一种厌氧-好氧微生物协同矿化土壤中四溴双酚A的方法

摘要

本发明公开了一种厌氧‑好氧微生物协同矿化土壤中四溴双酚A的方法，该方法通过先接种四溴双酚A厌氧还原脱卤富集菌液以实现四溴双酚A还原脱卤至双酚A，然后再接种双酚A好氧降解微生物以实现双酚A的降解，通过监测溴离子和双酚A浓度评估四溴双酚A厌氧脱卤及双酚A好氧降解效果，通过两种菌株(群)的协同作用，最终实现四溴双酚A的高效无毒矿化。

说明书

技术领域

本发明涉及土壤及地下水污染修复领域，特别是一种厌氧-好氧微生物协同矿化土壤中溴代阻燃剂四溴双酚A的方法。

背景技术

双酚A(BPA)是一种由人工合成的化学物质，主要用于制造聚碳酸酯(75％)、环氧树脂(29％)聚砜树脂、不饱和聚酯树脂，以用于增塑剂、阻燃剂、热稳定剂、橡胶防老剂、农药以及涂料等多种高分子材料的生产。自60年代以来，BPA 就开始被广泛用于制造塑料瓶、塑料奶瓶、婴幼儿使用的吸口杯以及食品和奶粉以及一些饮料罐内侧的涂层。目前，广泛应用于工业塑料、PVC管、热敏纸以及牙科复合材料以及密封剂等材料的生产(Howdeshell KL,Hotchkiss A K,Thayer K A,et al.Environmental toxins-Exposure to bisphenol Aadvances puberty [J].Nature,1999,401(6755):763-4.)。当人体长久暴露于BPA环境中时，会导致人体产生多种疾病，包括生殖障碍、乳腺癌、前列腺癌、神经神经内分泌疾病、心血管疾病、代谢紊乱以及肥胖等症状(Rochester J R.Bisphenol A and human health:Areview of the literature[J].Reproductive Toxicology, 2013,42:132-55)。Milla等人在热敏纸工业工人的尿液样本中发现了高浓度的BPA，浓度在1000-1500μg/L之间。此外，研究发现液体油漆硬化剂工人的尿液中BPA的含量在100-170μg/L范围内，处于较高水平(HEINALA M, YLINEN K,TUOMI T,Et Al.Assessment of Occupational Exposure toBisphenol A in Five Different Production Companies in Finland[J].Annals ofWork Exposures and Health,2017,61(1):44-55)。这说明BPA可以通过皮肤接触进入人体。此外，BPA浓度的增加会对男性生殖器官产生影响，降低精子的活力和数量(Manfo F PT,Jubendradass R,Nantia E A,et al.Adverse Effects of Bisphenol A on MaleReproductive Function[M]//WHITACRE D M.Reviews of Environmental Contaminationand Toxicology,Vol 228.2014:57-82.)。据相关研究发现，妊娠期BPA暴露可导致儿童焦虑、抑郁、多动症等行为。因此，欧盟从2011年3月2日起，已禁止生产含化学物质BPA的婴儿奶瓶。

四溴双酚A(TBBPA)是全球使用量最大的溴代阻燃剂，占整个溴代阻燃剂市场的60％。TBBPA严重干扰人体内分泌系统、甲状腺激素分泌和神经行为功能 (Lyche,J.L.；Rosseland,C.；Berge,G.；Polder,A.,Human health risk associated with brominatedflame-retardants(BFRs).Environ.Int.2015, 74:170-180.)。2018年，TBBPA被国际癌症研究机构列为2A类“人类潜在致癌物”(IARC,2018.Some Industrial Chemicals:Tetrabromobisphenol A.List of IARC Monographs,vol.115. http://publications.iarc.fr/_publications/media/download/5407/6d629d6 018d1032e3f3f2d61581b5bacab5f5525.pdf IARC 2018)。

由于TBBPA的难降解性、生物毒性以及生物富集性，可随地球化学循环在环境中大量积累，因此目前已造成了较为严重的环境污染问题。Covaci等在全球各地的空气、灰尘、水体、土壤、沉积物以及污水和淤泥中均检测到了TBBPA，甚至有研究人员在北极也检测到了一定浓度的TBBPA，这表明TBBPA具有被远程运输或携带的稳定性(De Wit C A,HerzkeD,Vorkamp K.Brominated flame retardants in the Arctic environment-trends andnew candidates[J]. Science of the Total Environment,2010,408(15):2885-918.)。此外，由于TBBPA具有较高的辛醇/水分配系数(25℃、pH＝7时，logKow＝6.53)，因此它更易在土壤和土壤沉积物中富集。因此如何修复 TBBPA污染的水体、底泥和土壤已成为环境修复领域亟待解决的技术难题。

微生物修复技术具有成本低、扰动小、不存在二次污染等优点，近年来逐渐受到重视。TBBPA具有持久性、高疏水性和比水重等特点，易在河流或湖泊底泥、沉积物等深部厌氧区域富集。TBBPA密度比水大，多在深部厌氧环境富集，其在好氧条件下非常稳定，而在厌氧条件下可通过还原脱卤反应生成双酚A(BPA) (Zhang,C.；Li,Z.；Suzuki,D.；Ye,L.；Yoshida,N.；Katayama,A.,A humin-dependent Dehalobacter species is involved inreductive debromination of tetrabromobisphenol A.Chemosphere 2013,92(10):1343-1348.)但反应率低，反应条件苛刻。BPA密度比水小，在水中溶解度大，在厌氧条件下非常稳定。现有TBBPA污染的微生物修复研究仅停滞于TBBPA厌氧还原脱卤至BPA的过程，并没有进一步降解BPA。因此，提供一种完全降解TBBPA 至无害方法，已成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种厌氧-好氧微生物协同矿化土壤中四溴双酚 A的方法。

为实验上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种厌氧-好氧微生物协同矿化土壤中四溴双酚A的方法包括以下步骤：

(1)扩大培养含有Dehalobacter菌株的四溴双酚A(TBBPA)厌氧还原脱卤富集液(或厌氧培养基)，至其中菌株Dehalobacter的浓度为2.4×10

富集培养双酚A(BPA)好氧降解纯菌Sphingomonas sp.TTNP3(常规菌株，如文献“Kolvenbach B,Schlaich N,Raoui Z,et al.Degradation pathway of bisphenol A:does ipso substitution apply to phenols containing a quaternary alpha-carbonstructure in the para position？Appl Environ Microbiol.2007；73(15):4776-4784.doi:10.1128/AEM.00329-07”)所公开。定期监测BPA和溴离子浓度，维持菌液活性。

上述TBBPA和BPA使用高效液相色谱法测定其浓度，测定条件如表1所示：

表1 BPA液相色谱检测方法

溴离子采用离子色谱法检测其浓度，测定条件如下表2所示。

表2离子色谱检测条件

(2)将步骤(1)获得的四溴双酚A厌氧还原脱卤富集液，用蠕动泵以0.2 mL/min速度注入四溴双酚A污染的砂土混合柱(约204g沙土，TBBPA含量约为 4μmol),并注入0.4mmol的乳酸钠作为脱卤呼吸菌电子供体和碳源，静置培养；两周后，向砂土混合柱中注入厌氧培养基，注入量约为100mL，并收集出流液，测量出流液里溴离子浓度。

上述厌氧还原脱卤富集液中，脱卤菌Dehalobacter的数量优选不小于10

厌氧培养基配方详见文献“Edwards,E.A.；Grbic-Galic,D.Anaerobicdegradation of toluene and o-xylene by a methanogenic consortium.Appl.Environ.Microbiol.1994,60(1),313-322”所公开内容。

本步骤加入的乳酸钠可以提高后续步骤Sphingomonas sp.TTNP3降解BPA 的效率。

(3)计算产生的溴离子总摩尔数，将溴离子总摩尔数除以4再除以四溴双酚A 污染物总摩尔数，获得四溴双酚A厌氧还原脱卤率。如果四溴双酚A厌氧还原脱卤率小于80％，重复步骤(2)直至脱卤率大于80％，确定TBBPA被有效的降解至 BPA。

四溴双酚A厌氧还原脱卤步骤如下所示，

反应方程式为TBBPA+4H

(4)满足步骤(3)基础上，向砂土混合柱中注入步骤(1)中获得的双酚A好氧降解菌Sphingomonas sp.TTNP3菌液(OD

好氧无机盐培养基配方参见文献“赵晓晴.椰壳生物炭固定化TTNP3对水环境中双酚类化合物的去除[D]；南京大学,2018.”所公开的内容。

本申请利用TBBPA容易被厌氧微生物物还原脱卤生成BPA，但不容易被好氧微生物降解转化以及BPA容易被好氧微生物降解不容易被厌氧微生物降解的特点，结合TBBPA厌氧还原脱卤菌和BPA好氧降解菌，实现TBBPA的厌氧还原脱卤至BPA，以及BPA好氧降解至无毒产物，最终完成溴代阻燃剂TBBPA的微生物矿化。

附图说明

图1为实施例厌氧反应装置结构示意图；

图2为实施例好氧反应装置结构示意图；

其中，1-进水管；2-出水管；3-注射泵；4-聚四氟乙烯柱；5-部分收集器；6- 磁力搅拌器；7-菌液/培养基；8-蠕动泵。

具体实施方式

以下通过具体实施例，对本申请技术方案进一步进行说明。

实施例1

本实施例选取TBBPA污染的砂土混合物(实验室自配)，将其混合均匀，然后装到图1所示的聚四氟乙烯柱中(柱长18cm，直径3cm)装填的砂质量为170g，富含腐殖质的东北黑土质量34g，土质量为如图2所示。聚四氟乙烯柱的设计为常规装置，如文献“Yanfeng Shi,Yuanyuan Sun,Bin Gao,Hongxia Xu,Xiaoqing Shi,Jichun Wu.Retention andTransport of Bisphenol A and Bisphenol S in Saturated Limestone Porous Media,Water air and soil pollution,2018, 229(8),260”所公开。聚四氟乙烯柱中TBBPA初始含量为3.68μmol，检测方法同上表1。

1)首先向砂柱中注入约100mL的TBBPA厌氧还原脱卤富集液，该菌液富集方法参考文献“Zhang,C.F.；Li,Z.L.；Suzuki,D.；Ye,L.Z.；Yoshida, N.；Katayama,A.,A humin-dependent Dehalobacter species is involved in reductive debromination oftetrabromobisphenol A.Chemosphere 2013,92, (10),1343-1348。”

TBBPA厌氧还原脱卤富集液制备方法如下：从某电子垃圾堆埋场附近的河流底泥中采集沉积物样品，在厌氧条件下，将底泥与蒸馏水以1:10(质量比)充分混合后过100目不锈钢网去除大颗粒，最后将泥水混合物转移至120mL血清瓶中，用氮气曝气15min以去除残留的氧气，并补充厌氧培养基，再加入终浓度为10mg/L的TBBPA和112mg/L的乳酸钠，分别作为厌氧还原脱卤呼吸菌的电子受体和电子供体(碳源)，菌液置于厌氧手套箱内，在避光、静置、室温条件下培养。定期取样检测TBBPA厌氧还原脱卤产物BPA和溴离子的浓度变化，取DNA检测TBBPA厌氧脱卤呼吸菌Dehalobacter的生长情况。富集液在投喂TBBPA 2-3个周期后，就以10％(体积)的接种量接种至新鲜厌氧培养基中进行稀释传代培养。

本实施例中使用的TBBPA厌氧还原脱卤富集液中TBBPA专性脱卤呼吸菌的Dehalobacter的初始浓度为2.4×10

在具体实施中，也可以使用Dehalobacter菌液(利用厌氧培养基培养)加入沙土中进行脱卤还原反应。

1L厌氧培养基中含有10mL磷酸盐缓冲液(其中KH

溶剂为超纯水

本实施例检测监测到的溴离子约为12.38mol，占理论值的84％，由于部分样品收集管中的溴离子按分布趋势来讲含量较少，未能全部检测，因此，可以看出，厌氧实验柱中的TBBPA产生了良好的降解效果，本步骤厌氧反应实验装置及流程示意图如图1所示。

2)继续向砂土混合柱中注入双酚A好氧降解菌Sphingomonas sp.TTNP3 菌液约200mL(OD

Sphingomonas sp.TTNP3菌液制备步骤：将实验室保存的TTNP3菌种于100 mL LB液体培养基中，置于30℃、180rpm摇床中培养，待菌液的OD

1L好氧无机盐培养基配方中含有3mL MgSO

结果显示，出流液中几乎没有BPA残留；萃取剖出的砂土BPA含量为2.78mol，即BPA的好氧降解率达90％。

本实施例两步骤矿化四溴双酚A的效率如下表3所示：

表3：厌氧-好氧微生物协同矿化四溴双酚A

综上，通过先接种TBBPA厌氧还原脱卤菌液，实现TBBPA脱卤至BPA的过程，再接种BPA好氧降解菌，实现BPA的好氧降解，最终达到厌氧-好氧微生物协同矿化TBBPA的目的。