翻译为Cx43蛋白的RNA片段。

可选地，所述生物分子包括miR-1-3p及其类似物。

可选地，如SEQ ID No.1所示的序列与所述靶分子的至少一部分区域特异性结合。

为解决上述技术问题，本发明实施例还提供以下技术方案：如上所述的生物分子在脓毒症预后标志物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明实施例还提供以下技术方案：如上所述的生物分子在制备脓毒症治疗药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明实施例还提供以下技术方案：一种脓毒症预后评价方法。该评价方法包括：

检测在干预前后，所述样品中外泌体的miR-1-3p或者Cx43的表达量；

在所述miR-1-3p的表达量下降或者Cx43的表达量上升时，确定对所述脓毒症的干预为积极影响。

可选地，通过荧光PCR的方式，检测所述样品中的miR-1-3p和/或Cx43的表达量。

为解决上述技术问题，本发明实施例还提供以下技术方案：一种脓毒症预后评价试剂盒。其中，所述试剂盒包括若干种试剂，用于检测样品中的miR-1-3p和/或Cx43的表达量。

为解决上述技术问题，本发明实施例还提供以下技术方案：一种脓毒症治疗试剂。其中，所述试剂被配置为：使如上所述的生物分子的表达量下降。

与现有技术相比较，本发明实施例提供了一种与Cx43表达相关的生物分子、脓毒症治疗靶点及预后标志物。其揭示了内涵高表达特定MicroRNA的外泌体在脓毒症的分子调控机制中可能发挥的作用，还进一步验证了与Cx43表达相关的生物分子作为脓毒症治疗靶点或者脓毒症标志物。该脓毒症预后标志物为后续进一步的探究和开发相关的脓毒症治疗干预方法提供了良好基础。

【附图说明】

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。

图1a为本发明实施例1提供的荧光定量PCR的检测结果示意图；

图1b为本发明实施例1提供的外泌体鉴定结果示意图；

图1c为本发明实施例1提供的双荧光素酶报告基因验证实验的示意图；

图2a为本发明实施例2提供的miR-1-3p的荧光定量PCR结果示意图；

图2b为本发明实施例2提供的Cx43的荧光定量PCR结果示意图；

图2c为本发明实施例2提供的TGFβR的荧光定量PCR结果示意图；

图2d为本发明实施例2提供的ELISA检测TGFβ的浓度结果示意图；

图2e为本发明实施例2提供的WB检测的结果示意图；

图2f为本发明实施例2提供的脓毒症小鼠模型的HE染色和免疫组化结果示意图；

图3a为本发明实施例3提供的HCT116细胞的荧光定量PCR结果示意图；

图3b为本发明实施例3提供的对照组和模型组的WB检测结果示意图；

图3c为本发明实施例3提供的加入了模拟物和抑制物的对照组和模型组的WB检测结果示意图；

图3d为本发明实施例3提供的ELISA检测细胞培养上清中TGFβ的浓度结果示意图；

图3e为本发明实施例3提供的ELISA检测细胞培养上清中TGFβ的吸光度值结果示意图；

图3f为本发明实施例3提供的CCK-8检测细胞增殖及细胞迁移法(transwell)检测细胞侵袭能力试验结果示意图；

图4为本发明实施例提供的miR-1-3p与Cx43的mRNA的结合区域示意图。

【具体实施方式】

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

此外，下面所描述的本发明不同实施例中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

UTR(untranslated Regions非翻译区域)是位于mRNA的非编码片段。其在mRNA的转运、翻译调节以及稳定性等方面发挥着重要的作用。

MicroRNA(又称微小RNA，miRNA)是一类具有20-22个核苷酸的非编码双链RNA分子，在转录或转录后水平调节基因的表达。其的分子调控机制原理主要是通过识别靶基因的非翻译区(3端UTR)并以完全或不完全的方式与互补序列结合，从而使得mRNA失去稳定性和抑制mRNA的翻译，从而在转录或转录后调控基因的表达。

外泌体(exosome)是从活细胞释放到细胞外微环境的50-150nm大小的囊泡。其纳米球膜型结构由双层脂质组成，包括各种类型的脂质和蛋白质，衍生自形成外泌体的亲代细胞。其是一个天然膜囊泡，用于将包裹在其中的蛋白质、RNA、DNA以及脂质等生物分子从一个细胞携带到另一个细胞，调节受体细胞的生物功能，在细胞间通信和触发生理反应中起到重要的作用。

在本申请的序列表中提供了如下的三条序列，其中：

SEQ ID No.1是人的miR-1-3p的RNA序列；

SEQ ID No.2是野生型Cx43的mRNA的UTR区域的RNA序列；

SEQ ID No.3是突变型Cx43的mRNA的UTR区域的RNA序列。

令人惊喜的发现，如图4所示，在SEQ ID No.1的一部分序列能够与SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3的3端部分序列之间具有相互结合的能力，提示SEQ ID No.1与蛋白质Cx43的表达相关，可能参与到脓毒症的生理病理机制之中。

当然，基于以上令人惊喜的发现，本领域技术人员还可以理解其他具有与SEQ IDNo.1相类似结构的变异序列(包括但不限于点突变、碱基替换)，同样也可能具有与SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3的至少一部分区域相结合的能力，与蛋白质Cx43的表达相关。

在另一些实施例中，SEQ ID No.1还可以耦合到或者联结到其他的序列中，在不影响其与SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3之间的结合效果时，达到与SEQ ID No.1相当或者接近的技术效果。

以下以SEQ ID No.1(即miR-1-3p)为例，详细描述其与脓毒症的分子调控机制之间的关系。

实施例1：

图1a为本发明实施例提供的荧光定量PCR的检测结果示意图。图1b为外泌体鉴定结果示意图。图1c为双荧光素酶报告基因的验证实验结果示意图。

在本实施例中，将合适数量的健康人(17人)和脓毒症患者(51人)分别划入对照组和实验组。然后提取实验组和对照组的外周血中的外泌体。最后，使用荧光定量PCR的方法，对实验组和对照组的miR-1-3p表达量进行定量检测。如图1a所示，相对于对照组的健康人群而言，实验组(即脓毒症患者)外周血中外泌体内的miR-1-3p的表达量显著上升(p值为0.037)。

如图1b所示，通过WB检测(westernblot)的方法，检测肠癌上皮细胞HCT116培养上清(图中标记为HCT116)与脓毒症患者外周血(图中标记为serum)中的外泌体的外泌体表面标志物表达情况，对外泌体进行鉴定。

另外，使用双荧光素没报告基因的方法，对miR-1-3p与Cx43的mRNA之间的结合情况进行验证。实验一共设置有三组，其中一组为对照组(图中示为control)，另一组为miR-1-3p与SEQ ID No.2(图中示为wt)，最后一组为miR-1-3p与SEQ ID No.3(图中示为mut)。

如图1c所示，wt组的荧光量变化具有显著差异，而对照组和mut组的荧光量变化不明显，显示miR-1-3p能够与SEQ ID No.2相互结合。

实施例2：

为进一步验证Cx43以及miR-1-3p与脓毒症之间的关联，本发明实施例还提供了基于脓毒症小鼠模型的验证实验。其中，图2a是本发明实施例提供的miR-1-3p的荧光定量PCR结果、图2b是本发明实施例提供的Cx43的荧光定量PCR结果、图2c是本发明实施例提供的TGFβR的荧光定量PCR结果、图2d是本发明实施例提供的TGFβ的浓度示意图、图2e是本发明实施例提供的WB检测的结果示意图、图2f是本发明实施例提供的脓毒症小鼠模型的HE染色和免疫组化结果示意图。

在本实施例中，通过盲肠结扎穿刺法(cecum ligation and puncture,CLP)构建脓毒症小鼠模型，分别设置治疗组、假手术组和模型组进行实验。

其中，治疗组使用鱼油治疗，图中以“CLP+fishoil”表示。假手术组是没有真正施行CLP手术的小鼠，图中以“sham”表示。模型组是加入PBS缓冲溶剂的对照组，图中以“CLP+PBS”表示。

如图2a至2c所示，与假手术组相比较，模型组中miR-1-3p的表达明显升高，而Cx43及TGFβR的表达则明显降低。但在经过了鱼油治疗后，治疗组的miR-1-3p表达显著降低，而Cx43及TGFβR的表达则有所上升。

如图2d的ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附分析法)结果所示，相对于假手术组而言，TGFβ的含量在模型组中显著降低。在经过鱼油治疗后的治疗组中则有所回升。

如图2e所示，通过提取小鼠小肠组织中蛋白并进行WB检测的结果显示：模型组中的CX43、TGFβR、p-SMAD2及p-SMAD3表达相对于假手术组显著降低。而在经过鱼油治疗后的治疗组中，CX43、TGFβR、p-SMAD2及p-SMAD3表达都有一定程度的恢复，表明了鱼油治疗对脓毒症炎症抑制、缓解以及在小肠上皮修复等方面的作用。

另外，取各组小鼠的小肠通过福尔马林固定并进行石蜡包埋切片染色。如图2f的HE染色(hematoxylin-eosin staining，苏木精—伊红染色法)结果所示，模型组中小肠上皮及粘膜层严重受损，细胞界限模糊，可见炎症细胞大量浸润，而鱼油治疗后的治疗组中，小鼠的小肠上皮完整性得到部分修复。

请继续参阅图2f所示的免疫组化结果。在模型组中，CX43、TGFβR、p-SMAD2及p-SMAD3表达显著降低。经过鱼油治疗后的治疗组中，CX43、TGFβR、p-SMAD2及p-SMAD3表达都有一定程度的恢复。

另外，在本申请实施例中还引入在先公开的文献You-Lian Chen1,Yin-JingXie2,Zhen-Mi Liu1,Wei-Bu Chen2,Ru Zhang3,Hong-Xing Ye1,Wei Wang4,Xue-Yan Liu1and Huai-Sheng Chen,Omega-3fatty acids impair miR-1-3p-dependent Notch3 down-regulation and alleviate sepsis-induced intestinal injury,Molecular Medicine,(2022)28:9。在该文献中提供了Omega-3脂肪酸所致的miR-1-3p表达量变化，进而使Notch-3基因表达下调而对肠损伤的积极治疗效果的实验证据。在该文献的基础上，申请人进一步创造性的发现了外泌体中的miR-1-3p的其他作用靶点(即Cx43)，能够进一步的验证miR-1-3p表达量变化与脓毒症治疗之间的相关性。

实施例3：

为进一步验证Cx43以及miR-1-3p与脓毒症之间的关联，本发明实施例还提供了基于HCT116细胞构建的脓毒症模型的验证实验。其中，图3a为本发明实施例提供的HCT116细胞的荧光定量PCR结果，图3b和3c为本发明实施例提供的HCT116细胞的WB检测结果示意图，图3d和3e为本发明实施例提供的细胞培养上清中TGFβ表达的ELISA检测结果示意图，图3f为本发明实施例提供的CCK-8检测细胞增殖及细胞迁移法(transwell)检测细胞侵袭能力试验结果示意图。

在本实施例中，通过向HCT116细胞添加LPS(Lipopolysaccharide，脂多糖)的方式，模拟脓毒症细胞模型。

如图3a所示，在图中将添加了LPS后模拟脓毒症细胞模型的模型组标记为“LPS”，并且将添加了等量PBS的对照组标记为“PBS”。图3a之中，对照组(PBS)及模型组(LPS)细胞上清外泌体中miR-1-3p基因表达的荧光定量PCR结果显示：相对于对照组而言，模型组中miR-1-3p的表达明显升高。

如图3b的对照组(PBS)及模型组(LPS)细胞上清外泌体中Cx43、TGFβR、p-SMAD2及p-SMAD3的蛋白表达的WB检测结果显示，相对于对照组而言，模型组中的Cx43、TGFβR、p-SMAD2及p-SMAD3表达则明显降低。

进一步地，还可以设计并合成针对miR-1-3p的模拟物和抑制剂，分别转入对照组和模型组的HCT116细胞中，用于上调和下调miR-1-3p的表达。具体的，可以在对照组中通过转入上述模拟物(mimics)以上调外泌体中miR-1-3p的表达，并且在模型组中转入抑制剂(inhibitor)干扰外泌体中miR-1-3p的表达。

如图3c所示，在图中将转入了模拟物的对照组组标记为“mimics+imRNA+PBS”，没有转入模拟物的模型组标记为“NC+imRNA+PBS”，并且将转入了抑制剂的模型组标记为“inhibitor+imRNA+LPS”，没有转入抑制物的模型组标记为“NC+imRNA+LPS”。

图3c中，对Cx43，TGFβR，p-SMAD2及p-SMAD3的蛋白表达的WB检测结果显示，上调外泌体中miR-1-3p的表达可以显著抑制CX43，TGFβR，p-SMAD2及p-SMAD3的表达，而干预外泌体中miR-1-3p的表达则可以部分恢复LPS对Cx43，TGFβR，p-SMAD2及p-SMAD3的表达抑制效应。

如图3e的ELISA检测的吸光度值和图3d的TGFβ含量所示，上调外泌体中miR-1-3p的表达可以显著抑制TGFβ的表达，而干预外泌体中miR-1-3p的表达则可以部分恢复LPS对TGFβ的表达抑制效应。

图3f中的CCK-8检测细胞增殖及细胞迁移法(transwell)检测细胞侵袭能力试验结果也显示了相同的结果。

综上，本发明实施例通过以上的一个或者多个实施例的相关实验研究，验证和说明了外泌体中miR-1-3p在正常情况和脓毒症患者之间的表达差异，并进一步的探究了miR-1-3p与Cx43之间的关联。

结果显示，外泌体中miR-1-3p与脓毒症之间具有较强的负相关关系。例如，在健康人的外泌体样品中，其miR-1-3p的表达量显著低于脓毒症患者的miR-1-3p的表达量。其可能由于miR-1-3p与翻译Cx43连接蛋白的mRNA之间的特异性结合而导致的。

基于以上令人惊喜的发现，一方面，miR-1-3p或者其他具有类似效果的生物分子还可以作为脓毒症的治疗靶点，用以制作治疗脓毒症的药物。

例如，可以针对miR-1-3p的分子结构，设计能够特异性降低miR-1-3p表达量的拮抗试剂或者其他的生物分子，并将其应用为脓毒症治疗药物。

具体而言，可以通过注射给药等合适的给药方式，向脓毒症患者体内输入包含能够特异性降低miR-1-3p表达量的生物分子的拮抗试剂。由此，降低脓毒症患者的外泌体中的miR-1-3p的表达量，从而达到治疗脓毒症的效果。

在另一些实施例中，也可以将Cx43作为治疗靶点，针对性的设计相应的特异性生物分子或者药物来达到与miR-1-3相类似的效果。

另一方面miR-1-3p或者其他具有类似效果的生物分子可以作为一种很好的脓毒症预后标志物，用以帮助客观的评估对脓毒症患者的干预方案。

例如，可以在对脓毒症患者施加干预(如特定的治疗方案)前，通过荧光定量PCR等的方式，对患者的miR-1-3p的表达量进行检测。

然后，在对脓毒症患者施加干预(如特定的治疗方案)后，重新对患者的miR-1-3p的表达量进行检测，根据miR-1-3p的表达量来评价施加的干预是否有效。

具体而言，若患者的miR-1-3p的表达量在干预后下降，表明这项干预对于脓毒症是有效的，存在正面积极的影响。若患者的miR-1-3p的表达量在干预后没有显著的变化，则说明这项干预对于脓毒症而言，很有可能是无效或者是消极的影响。当然，本领域技术人员基于本申请公开的内容，还可以进行一定的调整或者变化，从而得到更多不同的实施例。例如，考虑到miR-1-3p与翻译野生型Cx34的mRNA之间相互结合的关系，直接检测样品中的Cx43的mRNA也是可行的选择。

在另一些实施例中，也可以直接通过WB检测或者ELISA检测的方式，直接检测样品中的Cx43的表达量来达到类似的效果。

基于本申请实施例提供的脓毒症预后标志物和治疗靶点，本申请还进一步提供了一种用于评价脓毒症预后的试剂盒和一种用于治疗脓毒症的试剂。

其中，该用于评价脓毒症预后的试剂盒中可以包含有一种或者多种试剂和/或相关的实验耗材(如离心管等)，以帮助使用者快速的完成预后标志物的含量检测中的一个或者多个步骤。

具体的，该试剂盒中包含的具体试剂种类可以根据实际情况需要检测的脓毒症预后标志物所确定。对不同类型的脓毒症预后标志物可能需要采用不同类型的试剂盒。例如，基于ELISA的定量检测试剂盒、基于荧光PCR的定量检测试剂盒等。

该用于治疗脓毒症的试剂可以包含一种或者多种生物分子和/或相关试剂，以使进入到人体或者患者的试剂能够令其外泌体中的miR-1-3p的表达量下降。

具体的，该试剂具体包含的试剂种类或者生物分子可以根据实际情况的需要(如给药途径，生物分子物理化学特性)所确定。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>

<120> 与Cx43表达相关的生物分子、脓毒症治疗靶点及预后标志物

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

uauguaugaa gaaauguaag gu 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

uaagucccug cuaaaacauu cca 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

uaagucccug cuaaaagcca aga 23